高麗 張麗霞 張杰

紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)(OFT)可以評價(jià)紅細(xì)胞在低滲氯化鈉溶液中的耐受能力，是檢測患者紅細(xì)胞膜是否有缺陷的經(jīng)典方法。該方法簡便易操作，可作為臨床某些溶血性疾病，如遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、自身免疫性溶血性貧血和遺傳性橢圓形細(xì)胞增多癥等的初篩診斷［1］。

OFT為手工測定方法，判定其結(jié)果的溶血情況多采用目測觀察，檢測人員的主觀判斷和不同工作經(jīng)驗(yàn)人員的判讀都會(huì)導(dǎo)致人為因素的偏差，結(jié)果可能會(huì)影響臨床的診斷。另一方面，目測法僅能觀察到溶血的大致情況，不能量化評判紅細(xì)胞破裂的程度，缺乏客觀的依據(jù)。

本試驗(yàn)采用分光光度法測定紅細(xì)胞在低滲氯化鈉溶液中的溶血情況，制定紅細(xì)胞滲透脆性溶血曲線，量化了溶血程度，改良了OFT的結(jié)果判斷方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集20例健康對照者肝素鋰抗凝靜脈血5 ml，年齡28～56歲，平均(42±8.17)歲，男女各10例;8例缺鐵性貧血患者肝素鋰抗凝靜脈血5 ml，年齡22～58歲，平均(40.75±12.36)歲，男女各4例;8例球形紅細(xì)胞增多患者肝素鋰抗凝靜脈血5 ml，年齡26～60歲，平均(42.25±12.42)歲，男女各4例。實(shí)驗(yàn)室自配0.17 mol/L氯化鈉(NaCl)溶液，721分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法 參照第3版操作規(guī)程將0.17 mol/L NaCl溶液對半稀釋為0.085 mol/L標(biāo)準(zhǔn)品，與蒸餾水按比例配成12管不同濃度 NaCl溶液［2］，見表1。用滴管吸取肝素抗凝血，每管內(nèi)滴加1滴全血，以旋轉(zhuǎn)法輕輕混勻。12支小試管加完樣后，500 r/min離心10 min，小心取出試管，輕輕吸取上層液體，置721分光光度計(jì)，讀取 A540nm吸光度值［3］。以12號試管為100%溶血對照管，按照公式:溶血率(%)=待測管A540nm/溶血對照管A540nm×100%，計(jì)算出其余11管的不同溶血率。正常對照和待測患者的樣本均按上述步驟進(jìn)行檢測，并分別計(jì)算出溶血率。

2 結(jié)果

2.1 正常對照組溶血率參考區(qū)域的建立 20例健康對照組，按操作步驟，每管NaCl濃度下可得20個(gè)溶血率。匯總后統(tǒng)計(jì)出每管濃度下的5%和95%分位數(shù)的溶血率值，建立并繪制出正常對照溶血率參考區(qū)域(圖1)，灰色區(qū)域即為正常參考值區(qū)域，分布形態(tài)類似倒S型，有2個(gè)溶血率緩慢變化區(qū)段(0.28%～0.36%和0.44% ～0.50%)和1個(gè)急速變化區(qū)段(0.36% ～0.44%)。

2.2 室內(nèi)質(zhì)控溶血率曲線 每批檢測內(nèi)再以當(dāng)日選定的健康對照組作為室內(nèi)質(zhì)控，按操作步驟，計(jì)算出每管溶血率，繪制室內(nèi)質(zhì)控曲線(圖2)，健康對照者的溶血率曲線分布在正常參考區(qū)域內(nèi)(圖中灰色區(qū)域)。

表1 不同濃度梯度的NaCl溶液

2.3 待測樣本的溶血率曲線 缺鐵性貧血和球形紅細(xì)胞增多癥患者的樣本，以正常對照12號試管為100%溶血管對照，計(jì)算相應(yīng)待測樣本的溶血率，繪制出待測患者溶血率曲線(圖2)，圖2中所示1例缺鐵性貧血患者的溶血率曲線分布在正常參考區(qū)域下方，1例球形紅細(xì)胞增多患者的溶血率曲線分布在正常參考區(qū)域上方。

圖1 正常對照溶血率參考區(qū)域

圖2 缺鐵性貧血、球形紅細(xì)胞增多癥及室內(nèi)質(zhì)控溶血率曲線

2.4 結(jié)果判斷

2.4.1 室內(nèi)質(zhì)控溶血率曲線分布于正常對照溶血率參考區(qū)域內(nèi)，則本次試驗(yàn)結(jié)果可信。

2.4.2 患者紅細(xì)胞滲透脆性溶血率曲線分布于正常對照溶血率參考區(qū)域內(nèi)，則判定為紅細(xì)胞滲透脆性正常;分布于正常對照溶血率參考區(qū)域下方，則判定為紅細(xì)胞滲透脆性減低;分布于正常對照溶血率參考區(qū)域上方，則判定為紅細(xì)胞滲透脆性增加。

2.4.3 缺鐵性貧血的患者溶血率曲線分布于正常對照溶血率參考區(qū)域下方，紅細(xì)胞滲透脆性減低;球形紅細(xì)胞增多患者溶血率曲線分布于正常對照溶血率參考區(qū)域上方，紅細(xì)胞滲透脆性增加。

3 討論

3.1 傳統(tǒng)試驗(yàn)的不足 OFT是衡量紅細(xì)胞膜對低滲鹽溶液抵抗力大小的經(jīng)典試驗(yàn)，可用于有效篩查遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥及地中海貧血等疾病。正常紅細(xì)胞在一定濃度的低滲鹽溶液中，會(huì)發(fā)生破裂而釋放出血紅蛋白，經(jīng)過一定時(shí)間的靜置后，溶血現(xiàn)象就能在上清液被觀察到。因此，目測法是目前唯一結(jié)果判定方法。然而，從目測法判定完全溶血、不完全溶血和不溶血3種狀態(tài)，人員間比對相差較大，主觀性較強(qiáng)，需要長期試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的積累，試驗(yàn)的有效性和可控性不理想。

3.2 改良溶血率曲線的可行性 傳統(tǒng)OFT結(jié)果判讀時(shí)，目測待測樣本的開始溶血管和完全溶血管的NaCl濃度，再通過與正常對照樣本的比較，若濃度相差達(dá)0.04%，則再推斷患者的紅細(xì)胞滲透脆性是否增加或降低。利用溶血率曲線法配合正常參考區(qū)域，對缺鐵性貧血和球形紅細(xì)胞增多患者樣本的檢驗(yàn)結(jié)果，與其臨床診斷相符，也與傳統(tǒng)試驗(yàn)方法相一致，因此驗(yàn)證了該方法的可行性。通過待測樣本紅細(xì)胞滲透脆性溶血率曲線與正常對照溶血率參考區(qū)間范圍的位置關(guān)系，判定紅細(xì)胞滲透脆性的情況。紅細(xì)胞膜的脆性減低，則溶血率相對于對照就會(huì)降低，溶血率曲線就會(huì)整體下移，即會(huì)位于正常對照溶血率參考區(qū)域的下方;反之，則為紅細(xì)胞膜的脆性增高的情況。量化的溶血判斷，加上正常對照參考區(qū)域，使得OFT脫離了主觀目測法，客觀判定待測樣本的紅細(xì)胞滲透脆性，為該方法的臨床應(yīng)用提供了可靠的依據(jù)。

3.3 改良溶血率曲線法的優(yōu)點(diǎn) 利用分光光度法的改進(jìn)實(shí)驗(yàn)已有報(bào)道［4］，但僅限于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，尚無臨床應(yīng)用。另有報(bào)道也提出了溶血指數(shù)的概念［5］，但未對結(jié)果分析而且較為復(fù)雜。本文根據(jù)吸光度值計(jì)算出溶血率，再基于多次平行實(shí)驗(yàn)，采用95%可信區(qū)間的統(tǒng)計(jì)分析方法，構(gòu)建了正常對照溶血率參考區(qū)域，使得溶血結(jié)果的判斷有數(shù)可依，有據(jù)可循。正常參考區(qū)域的確立，使得待測樣本的結(jié)果判定更直觀。同時(shí)，基于實(shí)驗(yàn)室自建的參考區(qū)域，在批內(nèi)以正常對照樣本作為室內(nèi)質(zhì)控，提升了試驗(yàn)結(jié)果的可信性，也可作為不同批次試劑間的比對平臺(tái)，這對于解決手工類項(xiàng)目一貫缺乏有效質(zhì)控的問題，無疑提供了一個(gè)新思路。

［1］陳方平.臨床檢驗(yàn)血液學(xué)［M］.北京:高等教育出版社，2006:127.

［2］葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［M］.3版，南京:東南大學(xué)出版社，2007:168-169.

［3］阮萍，黃耀熊，李丹.新型快速顯微多道分光光度技術(shù)對血紅蛋白的光譜分析［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2005，25(7):1121-1124.

［4］黃艷紅，羅自強(qiáng)，秦曉群，等.利用改進(jìn)的紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)加強(qiáng)學(xué)生能力培養(yǎng)［J］.醫(yī)學(xué)教育探索，2009，8(10):1226-1227.

［5］袁明生，易旺云，黃文東.溶血指數(shù)測紅細(xì)胞滲透脆性的建立及在β-地中海貧血孕婦篩查中的應(yīng)用［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18(1):60，117.