葉崇軍李 冰孟 艷魏兆軍陳復生

（1安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥 230061；2安徽農業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥 230036；3合肥工業(yè)大學生物與食品學院，安徽合肥 230009）

全天然絲膠蛋白的提取及酶解條件的篩選

葉崇軍1，2李 冰1孟 艷2魏兆軍3陳復生1

（1安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥 230061；2安徽農業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥 230036；3合肥工業(yè)大學生物與食品學院，安徽合肥 230009）

以天然絲膠蠶繭為材料，采用冷凍干燥法和噴霧干燥法提取絲膠蛋白，選擇蛋白水解酶對絲膠蛋白進行酶解反應，研究酶解規(guī)律，并根據SDS－PAGE的方法測定絲膠蛋白及其酶解產物的分子量。結果顯示：真空冷凍干燥法提取的絲膠蛋白得率較高，而噴霧干燥則更適于工業(yè)化生產；木瓜蛋白酶對絲膠蛋白的降解效果優(yōu)于中性蛋白酶；在pH值8.0、木瓜蛋白酶濃度4.0%（w／v）、絲膠蛋白濃度10.0%（w／v）、反應溫度50℃、反應時間120 min的條件下，可以得到小分子量的絲膠多肽（5～12 kD）。

絲膠蛋白；提取方法；蛋白水解酶；小分子量；絲膠多肽

蠶絲是人類最早利用的天然蛋白之一，長期以來，它一直主要應用在紡織、服裝領域，而對其在其它領域的開發(fā)利用則相對較少。近年來，隨著生物醫(yī)藥技術的迅速發(fā)展，國內外對蠶絲，特別是絲膠蛋白的新功能材料開發(fā)和綜合利用已日趨廣泛?，F有研究表明絲膠蛋白具有抗菌［1］、防紫外［2］、保濕［3］、抗氧化［4］等功能特性，在化妝品、食品、生物醫(yī)學以及生物技術等領域具有良好的應用前景［5－6］。

絲膠蛋白質的相對分子質量為14～314 kD［7］，須經過水解，才能最大限度地發(fā)揮其功效。在涉及絲膠蛋白的多功能應用開發(fā)中，需要將大分子絲膠蛋白水解至小分子多肽，甚至游離氨基酸。因此，將絲膠蛋白進行水解，制取一定分子量的多肽形式，成為亟待解決的問題。通常，對絲膠的水解常用酸、堿等化學法，但這些方法都存在諸多缺點。酶解法研究絲膠蛋白的降解作用，具有獨特的優(yōu)點［8］。這不僅是因為酶水解作用條件溫和，效率高，不破壞原有蛋白質的氨基酸組成，而且由于它的高度專一性，可根據不同的應用需要，來制備不同的多肽產品；同時，由于人體體液中也含有微量的多種蛋白分解酶［9］，為絲膠醫(yī)用材料在人體環(huán)境下的應用提供了先天的降解條件。因而，利用生物酶來水解天然絲膠蛋白，可行性較高。

為有效發(fā)揮絲膠蛋白的功能特性，滿足化妝品、食品、醫(yī)藥等領域創(chuàng)新產品的研制和生產對蛋白質不同分子量大小的嚴格要求，本研究以天然絲膠蠶繭為素材，采用冷凍干燥法和噴霧干燥法提取絲膠蛋白，選擇不同的蛋白水解酶，將大分子的絲膠蛋白降解至小分子多肽，并對酶解條件進行優(yōu)化，為高效、合理開發(fā)利用絲膠資源提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全天然黃綠色絲膠蠶品種：綠S，由安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所保存，按照正常條件飼養(yǎng)，化蛹后取蠶繭的繭殼備用。

試劑與儀器設備：中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司產品；十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、蛋白質分子量標準（寬），Sigma公司產品；其他試劑均為分析純。HH－2恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產品；RE－52型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產品；FE20 pH計，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司產品；LGJ－12型冷凍真空干燥儀，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產品；臺式高效冷凍離心機，Thermo公司產品；Tanon－1600凝膠成像儀，上海天能公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 全絲膠蛋白的提取與干燥方法比較 用溫水洗滌繭殼，去掉贓物，烘干（60℃）后剪成約1 cm2的碎片；稱取15 g碎繭殼，加入蒸餾水750 mL，放入滅菌鍋，在125℃煮2.5 h，用紗布過濾后，生絲用溫水洗滌3遍，合并蠶絲脫膠液和洗滌液，然后用濾紙抽濾，絲膠溶液在80℃旋轉蒸發(fā)，即得絲膠蛋白濃縮液，－4℃冷藏備用。

將300 mL絲膠蛋白濃縮液放在溫度50～60℃，壓強0.1 MPa條件下，真空濃縮至約100 mL，然后進行預凍（絲膠蛋白濃縮液的預冷溫度是－40℃，2 h完全凍結），在樣品溫度－33℃，壓強1 Pa條件下進行冷凍干燥。將300 mL絲膠蛋白濃縮液在進口熱風溫度195℃、排風溫度95℃、風機轉速50 Hz條件下，進行噴霧干燥，比較2種干燥方法絲膠蛋白的提取率。

1.2.2 絲膠蛋白酶的篩選 分別選取中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，在酶濃度1%、pH值7.0、反應溫度60℃、底物濃度10%、反應時間120 min的條件下，對提取的絲膠蛋白進行酶解，并采用SDS－聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS－PAGE）的方法測定酶解產物的分子量（12%分離膠，5%濃縮膠）［11］。根據標準分子質量蛋白質的分布狀態(tài)，得到絲膠蛋白樣品和絲膠蛋白酶解產物的分子質量的分布情況，然后選擇能將絲膠蛋白降解為小分子量的蛋白酶，進行酶解條件的研究。

1.2.3 不同pH值對絲膠蛋白降解的影響 設pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，稱取絲膠蛋白粉1 g，在酶濃度1%、底物濃度10%、反應時間120 min、反應溫度60℃的條件下，對絲膠蛋白進行酶解；酶解液經5 000 r／min離心10 min后，測定絲膠多肽的分子量分布，選擇最適pH值。

1.2.4 不同酶濃度對絲膠蛋白降解的影響 設酶濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和4.0%（w／v），稱取絲膠蛋白粉1 g，選擇最適pH值，在底物濃度10%、反應時間120 min、反應溫度60℃的條件下，對絲膠蛋白進行酶解，測定酶解液中絲膠多肽的分子量分布，選擇最佳酶濃度。

1.2.5 不同底物濃度對絲膠蛋白降解的影響 設底物濃度分別為1.0%、5.0%、10.0%、15.0%和20.0%（w／v），稱取絲膠蛋白粉1 g，選擇最適pH值和酶濃度，在反應時間120 min、反應溫度60℃的條件下，對絲膠蛋白進行酶解，測定酶解液中絲膠多肽的分子量分布，選擇最佳底物濃度。

1.2.6 不同反應時間對絲膠蛋白降解的影響 設反應時間分別為0、30、60、120、180 min，稱取絲膠蛋白粉1 g，選擇最適pH值、酶濃度和底物濃度，在反應溫度60℃的條件下，對絲膠蛋白進行酶解，測定酶解液中絲膠多肽的分子量分布，選擇最佳反應時間。

1.2.7 不同反應溫度對絲膠蛋白降解的影響 設反應溫度分別為20、30、40、50、60℃，稱取絲膠蛋白粉1 g，選擇最適pH值、酶濃度、底物濃度和反應時間，對絲膠蛋白進行酶解，測定酶解液中絲膠多肽的分子量分布，選擇最適反應溫度。

2 結果與分析

2.1 不同干燥方法對絲膠蛋白提取率的影響

不同干燥方法提取絲膠蛋白的得率存在較大的差異，冷凍干燥法得到的綠S絲膠蛋白得率較高，可以達到77.68%，而噴霧干燥法的絲膠蛋白得率只有30.80%，遠遠低于冷凍干燥法的得率。造成這種現象的主要原因，可能是因為噴霧干燥法粘壁現象較為嚴重，霧化效果有待改善。經干燥處理能提取這么多的絲膠蛋白，與蠶品種的特性有關，綠S是安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所保存的全天然絲膠品種，其含有的絲膠蛋白比普通蠶品種要高得多［12］。

2.2 不同絲膠蛋白酶的酶解效果

在酶濃度1%、pH值7.0、反應溫度60℃、底物濃度10%、反應時間120 min的條件下，用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對絲膠蛋白的酶解效果進行比較，從不同蛋白酶對絲膠蛋白的酶解效果（圖1）可以看出，木瓜蛋白酶的酶解效果優(yōu)于中性蛋白酶，絲膠蛋白經蛋白酶酶解后，其絲膠多肽的分子量分布范圍較廣，從14 kD到200 kD都有分布；木瓜蛋白酶降解后的絲膠多肽分子量分布則明顯變窄，而中性蛋白酶對絲膠蛋白的酶解作用則不明顯。因此，選取木瓜蛋白酶進行酶解條件的研究。

2.3 不同pH值對絲膠蛋白降解的影響

為了檢驗pH值對木瓜蛋白酶水解絲膠蛋白的影響，在酶濃度1%、底物濃度10%、反應溫度60℃、反應時間120 min的條件下，分別用pH值5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，采用SDS－PAGE分析法對絲膠蛋白進行酶解，從不同pH值對絲膠蛋白降解的影響（表1）可以看出，木瓜蛋白酶對絲膠蛋白的酶解作用隨著pH值的增加，其酶解后的絲膠多肽分子量分布范圍發(fā)生顯著變化；當pH值為5.0時，絲膠多肽分子量分布在5～200 kD；而當pH值為8.0時，絲膠多肽分子量則分布在5～25 kD；因此，木瓜蛋白酶水解絲膠蛋白的適宜pH值為8.0。

表1 不同pH值對絲膠蛋白降解的影響

2.4 不同酶濃度對絲膠蛋白降解的影響

從不同酶濃度對絲膠蛋白降解的影響（表2）可以看出，木瓜蛋白酶對絲膠的水解作用隨著酶濃度的改變而發(fā)生顯著變化，在pH值為8.0、反應溫度60℃、底物濃度10%、反應時間120 min的條件下進行酶解，隨著酶濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和4.0%）的提高，絲膠多肽的分子量的分布范圍變??；當酶濃度在0.5%時，絲膠多肽的分子量的分布范圍是5～110 kD；當酶濃度在4.0%時，絲膠多肽的分子量的分布范圍是5～18 kD；因此，木瓜蛋白酶水解的最佳酶濃度為4.0%。

表2 不同酶濃度對絲膠蛋白降解的影響

2.5 不同底物濃度對絲膠蛋白降解的影響

在pH值8.0、酶濃度4.0%、反應溫度60℃、反應時間120 min的條件下進行酶解，隨著底物濃度（1.0%、5.0%、10.0%、15.0%和20.0%）的增加，木瓜蛋白酶水解絲膠的最佳酶濃度在逐漸下降；當底物濃度為1.0%時，木瓜蛋白酶水解絲膠的效果最佳，其水解產物絲膠多肽的分子量分布在5～10 kD；當底物濃度為10.0%時，其水解產物絲膠多肽的分子量分布在5～14 kD；而當底物濃度增加到20.0%時，木瓜蛋白酶對絲膠的水解效果欠佳，絲膠多肽的分子量分布在5～200 kD（表3）。考慮到酶解效率，選擇10.0%的底物濃度為最適底物濃度。

表3 不同底物濃度對絲膠蛋白降解的影響

2.6 不同反應時間對絲膠蛋白降解的影響

在酶濃度4.0%、pH值8.0、底物濃度10.0%、反應溫度60℃的條件下進行酶解，木瓜蛋白酶對絲膠蛋白的水解程度隨著反應時間（0、30、60、120、180 min）的增加而增加；當反應時間為120 min時，水解產物的分子量分布在5～50 kD；當反應時間增加到180 min時，木瓜蛋白酶降解絲膠蛋白的水解產物的分子量的總體分布未發(fā)生顯著改變（表4）；因此，最佳反應時間為120 min。

表4 不同反應時間對絲膠蛋白降解的影響

2.7 不同反應溫度對絲膠蛋白降解的影響

在最佳酶濃度4.0%、pH值8.0、底物濃度10.0%、反應時間120 min的條件下，對絲膠蛋白進行酶解時，木瓜蛋白酶對絲膠的水解產物分子量分布，隨著反應溫度（20、30、40、50、60℃）的變化發(fā)生明顯改變；當反應溫度從20℃增加到30℃時，木瓜蛋白酶水解產物的分子量分布從5～200 kD，降低到5～90 kD；而當反應溫度從40℃增加到60℃時，木瓜蛋白酶仍保持較強的水解活性（表5）?？紤]到過高的溫度容易使蛋白變性，所以，選擇的最佳反應溫度為50℃。

表5 不同反應溫度對絲膠蛋白降解的影響

3 討論

冷凍干燥法獲取絲膠蛋白的效果優(yōu)于噴霧干燥法，采用冷凍干燥法可獲得77.68%的絲膠蛋白，而噴霧干燥法為30.80%，少了46.88個百分點。在冷凍干燥法和噴霧干燥法干燥工藝的對比中發(fā)現，冷凍干燥始終是在低溫和真空狀態(tài)下進行，有利于保持產品的功能特性和理化特性；但冷凍干燥的耗時較長（至少48 h），并且在此過程中要抽真空、制冷和加熱，所以能耗也相對較高，一次處理物料的量也相對較少，每次只能干燥數百毫升的濃縮液，雖然得率較高，但如果應用于工業(yè)生產，將大大增加成本，效率也非常低，只適合實驗室研究，不適合大規(guī)模地商品化生產絲膠蛋白產品。而噴霧干燥的過程是在瞬間完成的，也可以連續(xù)進料，不僅大大提高了效率，也節(jié)約了時間，所需設備簡單、成本較低、產量高，適合大規(guī)模的連續(xù)化生產。可以認為噴霧干燥法是冷凍干燥法在絲膠蛋白商品化生產中的替代。

近年來，絲膠蛋白的多領域研究和開發(fā)成為熱點，但回收的絲膠蛋白不僅純度低、容易變性，污染嚴重，而且工程繁雜，效率低，成本高，與廣泛的多領域應用也有較遠的距離。絲膠蛋白的大量生產，選育全天然純絲膠蠶新品種是最有效的捷徑，可以省略回收程序、節(jié)約成本、回避污染、保證綠色環(huán)保，直接投入多領域的利用，發(fā)揮其巨大的社會、經濟和生態(tài)效益。本研究的結果顯示，從全天然絲膠蠶繭中提取了較高含量的絲膠蛋白（77.68%），這主要歸因于品種特性。利用日本引進的絲膠品種資源和自主創(chuàng)新品種資源，采用遠緣雜交、基因導入、定向選育等方法［12］，育成的特殊絲膠蠶品種的絲膠蛋白含量較高，利用此特殊絲膠蠶品種可以大量生產優(yōu)質的全天然、純絲膠蛋白。

絲膠及其水解產物可應用于很多領域，但是其應用須依賴于分子量。絲膠多肽的分子量在20～200 kD之間變化。絲膠及其衍生物不能充分溶于水，需要被降解至小分子多肽，才能應用于其他領域。有報道稱絲膠多肽覆蓋著的纖維能預防磨損皮膚的受傷及皮疹的進一步發(fā)展［11］。親水的纖維可通過依附0.1%～5.0%絲膠多肽，成為人造絲或棉的表面材料［3］。此外，這些改良的纖維是能吸收的，而不會引起皮疹。在哺乳類動物或昆蟲細胞的培養(yǎng)基中使用的胎牛血清或牛血清白蛋白可以替換成平均分子量為30 kD的絲膠多肽［13］。當絲膠多肽（4～60 kD）與頭發(fā)護理產品中水溶性的殼聚糖衍生物和三甲胺衍生物發(fā)生相互作用，其優(yōu)良性能得到進一步顯現［14］。低分子量的絲膠多肽（≤20 kD）可用作化妝品，包括皮膚護理產品和頭發(fā)護理產品、保健品和藥物。

本試驗結果表明，采用木瓜蛋白酶水解效果較好，經試驗研究在酶解條件為pH值8.0、木瓜蛋白酶濃度4.0%、絲膠蛋白濃度10.0%、反應溫度50℃、反應時間120 min的條件下，對絲膠蛋白進行水解，可以得到小分子量的絲膠多肽（5～12 kD）。但是本研究僅僅考察了pH值、酶濃度、底物濃度等各個單因素對木瓜蛋白酶降解絲膠蛋白的影響，而關于各個因素間的相互影響則有待進一步研究。

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S881.3

A

1007－0982（2015）04－0044－05

2015－02－12；接受日期：2015－06－18

現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（編號CARS－22）；安徽省農業(yè)科學院院長青年創(chuàng)新基金項目（編號14B0635）；安徽省農業(yè)科學院種子工程項目（編號15B0605）。

葉崇軍（1983—），女，安徽六安，碩士，助理研究員。

Tel：0551－62852900，E?mail：yechj1983＠163.com

陳復生（1958—），男，博士，研究員。

Tel：0551－62852900，E?mail：chenfs58＠hotmail.com