王乃紅宋麗新靳月琴李文利

（1山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院，山西運(yùn)城 044000；2大連理工大學(xué)生命與醫(yī)藥學(xué)院，遼寧盤錦 124211）

家蠶蛾吐出液溶繭酶的溶栓作用研究

王乃紅1宋麗新2靳月琴1李文利2

（1山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院，山西運(yùn)城 044000；2大連理工大學(xué)生命與醫(yī)藥學(xué)院，遼寧盤錦 124211）

利用CM?Sepharose Fast Flow弱陽離子交換層析從家蠶蛾吐出液中收集得到溶繭酶。通過精氨酸酯酶活力測(cè)定其酶活力為11.92 U／mg，利用纖維蛋白原降解試驗(yàn)和纖維蛋白平板試驗(yàn)初步驗(yàn)證其具有溶栓作用。小鼠腹部皮膚皮內(nèi)注射家蠶蛾吐出液溶繭酶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)每公斤體質(zhì)量注射的酶劑量為0.25 μg／μL時(shí)，開始出現(xiàn)溶血；在小鼠體內(nèi)溶栓試驗(yàn)中，每公斤小鼠體質(zhì)量注射家蠶蛾吐出液溶繭酶的劑量分別為0（對(duì)照）、100、200、300、400 μg時(shí)，48 h后小鼠尾部血栓比例呈逐漸減小的趨勢(shì)，去除率分別為（5.00±0.41）%、（16.67±0.21）%、（37.97± 0.74）%、（49.15±0.65）%、（74.67±0.62）%。

家蠶蛾；吐出液；溶繭酶；溶栓作用

血栓是導(dǎo)致世界各地心腦血管疾病患者發(fā)病率和死亡率較高的原因之一［1］。臨床應(yīng)用的藥物可分為抗栓藥物和溶栓藥物兩大類，其中抗血栓藥物又可分為抗凝血藥和抗血小板凝集藥。目前，可以直接降解纖維蛋白的藥物，如血纖維蛋白溶酶和蛇毒纖溶酶等越來越引起人們的關(guān)注，并試圖通過研究增加其溶栓療效和減少出血。Meiser等［2］從大椎蝽（Panstrongylus megistis）的下顎腺中分離得到一種具有纖溶活性的類胰蛋白酶［1］，這表明一些昆蟲的吐出液或許可以成為潛在的溶栓劑。

家蠶蛹羽化時(shí)蛾的吐出液能濕潤(rùn)繭層，溶解絲膠蛋白及部分絲素蛋白，使繭層松解，進(jìn)而有助于蠶蛾撥開繭絲鉆出蠶繭［3］。早在1966年，美國(guó)學(xué)者Fotis等［4］研究發(fā)現(xiàn)某些營(yíng)封閉繭的昆蟲，在成蟲階段分泌的吐出液中含有一種酶，這種酶的水解底物不只局限于絲膠，它是一種更具廣泛性的蛋白水解酶，因此將其命名為溶繭酶（Cocoonase）。目前，溶繭酶的應(yīng)用前景主要在繅絲工業(yè)中酶法脫膠、化妝品工業(yè)中酶法水解絲以及血栓治療藥物的開發(fā)［5］。雖然研究人員對(duì)多種溶繭酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究［4，6］，但是對(duì)家蠶溶繭酶的溶血栓作用尚未見報(bào)道。

本研究從家蠶蛾吐出液中分離得到了家蠶溶繭酶，并測(cè)定了其精氨酸酯酶活性；通過纖維蛋白降解、小鼠體內(nèi)溶栓等一系列試驗(yàn)證實(shí)，家蠶蛾吐出液中的溶繭酶具有溶栓功能，為新型溶栓藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

家蠶蛹，蠶品種為871×872，由山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院提供；SPF級(jí)健康雄性昆明種小鼠，由大連醫(yī)科大學(xué)提供；CM－Sepharose Fast Flow（SPFF），購(gòu)自GE公司；蛋白質(zhì)分子量（低）標(biāo)準(zhǔn)、N－苯?；璍－精氨酸乙酯（BAEE）、人纖維蛋白原、纖維蛋白、角叉菜膠、凝血酶，購(gòu)自Sigma公司；AKTA explorer，購(gòu)自美國(guó)Phamacia biotech公司；酶標(biāo)儀（英國(guó)），購(gòu)自Thermo scientific公司；紫外分光光度計(jì)（V－560），購(gòu)自日本JASCO公司；ECP3000蛋白電泳儀、電泳槽，購(gòu)自北京六一設(shè)備廠。

1.2 家蠶蛾吐出液溶繭酶的分離純化

參照參考文獻(xiàn)［7］的方法收集家蠶蛾吐出液，即將發(fā)育到后期的蠶蛹頭朝下置于用塑料膜卷成的三角錐內(nèi)，將三角錐倒立，插入1.5 mL離心管中，繼續(xù)在室溫培養(yǎng)；在蠶蛹羽化過程中收集家蠶蛾吐出液，置于－80℃貯存?zhèn)溆?。CM?Sepharose Fast Flow弱陽離子交換層析：將收集的家蠶蛾吐出液12 000 r／min離心，15 min后收集上清液，用50 mM NaAC?HAC（醋酸—醋酸鈉緩沖液）pH 5.8上樣緩沖液稀釋。先用雙蒸水清洗離子交換柱，流速為1.0 mL／min，然后用A溶液（NaAc 1.361 g，加入400 mL雙蒸水，用HAc調(diào)pH值至6.0，定容至500 mL；以下相同）平衡離子交換柱，待電導(dǎo)率持平時(shí)，將待純化樣品注入5.0 mL上樣環(huán)，開始進(jìn)樣，流速為0.5 mL／min。上樣完畢后，用A溶液再平衡離子交換柱，此過程中收集穿透峰流出液，待穿透峰和電導(dǎo)率再次持平后，用B溶液（NaAc 1.361 g、NaCl 29.250 g，加入400 mL雙蒸水，用HAc調(diào)節(jié)pH值至6.0，定容至500 mL；以下相同）進(jìn)行線性洗脫，濃度由0逐漸增大至50%，收集洗脫峰流出液，分別將穿透峰和洗脫峰進(jìn)行SDS?PAGE電泳，并測(cè)定其酰胺酶活性。

1.3 Lowry法蛋白定量

試驗(yàn)采用Lowry法［8］對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

1.3.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 （1）用蒸餾水將標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白配制成100 μg／mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，在96孔板上取11孔，按照表1平衡操作。（2）取24 μL A溶液和1.2 mL B溶液，混勻。各孔加入100 μL混合液，混勻，室溫靜置10 min。（3）各孔加入10 μL Folin－酚試劑，迅速混勻，室溫靜置30 min。（4）在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔吸光值（A750nm）。以各孔A750nm值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的蛋白濃度為橫坐標(biāo)，作圖。

表1 標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白配制表

1.3.2 家蠶蛾吐出液溶繭酶蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 根據(jù)1.3.1的方法，將家蠶蛾吐出液溶繭酶溶液用雙蒸水溶解稀釋10倍，測(cè)定純化后的家蠶蛾吐出液溶繭酶濃度，根據(jù)下式計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)濃度。

樣品蛋白質(zhì)濃度（μg／mL）＝樣品孔A750nm值的平均值對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度×樣品稀釋倍數(shù)

1.4 家蠶蛾吐出液溶繭酶中酰胺酶活力的測(cè)定

家蠶蛾吐出液溶繭酶中的酰胺酶活力的測(cè)定，采用合成底物苯甲酰－L－精氨酸乙酯鹽酸鹽（BAEE）法［9］。按1∶1比例加入BAEE底物溶液和50 mM Tris－HCl pH 8.0緩沖液，混勻后用作空白對(duì)照。取稀釋10倍的酶液200 μL，加入到2.8 mL 0.5 mM BAEE底物溶液中，混勻后在253 nm處測(cè)其吸光值。酶活力單位計(jì)算如下：以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，253 nm下的吸光值（A253nm）為縱坐標(biāo)作圖，在直線上任意2個(gè)時(shí)間點(diǎn)與相應(yīng)的光吸收值做差（△A253nm）。BAEE酶的活力定義為在25℃下，每分鐘內(nèi)酶作用于底物所產(chǎn)生的吸光度增加0.001為1個(gè)活力單位（U）。酶活力單位計(jì)算公式如下。

1.5 家蠶蛾吐出液溶繭酶對(duì)纖維蛋白原和纖維蛋白的降解

1.5.1對(duì)纖維蛋白原的降解 取500 μL 0.2%纖維蛋白原溶液于1.5 mL離心管，加入50 μL純化后的酶液，37℃溫育。分別在2、4、6、8、10、12、24 h從反應(yīng)體系中取出40 μL反應(yīng)液，加入10 μL 5×loading buffer（3.1 mL 1M Tris－HCl（pH6.8）＋65 mL 50%甘油＋0.5 mL 1%溴酚蘭＋1.4 mL水），煮沸8 min終止反應(yīng)。取未進(jìn)行反應(yīng)的纖維蛋白原溶液做對(duì)照與上述處理過的樣品分別進(jìn)行SDS?PAGE電泳，觀察反應(yīng)情況。

1.5.2 對(duì)纖維蛋白的降解 取5 mL 1%瓊脂糖凝膠煮化后冷卻，加入5 mL 0.4%人纖維蛋白原溶液混勻，再加入0.2 mL人凝血酶（100 U／mL）（0.1 mol／L HAC／NaAC，pH8.0）混勻，倒入一個(gè)10 cm Petri平皿中，室溫靜置1 h，打孔。加15 μL純化后的酶溶液于平板上，37℃孵育24 h，并觀察水解圈的大小。依據(jù)此法，觀測(cè)到的清晰透明區(qū)域，即為纖維蛋白被水解的區(qū)域［10］。根據(jù)溶解面積的大小來確定家蠶蛾吐出液溶繭酶的纖溶活性強(qiáng)弱。

1.6 金屬離子對(duì)纖維蛋白原降解的影響

取0.2%纖維蛋白原200 μL加入到7個(gè)1.5 mL的離心管中，分別加入純化后的酶液20 μL及各種終濃度為10 mM的金屬離子Cu2＋、Mg2＋、Ca2＋、K＋、Mn2＋、Zn2＋、Fe2＋，對(duì)照組中分別加入0.2%纖維蛋白原200 μL和純化后的酶液20 μL，37℃溫育。分別在4 h和24 h從反應(yīng)體系中取出50 μL反應(yīng)液，加入10 μL 5×loading buffer，煮沸8 min終止反應(yīng)。取上述處理過的樣品進(jìn)行SDS?PAGE電泳，與未進(jìn)行反應(yīng)的纖維蛋白原溶液對(duì)比，觀察反應(yīng)情況。

1.7 蛋白酶抑制劑對(duì)纖維蛋白原降解的影響

取0.2%纖維蛋白原200 μL和純化后的酶液20 μL，分別加入到7個(gè)1.5 mL的離心管中，依次加入終濃度為10 mM的DTT、EDTA、β－巰基乙醇、咪唑和1 mM、0.1 mM的苯甲基磺酰氟（PMSF），對(duì)照組中分別加入0.2%纖維蛋白原200 μL和純化后的酶液20 μL，37℃溫育。分別在4 h和24 h從反應(yīng)體系中取出50 μL反應(yīng)液，加入10 μL 5×loading buffer，煮沸8 min終止反應(yīng)。取上述處理過的樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳，與未進(jìn)行反應(yīng)的纖維蛋白原溶液對(duì)比，觀察反應(yīng)情況。

1.8 出血活性試驗(yàn)

根據(jù)Kondo等［11］的方法，分別將不同劑量的家蠶蛾吐出液溶繭酶（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50 μg／μL）通過皮內(nèi)注射的方法分別注入到小鼠（每公斤體質(zhì)量注射18～22 g）的腹部皮膚中，對(duì)照組則注射100 μL生理鹽水，2 h后，剝離小鼠背部皮膚，觀察是否存在出血點(diǎn)及出血點(diǎn)直徑的大小。

1.9 體內(nèi)溶栓試驗(yàn)

1.9.1 小鼠尾靜脈血栓模型的建立 在小鼠腰背部皮下注射0.2%角叉菜膠溶液100 μL／只，小鼠尾尖4～24 h期間出現(xiàn)暗紅色血栓形成區(qū)，逐漸向尾根部擴(kuò)大到一定范圍，48～72 h后，經(jīng)紫色變黑色，與正常尾部分界明顯。

1.9.2 給藥方法 將50只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組（n＝10）。給對(duì)照組注射生理鹽水100 μL，其余4組小鼠按每公斤體質(zhì)量分別注射400、300、200、100 μg家蠶蛾吐出液溶繭酶，72 h后測(cè)量血栓形成的長(zhǎng)度［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶蛾吐出液溶繭酶的分離純化

通過AKTA純化系統(tǒng)，利用CM－Sepharose Fast Flow弱陽離子交換層析分離純化家蠶蛾吐出液，NaCl濃度為0.3 M洗脫后發(fā)現(xiàn)單一洗脫峰，分別對(duì)洗脫峰和穿透峰進(jìn)行酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該洗脫峰的蛋白具有精氨酸酯酶活性，SDS－PAGE電泳檢測(cè)（圖1）分析，蛋白條帶為2條，經(jīng)分析家蠶蛾吐出液溶繭酶信號(hào)肽的分子量為3.6 kD，此峰中的2種蛋白可視為同種蛋白質(zhì)，冷凍干燥保存。

圖1 家蠶溶繭酶分離純化SDS－PAGE電泳結(jié)果

2.2 Lowry法蛋白定量

試驗(yàn)采用Lowry法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，在750 nm波長(zhǎng)下測(cè)定蛋白的吸光值，以A750nm值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。同時(shí)將待測(cè)樣品稀釋至一定倍數(shù)，使其吸光值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品蛋白濃度為745 μg／mL。

圖2 Lowry法蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 酰胺酶活力測(cè)定

圖3 BAEE酶活力測(cè)定曲線

2.4 家蠶蛾吐出液溶繭酶對(duì)纖維蛋白原及纖維蛋白的降解

圖4 家蠶蛾吐出液溶繭酶對(duì)纖維蛋白原（A）及纖維蛋白（B）的降解

將家蠶蛾吐出液溶繭酶與人纖維蛋白原混勻，37℃反應(yīng)條件下，分別在2、4、6、8、10、12、24 h從反應(yīng)體系中取出40 μL反應(yīng)液，加入10 μL 5×loading buffer煮沸后SDS－PAGE電泳分析（圖4）。纖維蛋白原的3條鏈，Aα?鏈的分子量為63.5 kD，Bβ?鏈的分子量為56.0 kD，γ?鏈的分子量為47.0 kD。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，纖維蛋白原的3條鏈逐漸被降解，其中優(yōu)先降解Aα?鏈和Bβ?鏈，而對(duì)γ?鏈的降解則較緩慢（圖4－A）。利用凝血酶的作用纖維蛋白原被降解成纖維蛋白，在平板內(nèi)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，家蠶溶繭酶平板明顯出現(xiàn)透明圈（圖4－B），說明家蠶蛾吐出液溶繭酶可以較好地降解纖維蛋白。

2.5 金屬離子對(duì)纖維蛋白原降解的影響

將各金屬離子（Cu2＋、Mg2＋、Ca2＋、K＋、Mn2＋、Zn2＋、Fe2＋）按照終濃度10 mM加入到家蠶蛾吐出液溶繭酶與纖維蛋白原混合液中，37℃水浴，分別在4 h和24 h取樣，SDS－PAGE電泳檢測(cè)此降解作用的影響實(shí)驗(yàn)（圖5－A、B）表明，Mg2＋、Ca2＋、K＋幾乎對(duì)酶的活性沒有影響，而這3種離子正是金屬蛋白酶活性所必需的；因此，可以證明家蠶蛾吐出液溶繭酶是非金屬蛋白酶。

圖5 金屬離子對(duì)家蠶蛾吐出液溶繭酶降解纖維蛋白原的影響

2.6 蛋白酶抑制劑對(duì)纖維蛋白原降解的影響

將PMSF、咪唑、EDTA、β－巰基乙醇、DTT等酶抑制劑分別與酶液混合，使抑制劑終濃度為10 mM，37℃水浴4 h后SDS－PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。從圖6可知PMSF在2個(gè)劑量下均對(duì)酶活性產(chǎn)生較大的影響，而PMSF是典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑；因此，家蠶蛾吐出液溶繭酶屬于絲氨酸蛋白酶家族；另外，金屬螯合劑EDTA對(duì)酶的活性也無太大的影響，更加說明溶繭酶不屬于金屬蛋白酶的范疇。2.7 小鼠腹部皮膚出血活性試驗(yàn)

圖6 抑制劑對(duì)家蠶溶繭酶降解纖維蛋白原的影響（4 h）

利用小鼠腹部皮膚皮內(nèi)注射的方法，每公斤體質(zhì)量注入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50 μg／μL不同劑量的家蠶蛾吐出液溶繭酶18～22 g，2 h后在注射點(diǎn)剝離周圍的皮膚觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠每公斤體質(zhì)量注射的酶劑量為0.25 μg／μL時(shí)，開始出現(xiàn)溶血，直徑約為5 mm，當(dāng)劑量升高至0.50 μg／μL時(shí)，溶血直徑達(dá)9 mm左右（圖7）。

圖7 小鼠腹部皮膚出血活性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 小鼠體內(nèi)溶栓試驗(yàn)

家蠶蛾吐出液溶繭酶在體內(nèi)的溶栓效果通過角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓模型來表征，給藥24 h和48 h后，不同劑量下小鼠尾部血栓長(zhǎng)度，占小鼠尾巴出現(xiàn)血栓長(zhǎng)度的比例均有明顯的降低，且隨著劑量的增大，溶栓率明顯增高；當(dāng)給小鼠每公斤體質(zhì)量注射家蠶蛾吐出液溶繭酶分別為400、300、200、100、0（對(duì)照）μg，給藥48 h后的結(jié)果顯示（圖8），給小鼠每公斤體質(zhì)量注射400 μg家蠶蛾吐出液溶繭酶時(shí)的溶栓效率最大，去除率為（74.67±0.62）%；當(dāng)給小鼠每公斤體質(zhì)量注射劑量為300、200、100 μg時(shí)，去除率分別為（49.15±0.65）%、（37.97±0.74）%和（16.67± 0.21）%，而對(duì)照組的去除率僅為（5.00±0.41）%。

圖8 角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠血栓模型體內(nèi)溶栓結(jié)果（x±s）

3 討論

對(duì)溶繭酶的研究多集中于20世紀(jì)60、70年代，包括對(duì)家蠶、印度柞蠶和多音天蠶等鱗翅目昆蟲溶繭酶的研究［13］。然而對(duì)這幾種昆蟲的溶繭酶作用的研究也多集中于酶學(xué)性質(zhì)的研究，如吐出器官的研究、精氨酸酯酶活力、絲氨酸或胰蛋白酶抑制劑對(duì)溶繭酶及其前體免疫沉淀反應(yīng)的影響等等，但對(duì)溶繭酶溶栓效果的研究較少。

本試驗(yàn)利用CM－Sepharose Fast Flow弱陽離子交換層析分離純化出家蠶蛾吐出液溶繭酶。這種酶具有精氨酸酯酶活力，屬于絲氨酸蛋白酶家族、且為非金屬酶；但Cu2＋、Fe2＋和Zn2＋對(duì)酶活性均有不同程度的抑制作用，其作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。該蛋白酶活性還可被半胱氨酸還原性變性劑DTT顯著抑制，推測(cè)可能是由于酶的二硫鍵遭到破壞，導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響其活性位點(diǎn)與底物的結(jié)合，最終使酶活力下降。家蠶蛾吐出液溶繭酶首先降解纖維蛋白原的Aα－鏈和纖維蛋白原的Bβ－鏈，然后才降解纖維蛋白原的γ－鏈，初步證明了家蠶蛾吐出液溶繭酶具有溶栓作用。通過在小鼠體內(nèi)的溶栓實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明了這種溶栓作用。在出血活性安全的范圍內(nèi)，通過角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓模型溶栓發(fā)現(xiàn)，當(dāng)注射劑量逐漸增大時(shí)，小鼠尾部血栓長(zhǎng)度占整個(gè)尾巴長(zhǎng)度的比例也逐漸降低，當(dāng)小鼠每公斤體質(zhì)量注射400 μg時(shí)，去除率為（74.67±0.62）%，說明家蠶蛾吐出液溶繭酶具有良好的溶栓效果。但是，其具體的作用機(jī)制尚不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究。

全球每年因腦血栓、腦梗塞、心肌梗塞、冠心病、動(dòng)脈硬化等心腦血管疾病奪走1 200萬人的生命，接近世界總死亡人數(shù)的1／4，成為人類健康的頭號(hào)大敵［14］。目前治療血栓的方法主要有外科手術(shù)法和藥物治療等，其中外科手術(shù)雖然可較快去除血栓，但危險(xiǎn)性較大，適用于一些危機(jī)或突發(fā)狀況；藥物治療則相對(duì)比較容易被人們所接受。目前治療血栓的藥物一般具有抗原性且半衰期短，使其應(yīng)用給人們帶來較大的風(fēng)險(xiǎn)。另外，蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物所產(chǎn)生的活性物質(zhì)，對(duì)人體的健康具有很大的作用，它具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、降血壓和降血脂等生理功能［6］。因此，家蠶蛾吐出液溶繭酶的水解產(chǎn)物所產(chǎn)生的活性物質(zhì)及其強(qiáng)烈的纖溶酶活力，在降血糖、降膽固醇及治療血栓等方面將會(huì)發(fā)揮很大作用。

［1］李圓.柞蠶溶繭酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)表征及其基因克隆與表達(dá)［D］.大連：大連理工大學(xué)，2013.

［2］Meiser C K，Piechura H，Meyer H E，etal.A salivary serine protease of the haematophagous reduviid Panstrongylus megistus：Sequence characterization，expression pattern and characterization of proteo?lytic activity［J］.nsect Molecular Biology，2010，19（3）：409－421.

［3］祝元鋒，王趙群，何寧佳，等.家蠶蛾吐出液的酶活性及蛋白質(zhì)種類鑒定［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2014，40（3）：452－457.

［4］Fotis C K，Alan M，Tartakoff，etal.Cocoonase iv.Preliminary char?acterization of a proteolytic enzyme from silkmoths［J］.Journal of Biological Chemistry，1967，242（7）：1 477－1 487.

［5］祝元鋒，馮麗春，李傲祥.蠶蛾溶繭酶的研究進(jìn)展［J］.蠶學(xué)通訊，2009，29（1）：27－32.

［6］范雨鎖，張永根.活性肽的生物學(xué)作用研究概況［J］.飼料博覽，2007，3（7）：25－28.

［7］王乃紅，宋麗新，靳月琴，等.家蠶溶繭酶收集方法的建立及活性測(cè)定［J］.北方蠶業(yè)，2013，34（3）：9－12.

［8］李紅兵，李宗讓，王志玲，等.微量Lorry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1993，20（5）：402－403.

［9］Blanco R M，Guisán G M.Protecting effect of competitive inhibitors during very intense insolubilized enzyme?activated support multipoint attachments：Trypsin（amine）?agarose（aldehyde）system［J］.Enzyme and Microbial Technology，1988，10（4）：227－232.

［10］Astrup T，Mullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity［J］.Arch Biochem Biophys，1952，40（2）：346－351.

［11］Kondo H，Kondo S，Ikesawa I，etal.Studies on the quantitative method for determination of hemorrhagic activity of habusnake ven?om［J］.Jpn J Med Sci Biol，1960，4（13）：43－51.

［12］Bekemeier H，Hirschelmann R，Giessler A J.Carrageenin－induced thrombosis in rats and mice：a model for testing antithrombotic substances［J］.Agents Actions，1985，16（5）：446－451.

［13］王厚偉，張翠紅，崔為正，等.家蠶蛾溶繭酶分泌器官及蛾吐出液的研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2005，31（2）：136－140.

［14］徐依成，徐雪東，胡文立.溶血栓藥物在急性腦梗死中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)新藥與臨床雜志，2008，27（5）：365－368.

S881.2

A

1007－0982（2015）04－0048－06

2015－02－04；接受日期：2015－05－20

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)CARS－22）；山西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)20120311025－3）。

王乃紅（1964—），男，山西芮城，本科，高級(jí)農(nóng)藝師。

Tel：13466945998，E?mail：wnh＿1964＠163.com

李文利，男，副教授。

Tel：13342277088，E?mail：biolwl＠dlut.edu.cn