郭揚(yáng)振，任敬霞，寧 君，梅向東，折冬梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植 物保護(hù)研究所，北京 100193）

隨著質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，同位素稀釋質(zhì)譜法（IDMS）越來(lái)越多的應(yīng)用于樣品檢測(cè)［1］。穩(wěn)定同位素標(biāo)記的化合物作為示蹤劑進(jìn)行檢測(cè)可避免由于食品復(fù)雜的基質(zhì)效應(yīng)、前處理和質(zhì)譜檢測(cè)器等因素對(duì)分析方法及測(cè)定結(jié)果的影響，有效校正方法中出現(xiàn)的誤差，顯著提高方法穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性，因此被國(guó)際物質(zhì)量咨詢委員會(huì)（CCQM）規(guī)定為微量、痕量和超痕量元素唯一權(quán)威測(cè)量方法［2］。

三聚氰胺（melamine）又稱氰尿酰胺，其含氮量高達(dá)66.7%。在乳制品中添加三聚氰胺，可提高含氮量，冒充成高蛋白食品，從而降低成本。近年來(lái)，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用碳-13［3］與氮-15［4］標(biāo)記三聚氰胺作為內(nèi)標(biāo)化合物結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)樣品中三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)，都取得了良好的檢測(cè)效果。與其他核素標(biāo)記化合物相比，氘標(biāo)記化合物具有合成步驟少、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)而間接降低檢測(cè)成本。然而，在合成三聚氰胺-d6的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺-d6在溶液中極易發(fā)生氫同位素交換，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)許多文獻(xiàn)也報(bào)道氘標(biāo)記化合物不適用于某些基質(zhì)檢測(cè)［5－7］。本文將通過(guò)化學(xué)理論層面，闡述該現(xiàn)象發(fā)生的原因并探討氘標(biāo)記化合物作為檢測(cè)內(nèi)標(biāo)化合物的必要條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Ther mo Nicolet 6700 FT-IR型紅外測(cè)定儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司，溴化鉀壓片；Br uker DPX 300 MHz型核磁共振儀：美國(guó)Bruker公 司，氘 代 DMSO 為 溶 劑；Br uker ApexⅣFT MS質(zhì)譜儀：美國(guó)Br uker公司；6890／5973GC-MS氣相色譜質(zhì)譜儀：美國(guó) Agilent公司。

1.2 主要材料與試劑

ND4OD：美國(guó) Sig ma-Aldrich公司（99 ato m%D），三聚氯氰：北京百靈威科技有限公司（純度＞99%）；1，4-二氧六環(huán)：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（純度＞99.5%）；重水：北京華威銳科化工有限公司（98 ato m%D）。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

三聚氰胺-d6的合成路線示于圖1。將3.12 mL氘代氨水（0.02 mol）于10 ℃左右加入0.61 g三聚氯氰（0.003 3 mol）與10 mL 1，4－二氧六環(huán)溶液中，密封反應(yīng)裝置，加熱至140℃，反應(yīng)4 h。待反應(yīng)液冷卻至室溫后有淡黃色沉淀物生成，過(guò)濾并用重水重結(jié)晶后烘干，計(jì)算產(chǎn)率（以ND4OD記）。

2 結(jié)果與討論

2.1 三聚氰胺-d 6 的合成

2.1.1 反應(yīng)原料對(duì)三聚氰胺收率的影響

先后使用氨氣與氨水對(duì)三聚氯氰進(jìn)行取代，因氨氣通入量不易控制，且產(chǎn)率偏低，故選擇使用氨水進(jìn)行反應(yīng)。

圖1 三聚氰胺-d 6的合成Fig.1 Synthesis of melamine-d 6

2.1.2 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)三聚氰胺收率的影響

根據(jù)文獻(xiàn)［8］報(bào)道，使用氨氣對(duì)三聚氯氰中的三個(gè)氯完全取代反應(yīng)溫度需高于80℃。根據(jù)已有合成方法［3，8］，分別選用乙腈、水、二氧六環(huán)作為反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)按1.3節(jié)進(jìn)行，結(jié)果表明，只有當(dāng)反應(yīng)介質(zhì)為二氧六環(huán)時(shí)，產(chǎn)物為三聚氰胺，另外兩種介質(zhì)主要產(chǎn)物都是6-氯-2，4-二氨基-1，3，5-三嗪。

2.1.3 三聚氰胺-d6的合成與表征

在上述合成工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，同時(shí)結(jié)合相關(guān)研究［3，8］，以氘代氨水為標(biāo)記前體，二氧六環(huán)為反應(yīng)溶劑，反應(yīng)溫度為140℃，反應(yīng)時(shí)間4 h，得到三聚氰胺-d6，產(chǎn)品收率為30%（以ND4OD記）

產(chǎn)物表征：13C NMR（DMSO-D6）：δ167.415（s，3C）；FT-IR （KBr）c m-1：2 589.86，2 550.43，2 507.91，2 336.71（υN—D），1 533.41，1 483.47（υC—N），1 449.63（υCN，三嗪環(huán)中碳氮雙鍵伸縮振動(dòng)），842.03，811.75，575.93，449.72。圖2和圖3是以氘代甲醇及甲醇分別作溶劑，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)三聚氰胺-d6樣品進(jìn)行檢測(cè)得到的質(zhì)譜圖?？梢钥闯觯跈z測(cè)過(guò)程中，三聚氰胺-d6會(huì)快速與溶劑及色譜柱中的活潑氫發(fā)生氫同位素交換。

2.2 同位素稀釋質(zhì)譜法（IDMS）中的應(yīng)用

使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)三聚氰胺-d6相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)因?yàn)榘l(fā)生氫同位素交換致使相對(duì)分子質(zhì)量難以測(cè)量，同時(shí)也導(dǎo)致其無(wú)法應(yīng)用于同位素稀釋質(zhì)譜法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。同位素交換是具有不同質(zhì)量數(shù)的同一元素不同原子間的交換，包括不同分子間的同一元素的同位素交換和復(fù)雜分子內(nèi)不同基團(tuán)間同一元素的同位素交換，屬于交換反應(yīng)中的一種特殊形式［8］。其中，氫同位素交換速率的快慢受到化合物與基質(zhì)兩方面影響。

圖2 三聚氰胺-d 6的質(zhì)譜圖（甲醇-d 4作溶劑）Fig.2 Mass spectr u m of melamine-d 6（methanol-d 4 as solvent）

交換速率與交換分子的電子殼層結(jié)構(gòu)有關(guān)。含有孤對(duì)電子元素的化合物易于進(jìn)行氫同位素交換；相反，對(duì)不含孤對(duì)電子元素（如C）的化合物則難以發(fā)生氫同位素間的交換［9］。

圖3 三聚氰胺-d 6的質(zhì)譜圖（甲醇作溶劑）Fig.3 Mass spectr um of melamine-d 6（methanol as solvent）

以三聚氰胺-d6和苯-d6為例，三聚氰胺中氮元素具有孤對(duì)電子，與氫離子發(fā)生Lewis酸堿中和反應(yīng)，顯然這種交換不需要克服很大的勢(shì)壘（見(jiàn)圖4）。而苯中的碳原子沒(méi)有孤對(duì)電子，交換的氘必須先從一個(gè)鍵上把氫分出來(lái)產(chǎn)生自由電子對(duì)，然后才能使交換完成。這必須要使C—D鍵斷裂，故需要克服很大的勢(shì)壘（見(jiàn)圖5）。因此，倘若有合適的催化劑或有使C—D鍵的鍵能減弱的取代基存在，都能使交換反應(yīng)活化能降低，從而使交換速度加快。因此，氘標(biāo)記化合物中，凡是存在N—D、O—D及S—D鍵的化合物，都不適用于作為內(nèi)標(biāo)化合物。

圖4 三聚氰胺-d 6的氫同位素交換機(jī)理Fig.4 Hydrogen isotope exchange mechanism of melamine-d 6

圖5 苯-d 6的氫同位素交換機(jī)理Fig.5 Hydrogen isotope exchange mechanism of benzene-d 6

圖6 解離機(jī)理Fig.6 Dissociation mechanism

C—H鍵中的氫同位素交換屬于慢交換。該類交換反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理可分為解離機(jī)理和締合機(jī)理。圖6簡(jiǎn)單演示了解離機(jī)理，其中RH表示有機(jī)化合物，DA表示其他含氘化合物，交換按a或b式進(jìn)行，如果RH比DA的酸性弱，交換按a式進(jìn)行；反之按b式進(jìn)行。在化合物中引入吸電子基團(tuán)以及采用堿性介質(zhì)可以顯著加快這一類型交換反應(yīng)的速度。有研究發(fā)現(xiàn)，中性溶液中甲苯與重水長(zhǎng)時(shí)間煮沸，不發(fā)生交換，有堿存在時(shí)，特別是在酒精溶液中，交換便顯著進(jìn)行，因?yàn)镃2H5O—比OH—為更強(qiáng)的堿。因此，若采用甲醇等堿性強(qiáng)的介質(zhì)作為提取溶劑，會(huì)加快氘標(biāo)記內(nèi)標(biāo)化合物的氫同位素交換。以苯與氘代濃硫酸交換為例形象解釋了締合機(jī)理（圖7），和解離機(jī)理相反，環(huán)中存在能增高C—H鍵附近電子云密度的取代基以及增加氘給予體酸度有利于配合物生成從而促進(jìn)交換［10］。

圖7 締合機(jī)理Fig.7 Associative mechanism

Chavez-Eng 等［5］用 GC-MS 和 HPLCMS-MS測(cè)定了［13CD3］Rof ecoxib在環(huán)己烷、乙腈和乙腈－水（50∶50）三種溶劑中［13CH3］Rofecoxib、［13CH2D］Rof ecoxib、［13CHD2］Rofecoxib及［13CD3］Rofecoxib的含量，結(jié)果表明Rofecoxib在這三種溶劑中的氫同位素交換速率由高到低依次為乙腈－水（50∶50）、乙腈、環(huán)己烷。而 Verplaetse［11］等對(duì)fentanyl-d5進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)卻并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同位素交換現(xiàn)象。原因可能是Rofecoxib在這三種溶劑中按照解離機(jī)理發(fā)生氫同位素交換，—CN為吸電子基團(tuán)，降低鄰碳的電子云密度，使得C—H鍵能降低，易于斷裂。而氧具有孤對(duì)電子，進(jìn)行氫同位素交換不需要克服很大勢(shì)壘，容易發(fā)生交換。因此Rofecoxib在乙腈－水（50∶50）及乙腈中較易發(fā)生同位素交換。而—SO2—與—CO—基團(tuán)相比具有更強(qiáng)的吸電子能力，因此［13CD3］Rofecoxib中C—D鍵鍵能較低，易發(fā)生氫同位素交換（電子轉(zhuǎn)移見(jiàn)圖8，其中箭頭表示轉(zhuǎn)移方向）。

圖8 ［13 CD3］Rofecoxib、fentanyl-d 5 及acetonitrile的電子轉(zhuǎn)移Fig.8 Electron transfer in［13 CD3］Rofecoxib，fentanyl-d 5 and acetonitrile

3 結(jié)論

由上可知，三聚氰胺-d6中氮原子含有孤對(duì)電子，在溶劑中易發(fā)生氫同位素交換，因此通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)難以準(zhǔn)確測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量，同時(shí)也導(dǎo)致其難以應(yīng)用于同位素稀釋質(zhì)譜法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

本研究以氘代氨水與三聚氯氰取代合成三聚氰胺-d6，合成方法簡(jiǎn)單且環(huán)保，可以考慮在日?；ず铣芍胁捎迷摵铣煞椒ǎ煌瑫r(shí)也從理論上闡述將氘標(biāo)記化合物應(yīng)用于穩(wěn)定同位素稀釋質(zhì)譜法時(shí)，需要首先對(duì)其同位素穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。因?yàn)镃—D鍵中的氫同位素交換屬于慢交換，所以氘標(biāo)記化合物不適合長(zhǎng)期保存。同時(shí)，合成氘標(biāo)記化合物需要慎重選擇在化合物中引入氘的位置，盡可能遠(yuǎn)離吸電子基團(tuán)，運(yùn)用計(jì)算化學(xué)的手段對(duì)引入位置的C—H鍵的牢固程度進(jìn)行評(píng)估是一個(gè)可行的辦法。

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