朱美抒 (廣東省深圳市第二人民醫(yī)院燒傷整形科，廣東 深圳 518000)

衰老為正常且不可逆轉(zhuǎn)的生物學(xué)現(xiàn)象，延緩機(jī)體衰老為延長(zhǎng)人體壽命的重要手段。臨床研究指出細(xì)胞增殖能力下降與衰老的發(fā)生與發(fā)展顯著相關(guān)，且脂肪干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能夠有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增生，發(fā)揮一定抗氧化及抗凋亡功能，從而實(shí)現(xiàn)抗衰老［1］。但其具體下游機(jī)制尚不明確。本研究試圖通過中波紫外線誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞衰老，檢測(cè)其中多種蛋白的表達(dá)，探討脂肪干細(xì)胞的抗衰老機(jī)制，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料:儀器與試劑生物素標(biāo)記抗體芯片-1(廣州瑞博奧)、DMED 細(xì)胞培養(yǎng)基(武漢博士德)、2×SDS 蛋白裂解液(Beyotime)、Genepix 4000B 激光掃描儀(Molecular Devices)、紫外交聯(lián)儀(上海蘭儀)等;人皮膚成纖維細(xì)胞及人脂肪干細(xì)胞均由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法:體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞及人脂肪干細(xì)胞，取第3 代細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)。取成纖維細(xì)胞(對(duì)照組)及脂肪干細(xì)胞(觀察組)，按106 個(gè)/皿接種至直徑10 cm 培養(yǎng)皿中，各組均12 個(gè)培養(yǎng)皿。利用紫外交聯(lián)儀以40 mJ/cm2劑量UVB 行單次照射以誘導(dǎo)衰老。照射48h 后，每培養(yǎng)皿取細(xì)胞，按700 個(gè)/cm2接種至96 孔板(每皿4 孔)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。同時(shí)分別于照射開始即刻、照射12 h、24 h、48 h、72 h(分別標(biāo)記為T0～T4)，收集適量細(xì)胞，行Western Blotting 法半定量檢測(cè)其PDGFRα 蛋白、MMP-24 蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料按均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t 檢驗(yàn)及F 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blotting 結(jié)果以Bio-Rad 公司相關(guān)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:觀察組均未見明顯細(xì)胞形態(tài)變化;對(duì)照組細(xì)胞外形寬大、扁平，細(xì)胞核內(nèi)顆粒增加、細(xì)胞質(zhì)呈透明態(tài)，此為典型衰老形態(tài)。

2.2 兩組PDGFRα 蛋白表達(dá):兩組在T0 時(shí)刻PDGFRα 蛋白表達(dá)無明顯差異，T1 ～T4 時(shí)刻，觀察組該指標(biāo)明顯高于對(duì)照組，見表1。同時(shí)觀察組組內(nèi)變化不明顯(F=1.17，P ＞0.05)，但對(duì)照組隨時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)水平明顯下降(F=37.71，P ＜0.001)。

2.3 兩組MMP-24 蛋白表達(dá):兩組在T0時(shí)刻MMP-24 蛋白表達(dá)無明顯差異，T1～T4時(shí)刻，觀察組該指標(biāo)明顯低于對(duì)照組，見表2。同時(shí)觀察組組內(nèi)變化不明顯(F=1.03，P ＞0.05)，但對(duì)照組隨時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)水平明顯上升(F=35.53，P ＜0.001)。

表1 兩組PDGFR α 蛋白表達(dá)

表1 兩組PDGFR α 蛋白表達(dá)

組別 例數(shù) T0 T1 T2 T3 T4觀察組 12 0.871±0.033 0.868±0.031 0.866±0.041 0.860±0.033 0.861±0.037對(duì)照組 12 0.875±0.041 0.713±0.051 0.661±0.031 0.614±0.033 0.604±0.051 t 值 -0.26 9.00 13.32 18.26 14.13 P 值 ＞0.05 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表2 兩組MMP-24 蛋白表達(dá)

表2 兩組MMP-24 蛋白表達(dá)

組別 例數(shù) T0 T1 T2 T3 T4觀察組 12 0.571±0.036 0.568±0.042 0.556±0.041 0.563±0.043 0.566±0.041對(duì)照組 12 0.570±0.033 0.790±0.101 0.933±0.130 1.137±0.183 1.234±0.161 t 值 0.07 -7.03 -9.58 -10.58 -13.93 P 值 ＞0.05 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

皮膚衰老是機(jī)體衰老的外觀性表現(xiàn)，其細(xì)胞機(jī)制在于成纖維細(xì)胞生理功能下降，部分研究證實(shí)紫外線刺激可加速其衰老［2］;另有動(dòng)物研究指出脂肪干細(xì)胞抑制有助于抑制機(jī)體衰老［3］。但此抗衰老機(jī)制的下游分子學(xué)機(jī)制尚不明確。

基于此，本研究以脂肪干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為對(duì)象，于適量紫外線下誘導(dǎo)衰老。鏡下檢測(cè)顯示對(duì)照組已呈現(xiàn)典型衰老形態(tài)，但脂肪干細(xì)胞形態(tài)未出現(xiàn)明顯變化。這再次證實(shí)了紫外線對(duì)皮膚衰老的誘導(dǎo)作用及脂肪干細(xì)胞的抗衰老作用。

為深入探討其機(jī)制，本研究還對(duì)比了兩組細(xì)胞PDGFRα 蛋白和MMP-24 蛋白的表達(dá)，結(jié)果指出隨時(shí)間延續(xù)，觀察組上述蛋白的表達(dá)并未發(fā)生明顯變化，但對(duì)照組PDGFRα 蛋白明顯下降而MMP-24 蛋白明顯上升。這提示兩蛋白的表達(dá)變化可能與機(jī)體衰老有關(guān)，而脂肪干細(xì)胞的抗衰老機(jī)制可能為抑制兩者的異常表達(dá)。MMP-24 蛋白為基質(zhì)金屬蛋白酶家族主要成員，主要參與膠原蛋白、蛋白多糖等的降解;PDGFRα 蛋白則能夠促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖，為細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)過程中重要蛋白，上述分子學(xué)機(jī)制可能直接參與了機(jī)體的老化過程［4］。

總之，本研究能夠證實(shí)UVB 確能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老;脂肪干細(xì)胞則能夠有效抑制UVB 的誘導(dǎo)衰老，其機(jī)制可能與其對(duì)PDGFR α 蛋白的低表達(dá)與MMP-24 蛋白的高表達(dá)的抑制作用有關(guān)。

［1］ 楊曉楠，畢 會(huì)，張?zhí)m成，等.脂肪干細(xì)胞在脂肪組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2009，15(5):359.

［2］ 王 申，周炳榮，駱丹等.脂肪干細(xì)胞在皮膚光老化中的作用［J］.國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志，2014，40(1):14.

［3］ 楊 春，李東飛，戴景興，等.異體脂肪源干細(xì)胞移植對(duì)大鼠的抗衰老作用［J］.解剖學(xué)報(bào)，2010，41(1):87.

［4］ 段富華，曾文欽，楊 春，等.維甲酸和睪酮單獨(dú)與聯(lián)合誘導(dǎo)脂肪源干細(xì)胞周期的變化［J］.中國(guó)組織工程研究，2014，18(41):6684.