朱 波，華金渭，劉 昆，吉慶勇，吳劍鋒，齊 川

(1.浙江省麗水市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 麗水 323000;2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053;3.浙江省麗水市中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，浙江 麗水 323000)

三葉青是民間珍稀中藥材，又名金線吊葫蘆、石老鼠、蛇附子、石猴子、石抱子、攔山虎、雷膽子、破石珠、土經(jīng)丸，原植物為葡萄科(Vitaceae)崖爬藤屬(Tetrastigma planch)植物三葉崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，塊根或全草入藥，主要分布于我國浙江、湖北、湖南、江西、重慶、四川、廣東、福建、廣西、貴州等地，具有清熱解毒，祛風化痰，活血止痛的功能，臨床主要用于治療高熱驚厥、腹痛、肺炎、哮喘、肝炎、腫瘤等癥［1-4］。目前三葉青的研究報道主要集中于生藥形態(tài)學、組織培養(yǎng)、化學成分、藥理及臨床應用等［5-10］，而三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性研究鮮有報道。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記即微衛(wèi)星間DNA多態(tài)性，是由Zietkiewicz等［11］于1994年提出創(chuàng)建的分子標記技術(shù)，該技術(shù)穩(wěn)定性好，多態(tài)性高，實驗操作簡便且快速，還可以揭示基因組水平的某些特征，且呈孟德爾式遺傳，該技術(shù)一經(jīng)問世就被廣泛用于遺傳多樣性分析、品種分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等研究［12-18］。本試驗收集全國三葉青主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源24份，提取基因組DNA，篩選引物進行ISSR-PCR擴增，分析三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性，以期為三葉青遺傳圖譜構(gòu)建與分子輔助選育新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2012年12月至2013年11月，收集浙江、江西、福建、廣西、湖南、湖北等三葉青主分布區(qū)種質(zhì)資源24份，除湖南懷化種質(zhì)為人工栽培種質(zhì)外，其余23份均為野生種質(zhì)資源(表1)，全部種植于浙江省麗水市農(nóng)業(yè)科學研究院中藥材資源圃，原植物由浙江農(nóng)林大學斯金平教授鑒定為葡萄科植物三葉崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum)，2014年6月，選取不同種源三葉青新鮮葉片，每份樣品隨機選取10個單株，洗凈晾干，待用。

表1 供試三葉青編號與種源地Tab.1 Numbers and provenances of Tetrastigma hemsleyanum

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器 5424R型高速離心機(德國Eppendorf公司)，nexus SX1型PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)，Milli-Q Academic型超純水儀(美國Millipore公司)，BIO-BEST凝膠成像系統(tǒng)(美國SIM公司)，SpectraMax PLUS384型連續(xù)波長酶標儀(美國MD公司)，DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)，AR2140型分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，GR60DA型自動壓力蒸汽滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)。

1.2.2 試劑 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris-base)、β-巰基乙醇、硼酸、氯仿、無水乙醇、異丙醇、氯化鈉、瓊脂糖、異硫氰酸胍、異戊醇、濃鹽酸、DNA Marker、Taq聚合酶、dNTPs等試劑購自天根生化科技(北京)有限公司與百維生物(上海)科技有限公司，ISSR引物購自美國Invitrogen公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA的提取 參照顧紅雅等［19］的方法并加以改進，本試驗所用DNA以混合DNA樣品代表種質(zhì)DNA樣品，具體步驟如下:①將1 mL CTAB提取液(2%CTAB，2%PVP，100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，25 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl)加入到2 mL 離心管中，65 ℃水浴30 min預熱;②預熱期間，取1～2 g樣品置于研缽中，加入適量PVP，液氮中研磨至粉末;③將適量粉末迅速轉(zhuǎn)入盛有1.2 mL TNE(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，0.25 mol/L NaCl，2% β-巰基乙醇)的離心管中，充分震蕩混勻，65℃水浴10 min，期間搖晃2次，室溫10 000 r/min離心10 min，去上清;④加入預熱好的CTAB提取液1 mL，混勻65℃水浴40 min，期間顛倒混勻3～5次，12 000 r/min離心10 min;⑤取上清，加入等體積氯仿-異戊醇(V∶V=24∶1)，充分顛倒混勻，10 000 r/min離心10 min，取上清，重復1次;⑥加入等體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，－20℃冰箱放置30 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清;⑦加入1 mL體積分數(shù)70%乙醇漂洗2次;⑧室溫下微干，加入30～50 μL TE緩沖液;⑨加入終濃度為20 μg/mL的RNaseA，37℃水浴30 min。

1.3.2 引物篩選與體系優(yōu)化 在24個樣品中挑選3個樣品進行正交試驗體系優(yōu)化與引物篩選。從101個引物中篩選出擴增條帶清晰、多態(tài)性好和反應穩(wěn)定的22個引物(表2)，對24份三葉青樣品進行ISSRPCR擴增。正交試驗優(yōu)化的擴增體系與循環(huán)參數(shù)如下:20 μL反應體系中，Taq酶用量0.5 U，模版DNA 20 ng，dNTPs 0.20 mmol/L，引物0.4 μmol/L，2 μL 10 ×Buffer緩沖液(Mg2+濃度1.5 mmol/L);PCR 擴增程序為:94℃ 4 min;94℃變性30 s，48～52℃復性45 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán);72℃延伸7 min，4℃保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)分子標記在相同電泳遷移率(相同分子量片段)條帶的有無統(tǒng)計得到所有位點的二元數(shù)據(jù)，有DNA擴增帶記為1，無帶記為0。利用NTSYSpc2.10e軟件計算樣品之間的遺傳距離和相似系數(shù)，根據(jù)遺傳距離用UPGMA法(Unweighted pair group mean average)聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

篩選的22個引物對24份樣品進行ISSR擴增，共擴增出條帶169條，其中多態(tài)性條帶77條，平均多態(tài)性比例為46.7%，單條引物擴增總帶數(shù)5～11條，平均擴增7.7條，擴增多態(tài)性條帶2～5條，平均擴增3.5條，詳見表2。擴增出的DNA片段集中在450～2 200 bp，其中，多態(tài)性比例最多的引物為P27，達到 66.7%，最低的為引物 P2，P6 與 Xp31，均為33.3%(表 2、圖 1)。

2.2 相似系數(shù)分析

利用NTsys2.10e軟件分析得到24份樣品間的遺傳相似系數(shù)矩陣，遺傳相似系數(shù)越大表明樣品間親緣關(guān)系最近。結(jié)果表明:供試三葉青種質(zhì)資源相似系數(shù)值在0.77～0.99(表3)，親緣關(guān)系最近為浙江蓮都-Ⅰ與浙江蓮都-Ⅱ種質(zhì)，相似系數(shù)最小存在于浙江慶元種質(zhì)與廣西鐘山種質(zhì)之間。

表2 供試ISSR引物及PCR擴增的多態(tài)性Tab.2 Primers selected and polymorphic bands amplified by PCR

圖1 引物xp14對不同種源三葉青ISSR擴增圖(箭頭所指多態(tài)性位點)Fig.1 Bands amplified by ISSR under xp14 primer(the arrow pointing polymorphic locus)

2.3 聚類分析

利用UPGMA法對24份三葉青種質(zhì)資源樣品進行聚類分析，建立聚類分支樹狀(圖2)。供試材料以相似系數(shù)0.847為分類界限，將24份三葉青種質(zhì)資源分成4類:第Ⅰ類有10個種質(zhì)，分別為1、2、5、6、7、8、10、11、23 和 24，本類以浙江種質(zhì)為主，8 份浙江種質(zhì)全部歸于此類，此外還包括江西瑞金與重慶綦江種質(zhì)。從相似系數(shù)看，浙江種質(zhì)較明顯區(qū)別于其他省份種質(zhì)，其中江西瑞金種質(zhì)為人工栽培種質(zhì)，其種源地來自浙江，故歸屬此類;第Ⅱ類有11個種質(zhì)，分別為9、12、13、14、15、16、17、19、20、21和22，本類以江西、廣西、湖北、湖南種質(zhì)為主，大部分上述來源種質(zhì)聚在一起;第Ⅲ類有2個種質(zhì)，分別為湖南懷化與廣西鐘山，湖南懷化種質(zhì)非野生資源，其種源地有待進一步考察;第Ⅳ類僅有一個種質(zhì)，為貴州種質(zhì)。

表3 ISSR標記的24份種質(zhì)資源間的相似系數(shù)Tab.3 Similarity coefficient of 24 germplasm resources by ISSR

圖2 三葉青種質(zhì)資源聚類圖Fig.2 Dendrogram of 24 Tetrastigma hemsleyanum germplasms

3 討論

種質(zhì)資源遺傳多樣性分析是研究物種起源進化、發(fā)現(xiàn)新的基因資源、改良現(xiàn)有育種材料的基礎性工作。分子標記是從DNA水平上揭示品種及種群間差異性和相關(guān)性的有效工具之一，可以用來確定樣本材料之間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，通過聚類分析可以劃分出優(yōu)勢種群，提高自然種群優(yōu)勢的應用效率，對種質(zhì)資源保護和新品種選育具有重要意義［20］。ISSR分子標記技術(shù)結(jié)合了RAPD標記和SSR標記的優(yōu)點，在同一水平上，更具可靠性、重復性高，被廣泛應用于植物種內(nèi)遺傳多樣性的研究［17］。由于三葉青遺傳背景復雜和遺傳基礎理論研究薄弱，加之生長周期長和收集種質(zhì)數(shù)目的增多，采用傳統(tǒng)的分析方法和形態(tài)指標難以有效區(qū)分種質(zhì)，更無法在較短時間內(nèi)研究種質(zhì)資源的遺傳多樣性和種質(zhì)間的親緣關(guān)系。本試驗在收集全國主產(chǎn)區(qū)三葉青種質(zhì)資源的基礎上，開展ISSR分子標記研究，分析三葉青種質(zhì)資源的多樣性與種質(zhì)間的親緣關(guān)系，以期為三葉青種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)與構(gòu)建核心種質(zhì)資源庫奠定基礎。

從ISSR-PCR擴增結(jié)果看，24份三葉青種質(zhì)資源平均多態(tài)性比例為46.7%，表明三葉青種質(zhì)資源存在一定的遺傳多樣性，但相比和志嬌［17］、楊美玲［21］等報道的多態(tài)性比例較低，原因可能是本試驗所取材料均為一個種，屬于種內(nèi)變異，相比種間或居群間變異小，其次可能浙江種質(zhì)占到了所有種質(zhì)的三分之一，且江西瑞金種質(zhì)的種源地也是來自浙江，種源地組成較單一的原因所致。從相似系數(shù)看種質(zhì)間親緣關(guān)系，親緣關(guān)系最近為浙江蓮都-Ⅰ與浙江蓮都-Ⅱ種質(zhì)，表明浙江蓮都-Ⅰ與浙江蓮都-Ⅱ種質(zhì)確為浙江蓮都本地野生種質(zhì)，來源于同一種源地。親緣關(guān)系最遠的為浙江慶元種質(zhì)與廣西鐘山種質(zhì)，浙江慶元位于浙江西南部，廣西鐘山位于廣西東北部，均屬于長江中下游地區(qū)，此地區(qū)以丘陵地形為主，包括江南丘陵、浙閩丘陵與兩廣丘陵，浙江慶元與廣西鐘山分屬浙閩丘陵與兩廣丘陵，丘陵地形以山地居多，生物群落分布復雜多樣，加之慶元百山祖地區(qū)為國家級自然保護區(qū)，復雜的地形地貌可能影響了種群間的基因交流，這可能是浙江慶元與廣西鐘山種質(zhì)親緣關(guān)系較遠的主要原因。從地理位置與相似系數(shù)看，種質(zhì)資源間親緣關(guān)系的遠近不全由地理距離決定，生態(tài)氣候、地形地貌、海拔經(jīng)緯度、群落分布等自然因素及人類活動等社會因素均會對三葉青種質(zhì)資源基因交流產(chǎn)生影響，從而影響親緣關(guān)系。

用UPGMA法將24份三葉青種質(zhì)資源分成4大類，第Ⅰ類以浙江種質(zhì)為主，第Ⅱ類以江西、廣西、湖北、湖南種質(zhì)為主，第Ⅲ類包括湖南懷化與廣西鐘山2個種質(zhì)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，湖南懷化種質(zhì)非野生資源，推測其種源地可能位于廣西與湖南交界處，但最終種源地還需綜合生物學特性、農(nóng)藝性狀、化學成分等試驗確定;第Ⅳ類僅有一個種質(zhì)，為貴州種質(zhì)，此種質(zhì)種源地已知位于黔西南地區(qū)，此地區(qū)位于云貴高原境內(nèi)，海拔、經(jīng)緯度、生態(tài)氣候等因子區(qū)別于其他23份種質(zhì)，這可能是貴州種質(zhì)單獨聚類的原因。

綜上所述，ISSR分子標記適用于三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析，全國主產(chǎn)區(qū)24份三葉青種質(zhì)資源表現(xiàn)出一定的遺傳多樣性，為三葉青品種改良奠定了一定的遺傳基礎。植物的農(nóng)藝性狀為基因表達與環(huán)境互作共同作用的表現(xiàn)，浙江三葉青表現(xiàn)均表現(xiàn)出莖細，圓形的形態(tài)特征，而其他種質(zhì)莖較粗且為方形，結(jié)果顯示可以進行下一步農(nóng)藝性狀、化學成分等指標與特異性DNA片段的相關(guān)性研究，最終實現(xiàn)通過克隆目標基因控制藥材性狀的目的。通過相似系數(shù)分析了三葉青種質(zhì)間的親緣關(guān)系，同時通過遺傳聚類了解三葉青遺傳變異在地理上的分布格局對于制定科學的保護策略并促進其開發(fā)利用具有極為重要的作用。

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