張永紅 唐芬芬 邵榆嵐 朱 峰 白興榮

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101）

云南省陸良縣蠶區(qū)病蠶BmDNV VD1 ORF2 PCR檢測(cè)及序列分析

張永紅 唐芬芬 邵榆嵐 朱 峰 白興榮

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101）

根據(jù)家蠶濃核病的典型病癥，推測(cè)云南省陸良縣蠶區(qū)病蠶感染該病毒；為進(jìn)一步確認(rèn)家蠶感染濃核病病毒，參照家蠶濃核病病毒－鎮(zhèn)江株（Bombyx mori densonucleosis virus－3，BmDNV－3）基因組VD1鏈非結(jié)構(gòu)蛋白基因1 ORF2序列設(shè)計(jì)特異性引物，以病蠶基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)該蠶區(qū)的病蠶是否感染BmDNV，PCR檢測(cè)結(jié)果得知，在陸良縣收集的14戶蠶農(nóng)病蠶樣品中有7組樣品感染了BmDNV；為進(jìn)一步了解該地區(qū)病毒與已報(bào)道病毒株系間的進(jìn)化關(guān)系，純化該病毒并提取基因組，回收VD1 ORF2上下游引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物并克隆該基因片段（GenBank登錄號(hào)：KR909094）；收集NCBI已登錄非結(jié)構(gòu)蛋白1基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，從進(jìn)化樹(shù)可以得知，BmDNV－3與家蠶濃核病病毒－陸良株（Bombyx mori densonucleosis virus－Luliang，BmDNV－Luliang）聚為1支，說(shuō)明分離得到的BmDNV為BmDNV－3的1個(gè)分離株系，為下一步研究病毒與宿主間基因組進(jìn)化提供理論依據(jù)。

陸良縣；家蠶濃核?。籔CR；VD1 ORF2；系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)；鎮(zhèn)江株；陸良株

家蠶濃核病病毒（Bombyx mori densonucleosis virus，BmDNV；Bombyx mori bidensovirus，BmBDV）屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae）的濃核病毒屬（Densovirinae），無(wú)囊膜，病毒粒子呈正面體，它主要感染家蠶的中腸柱狀上皮細(xì)胞［1］。該病毒基因組大小約為4.0～6.5 kb，且為正負(fù)鏈單分子ssDNA，正鏈和負(fù)鏈包被在不同的衣殼蛋白中，正負(fù)鏈在適當(dāng)鹽濃度條件下抽提可形成雙鏈dsDNA［2］。BmDNV－3病毒基因組含有2種不同的單鏈線形DNA分子（VD1為6 543 bp，VD2為6 022 bp），兩者之間沒(méi)有同源性，基因組VD1鏈主要包括4個(gè)開(kāi)放閱讀框ORFs（ORF1、ORF2、ORF3、ORF4），VD2包括2個(gè)ORFs，VD1和VD2的末端重復(fù)序列分別為224 bp和524 bp［3］。VD1與VD2位于2個(gè)不同的衣殼蛋白中，VD1與VD2是如何相互作用的還有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證。

家蠶作為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，日本株系BmDNV－1［4］、日本山梨株BmDNV－2［5］、鎮(zhèn)江株BmDNV－3［3］、印度株BmDNV－4［6］、日本信大株BmDNV－5［7］與重慶株BmDNV－6［8］家蠶濃核病病毒的不同株系在家蠶體內(nèi)得到分離，上述株系的全基因組序列均被測(cè)定，家蠶對(duì)不同株系的DNVs的感受性、血清學(xué)上存在差異［9］，在宿主感染部位上也存在不同［10］。BmDNV給中國(guó)蠶桑產(chǎn)業(yè)造成較大的損失，隨著檢測(cè)病毒技術(shù)的不斷進(jìn)步，PCR等分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛運(yùn)用；本文以采集于云南省陸良縣疑似BmDNV病蠶為樣品，根據(jù)已報(bào)道的BmDNV－3 VD1基因組ORF2序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)PCR手段來(lái)鑒定是否感染BmDNV，在此基礎(chǔ)上，克隆該基因片段、測(cè)序，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建了DNV進(jìn)化樹(shù)，分析了其與已報(bào)道株系的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及主要試劑

1.1.1 家蠶品種、病毒與細(xì)菌 菁松×皓月家蠶品種，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所家蠶資源室提供；BmDNV的病蠶樣品，從云南省陸良縣14戶蠶農(nóng)家采集，分別編號(hào)（1～14號(hào)）備用；大腸桿菌DH5α，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 引物 根據(jù)GenBank已登陸B(tài)mDNV－3株基因組片段VD1 ORF2序列，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），引物由上海生工生物工程公司合成。

表1 BmDNV－3 VD1 ORF2擴(kuò)增引物序列

1.1.3 試劑 PCR反應(yīng)體系（10×PCR buffer、dNTPs和Ex－Taq聚合酶）、pMD19－T載體試劑盒，購(gòu)自大連TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒粒子收集與基因組提取 準(zhǔn)備云南省陸良縣14戶蠶農(nóng)的病蠶樣品，取出病蠶中腸組織分別用滅菌水研磨后，用紗布過(guò)濾勻漿液，于4 000 r／min離心20 min，過(guò)濾數(shù)次，收集的混合液加到1 mL基因組抽提液（10 mmol／L Tris－Cl，pH8.0；0.1 mol／L EDTA，pH 8.0；0.5%SDS）中，并加入蛋白酶K，55℃水浴2 h；利用Tris平衡酚，酚∶氯仿（1∶1），酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶l），氯仿各抽提1次；無(wú)水乙醇沉淀基因組，70%乙醇洗滌DNA，最后用適量的TE溶液溶解沉淀，溶液用于PCR檢測(cè)。

1.2.2 病毒純化與基因組提取 根據(jù)1.2.1中病蠶樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果，選取感染BmDNV的1個(gè)樣品（2號(hào)）純化病毒粒子，接種于菁松×皓月的4齡起蠶，發(fā)病后收集病蠶。用1.2.1的方法收集病毒粒子，病毒混合液用氯仿反復(fù)抽提，至無(wú)明顯的白色變性蛋白和脂類，然后用飽和度40%硫酸銨沉淀混合液，用PBS（0.1 M，pH7.2）溶解沉淀；40%（w／w）氯化銫溶液梯度純化該病毒，45 000 r／min離心30 min，分部收集，取260 nm吸光度部分，4℃保存?zhèn)溆茫辉俅翁崛〔《净蚪M用于PCR檢測(cè)和擴(kuò)增目的基因片段。

1.2.3 病毒基因組目的片段克隆 純化后的病毒基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（Mg2＋）5 μL，2.5 mmol／L dNTPs 4 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，Ex－Taq DNA聚合酶0.25 μL，加ddH2O至50 μL；條件如下：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，終止延伸72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒純化，連接到pMD19－T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，M13F／M13R擴(kuò)增來(lái)驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性菌液送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 目的基因片段生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果用BioXM 2.6軟件（http：／／home.njau.edu.cn／～bioxm）進(jìn)行拼接和分析；應(yīng)用Prosite數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.expasy.ch／cgi－bin／prosite／PSScan.cgi）分析該蛋白的結(jié)構(gòu)功能域；已登陸B(tài)mDNV VD1 ORF2序列（表2），基于ORF2序列利用MEGA 4構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)分析親緣關(guān)系。

表2 濃核病病毒VD1 ORF?2序列來(lái)源

續(xù)表2

2 結(jié)果與分析

2.1 采集病蠶樣本的PCR檢測(cè)

從陸良縣14戶蠶農(nóng)采集的病蠶樣品抽提基因組后，VD1 ORF2上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有約975 bp大小的條帶，初步確定該地區(qū)有7個(gè)樣品的家蠶感染了BmDNV。

圖1 陸良縣14個(gè)樣品的病蠶基因組BmDNV－3 VD1 ORF2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 純化后病蠶樣本的PCR檢測(cè)

選取陸良縣2號(hào)病蠶的樣本，添食正常家蠶的4齡起蠶，發(fā)病后收集病蠶，提取病毒粒子和病毒基因組再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增確認(rèn)，從電泳結(jié)果得知獲得約975 bp大小的條帶（圖2），克隆該基因片段并測(cè)序。

2.3 BmDNV VD1 ORF2基因生物信息學(xué)分析

圖2 陸良縣2號(hào)病蠶樣本純化后的基因組BmDNV－3 VD1 ORF2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.1 BmDNV VD1 ORF2編碼NS1蛋白生物信息學(xué)分析 BmDNV NS1（Non－structural protein 1，非結(jié)構(gòu)蛋白1）為多功能蛋白，在病毒復(fù)制過(guò)程中具有重要功能［11］。NS1蛋白中也存在細(xì)小病毒保守的解旋酶（helicase）／ATP酶基序，涉及病毒DNA復(fù)制、序列特異性DNA結(jié)合、解旋酶、ATP依賴的專一性核酸內(nèi)切酶以及ATP酶活性［12－14］。家蠶濃核病病毒－鎮(zhèn)江株（Bombyx mori densonucleosis virus－3，BmDNV－3）VD1 ORF2核苷酸序列全長(zhǎng)951 bp，編碼含316個(gè)氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1；家蠶濃核病病毒－陸良株（Bombyx mori densonucleosis virus－Lu?liang，BmDNV－Luliang）VD1 ORF2核苷酸序列全長(zhǎng)951 bp，編碼也含316個(gè)氨基酸。核苷酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)在C585、C657這2個(gè)位置發(fā)生了點(diǎn)突變，均為T被替換為C，其中C585為非同義替換，C657為同義替換（圖3）；BmDNV－Luliang NS1氨基酸序列中196處由C替換為R（圖4），即半胱氨酸變?yōu)榫彼?，Prosite數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示（圖5）NS1解旋酶為超家族3解旋酶（Superfamily 3 helicase），其催化中心在118－305 aa之間，存在ATP結(jié)合位點(diǎn)的A型GXXXXGKT／S（X表示任何氨基酸）保守結(jié)構(gòu)基序，且具有解旋酶活性，NS1蛋白質(zhì)的解旋酶功能未發(fā)生變化。

圖3 BmDNV－3與BmDNV－Luliang VD1 ORF－2核苷酸序列比對(duì)

圖4 BmDNV－3與BmDNV－Luliang NS1氨基酸序列比對(duì)

圖5 BmDNV?Luliang NS1蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)

2.3.2 NS1同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析 根據(jù)已登錄的病毒NS1基因序列，利用MEGA 4軟件Neighbor Jointing（NJ）法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖6），結(jié)果顯示，BmDNV－3與BmDNV－Luliang聚為1支，兩者同其它宿主濃核病親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，最近的為中國(guó)對(duì)蝦肝胰腺濃核病病毒（Fenneropenaeus chinensis hepa? topancreatic densovirus，F(xiàn)chDNV），分析FchDNV同BmDNV－3、BmDNV－Luliang病毒株系ORF2及NS1同源性，其中FchDNV同BmDNV－3和BmDNV－Lu?liang株系，與ORF2核苷酸序列同源性分別為44.2%、44.3%，與NS1氨基酸序列同源性均為18.1%（表3）。

圖6 NS1系統(tǒng)進(jìn)化分析

表3 FchDNV同BmDNV－3、BmDNV－Luliang病毒株系ORF2及NS1同源性比較

3 討論

PCR檢測(cè)的14個(gè)病蠶樣品中有7組樣品感染了BmDNV，7個(gè)樣本是從同一種寄生家蠶品系中獲得，而且各農(nóng)戶的地理位置相近，可推測(cè)該地區(qū)流行的BmDNV株系為同1個(gè)株系，所以選取2號(hào)樣品作為研究的對(duì)象，純化該病毒對(duì)正常家蠶進(jìn)行添食，該病毒同樣表現(xiàn)為高致病性，為了分析該病毒株系基因組類型，利用BmDNV－3 VD1 ORF2基因引物擴(kuò)增得到特異條帶，并且該基因的進(jìn)化樹(shù)也說(shuō)明了該病毒為BmDNV－3的1個(gè)分離株系。

本研究只對(duì)VD1 ORF2序列進(jìn)行了克隆分析，ORF2與BmDNV－3 ORF2核苷酸序列同源性高達(dá)99.8%，其中C585、C6572個(gè)位置發(fā)生了點(diǎn)突變，均是T被替換為C，其中C585為非同義替換，C657為同義替換，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列196處的半胱氨酸變?yōu)榫彼?，Prosite數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)該蛋白仍然具有解旋酶的功能基序，氨基酸的變化是否直接影響到病毒的毒力，這有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。NS1系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)BmDNV－Luliang為BmDNV－3的1個(gè)分離株系，該病毒的基因組類型相同，進(jìn)化樹(shù)上的其它宿主病毒NS1蛋白都具有解旋酶基序，但同源性都較低，BmDNV－Luliang與FchDNV ORF2核苷酸序列的同源性較高為44.3%，與NS1氨基酸序列的同源性為18.1%（表3），其中2種家蠶的BmDNV與FchDNV親緣關(guān)系較近。

該地區(qū)的分離株系VD1和VD2基因組片段還未克隆，其它結(jié)構(gòu)蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因同BmDNV－3的同源性如何還有待于進(jìn)一步的研究。

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S881.2

A

1007－0982（2015）04－0038－06

2015－06－02；接受日期：2015－07－31

云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)2013KJTX006）；

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)CARS－22）。

張永紅（1985—），男，云南師宗，碩士，研究實(shí)習(xí)員。

E?mail：zhang200503＠126.com

白興榮，男，副研究員。

Tel：0873－3860077，E?mail：bxrong3＠163.com