黃 蓉，黃 盼，黃瑞榮，李國慶*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，江西 南昌 330200;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖北省作物病害監(jiān)測與安全控制重點實驗室，湖北 武漢 430070)

草莓灰霉病是草莓大棚生產(chǎn)中及采后草莓儲藏期的重要病害之一，也是導(dǎo)致草莓的產(chǎn)量和質(zhì)量降低的主要因素之一［1］。大棚草莓發(fā)生灰霉病后，每年能造成10% ～30%的減產(chǎn)，在雨水較多的年份則可能達(dá)到50%以上的減產(chǎn)［2］，并且灰霉病在草莓整個生長期和草莓果實儲藏期，均能引發(fā)危害。目前對草莓灰霉病的防治主要還是依靠噴灑殺菌劑、溫濕調(diào)控度和清除病殘體。而長期使用殺菌劑導(dǎo)致的灰葡萄孢產(chǎn)生抗藥性及殘留等問題，已引起大眾關(guān)注，包括生物防治在內(nèi)的替代防治技術(shù)迫切需要發(fā)展［3］。

酵母菌因為其所具有的豐富的酶系和多種經(jīng)濟(jì)價值很高的生理生化活性物質(zhì)，而廣泛地應(yīng)用于人們的生活中。而作為生防菌，酵母菌的優(yōu)勢也很明顯。除了用途廣泛、容易獲得外，酵母菌的適應(yīng)力強、繁殖快，對環(huán)境的要求不高，抗逆能力強，生產(chǎn)工藝及流程已較為成熟。一些酵母菌還可以和其他的殺菌劑合用，從而提高對病害的控制作用，降低殺菌劑的使用劑量［4］。因此酵母菌近年來越來越受重視。

對于酵母菌的分類鑒定，傳統(tǒng)的方法主要是通過形態(tài)特征的觀察和生理生化特性的測定。隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代微生物分類學(xué)的不斷發(fā)展，從遺傳進(jìn)化等角度解決微生物種群之間和種內(nèi)存在的相互關(guān)系問題，也是客觀的需求，因而，分子生物學(xué)的方法也被廣泛地應(yīng)用于酵母菌的分類鑒定上。

至今已有不少研究人員展開了對于酵母菌作為生防菌的控制機理的研究。若植物上的酵母菌數(shù)量的變化，即濃度的變化會影響酵母菌的生控作用，則說明酵母菌與別的病原菌間存在營養(yǎng)和空間的競爭［5］。若與此同時引起了植物體內(nèi)某些酶的產(chǎn)生或是量的變化而控制病害的發(fā)生，則說明酵母菌誘發(fā)了植物自身抗性［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)酵母菌可以不接觸植物組織，通過產(chǎn)生抑菌性揮發(fā)性物質(zhì)這一方式來控制病害［7-8］。因此，釋放揮發(fā)性抑菌物質(zhì)也成為酵母菌的防病機理之一，且這一機制具有巨大的應(yīng)用空間。目前已有可產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的真菌被開發(fā)為生物殺菌劑來防治植物病害。如植物內(nèi)生真菌Muscodor albus菌株CZ-620已被作為生物殺菌劑來防治水果收獲后儲藏期病害、甜菜苗期病害、胡椒根腐病、茄子枯萎病、植物線蟲病害和建筑物腐霉［9-15］等。

本文針對前期工作中篩選得到的一株從草莓植株上分離得到的酵母菌菌株W4682來進(jìn)行探討。明確其分類地位，并測定其揮發(fā)性物質(zhì)對灰霉病的抑制能力，為以后生產(chǎn)應(yīng)用工作的開展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

從不同地區(qū)采集回來的草莓植株樣品中共分離得到1151株酵母菌菌株，經(jīng)過平板對峙培養(yǎng)測定和離體葉片及果實菌體接種測定的層層篩選，獲得菌株W4682可以有效防治草莓灰霉病的酵母菌菌株?；移咸焰?Botrytis cinerea)菌株STBC-1分離自罹病草莓果實。

1.2 ITS-5.8S rDNA 序列分析

采用CTAB法提取酵母菌總DNA，于PDA平板上20℃進(jìn)行菌株活化，3 d后將新鮮菌體涂布到鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上培養(yǎng)，2 d后用少量無菌水從PDA培養(yǎng)基上將新鮮的酵母菌菌體洗下，裝在離心管中，放在離心機中以10 000 r/min的速度離心1 min，收集的菌體放入已預(yù)冷的研缽中，將液氮倒入研缽中，使菌細(xì)胞冷凍，同時迅速研磨酵母菌的菌體，使之成為粉末狀。提取DNA的方法參照文獻(xiàn)［16］。采用50 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴增。擴增引物ITS1/ITS4的設(shè)計參考文獻(xiàn)［17］，PCR擴增程序參照文獻(xiàn)［18］。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物，在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測(110 V，1 h)擴增產(chǎn)物大小。使用回收試劑盒 AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen Scientific，Inc.Union City，USA)對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后，將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China)上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)細(xì)胞。挑選陽性克隆送往北京賽諾生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。將測得的基因序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中通過BLAST程序進(jìn)行對比分析。

1.3 形態(tài)及生物學(xué)鑒定

分子測序比對的結(jié)果與幾個種的相似度都很高，因而按照《酵母菌的特征與鑒定手冊》中所描述方法分別進(jìn)行單菌落單細(xì)胞特征觀察試驗，假菌絲形成試驗，子囊孢子誘導(dǎo)試驗，糖發(fā)酵測定，碳源、氮源和醇類同化試驗，產(chǎn)生類淀粉化合物測定，高滲透壓培養(yǎng)測定，產(chǎn)酸、產(chǎn)酯測定，尿素水解試驗，缺素生長測定和生長溫度測定等試驗［19］，對菌株分類地位加以確認(rèn)。

1.4 酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對灰霉菌菌絲生長的抑制測定

采用雙皿對扣法［7］測定菌株W4682生長過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性成分對灰葡萄孢生長的影響。將100 μL菌株W4682懸液(108cells/mL)均勻涂布在YEPDA平板(酵母提取浸粉10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 6.0左右)上。1 d后，在另外的PDA平板中央接種直徑為6 mm的灰葡萄孢菌絲塊。將2個培養(yǎng)皿蓋去掉，皿底口對口扣在一起，YEPDA平板在下，PDA平板在上，用封口膜封口。在對照處理中，對扣皿中的YEPDA平板沒有接種菌株W4682，而PDA平板上仍然接種灰葡萄孢菌絲塊。將2種處理的對扣皿置于20℃下培養(yǎng)3 d，測量灰葡萄孢菌落直徑。各處理設(shè)3次重復(fù)，整個試驗重復(fù)3次。

1.5 酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對儲藏期草莓灰霉病的防治

將100 μL新鮮酵母細(xì)胞懸浮液(108cells/mL)涂布在YEPDA平板上，20℃下培養(yǎng)1 d，用無菌水將平板上的酵母菌體洗下，血球計數(shù)板計算每皿生物量。用75%的乙醇對試驗用的干燥器和草莓進(jìn)行表面消毒，無菌水洗滌。在6個干燥器底部依次放入培養(yǎng)1 d的酵母菌株W4682平板0，2，4，6，8，10個，分別記為處理CK，W2，W4，W6，W8，W10，另外取一個干燥器，在干燥器底部先鋪一定量的活性炭，然后將另外的10個平板置于活性炭上，記為處理WAC。蓋上隔板，將晾干后的草莓置于隔板上，14顆果每板，每果接種100 μL灰霉菌孢子懸浮液(106cells/mL)，加蓋密封，20℃下培養(yǎng)7 d后，記錄發(fā)病率及發(fā)病程度。病級嚴(yán)重度劃分參照文獻(xiàn)［7］。試驗重復(fù)3次。

1.6 酵母菌定殖草莓果實產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)對草莓灰霉病的防治

將20顆草莓進(jìn)行表面消毒后浸泡在新鮮酵母細(xì)胞懸浮液(108cells/mL)中5 s，取出后晾干，置于消毒的干燥器底部，加蓋密封，20℃下培養(yǎng)1 d后，將另外20顆草莓進(jìn)行表面消毒后，直接放于另一消毒的干燥器底部，在2個干燥器隔板上分別放置14顆新鮮草莓，加蓋密封，20℃下培養(yǎng)。同時進(jìn)行空白對照處理，即僅在干燥器隔板上放置14顆草莓，底部不做任何添加。7 d后記錄發(fā)病率和發(fā)病程度。病級嚴(yán)重度劃分同上。試驗重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用 SAS 軟件(SAS Institute，Version 8.0，Cary，NC，USA，1999)中的方差分析(ANOVA)程序和 Duncan氏新復(fù)極差法分析各試驗中不同處理之間的差異。用t測驗比較2種處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS-5.8S rDNA 序列分析

擴增后獲得酵母菌菌株W4682的ITS-5.8S rDNA片段大小均為618 bp，經(jīng)過使用BLAST程序?qū)@得的序列與在GenBank數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)上傳注冊的ITS-5.8S rDNA序列進(jìn)行同源比對分析后，證實該菌株與Debaryomyces hansenii、Candida saitoana、Candida glaebosa和Filobasidiella neoformans這幾個種的相似度都很高。將所獲序列提交GenBank，登錄號為GQ913348。

圖1 菌株W4682產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對灰霉菌絲生長的抑制效果(20℃，3 d)Fig.1 Effect of the volatile organic compounds produced by the strain W4682 on mycelial growth of B.cinerea(20 ℃，3 d)

2.2 形態(tài)及生物學(xué)鑒定

將形態(tài)及生物學(xué)測定的結(jié)果對照《酵母菌的特征與鑒定手冊》里的酵母菌檢索表進(jìn)行檢索［19］，菌株W4682可發(fā)酵D-葡萄糖，可同化赤蘚糖醇生長，不可同化硝酸鹽生長，可同化蔗糖生長，不可同化L-鼠李糖生長，可同化棉子糖生長，可同化蜜二糖生長，不可同化D-阿拉伯糖生長，不可同化乳糖生長，無生物素時可生長，不可同化淀粉生長，0.01%放線菌酮條件下不生長，形成假菌絲不產(chǎn)生有隔菌絲。因此，酵母菌菌株W4682應(yīng)為:子囊菌門(Ascomycota)、半子囊菌綱(Hemiascomycetes)、酵母菌目(Saccharomycetales)、酵母菌科(Saccharomycetaceae)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii。

2.3 酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對灰霉菌菌絲生長的抑制

在接種灰葡萄孢和菌株W4682的對扣皿處理中，3 d后PDA平板上的灰葡萄孢菌落直徑為1.7 cm，而在僅接種灰葡萄孢的對扣處理中，灰葡萄孢直徑達(dá)到8.5 cm。2種處理之間灰葡萄孢菌落直徑差異性達(dá)到極顯著水平(圖1)。在接種灰葡萄孢和菌株W4682的對扣皿處理中，2種真菌在空間上是分離的，灰葡萄孢菌絲生長受到抑制說明菌株W4682在生長時利用YEPDA中的養(yǎng)分產(chǎn)生了揮發(fā)性抗真菌物質(zhì)。

2.4 酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對儲藏期草莓灰霉病的防治

干燥器中每皿的酵母菌生物量約為1010cells，因此處理CK，W2，W4，W6，W8，W10中酵母菌的生物量呈梯度上升，處理WAC中酵母菌的生物量與處理W10相同。如圖2所示，CK發(fā)病最為嚴(yán)重，果實的平均發(fā)病嚴(yán)重度為7.4，平均發(fā)病率為100.0%，菌絲布滿草莓。W2，W4，W6，W8，W10的發(fā)病程度則依次減輕。W2處理中草莓果實的平均發(fā)病嚴(yán)重度為5.8，平均發(fā)病率為100.0%;W4處理中草莓果實的平均發(fā)病嚴(yán)重度為3.7，平均發(fā)病率為71.4%;W6處理中草莓果實的平均發(fā)病嚴(yán)重度為1.1，平均發(fā)病率為57.1%;W8處理中草莓果實的平均發(fā)病嚴(yán)重度為0.3，平均發(fā)病率為28.6%;W10處理中草莓果實的平均病害嚴(yán)重度為0.2，平均發(fā)病率為21.4%。由此可見，草莓的發(fā)病程度與酵母菌的生物量是呈負(fù)相關(guān)的。而在WAC處理中草莓果實平均嚴(yán)重度恢復(fù)至6.7，平均發(fā)病率上升至100.0%，與CK處理的結(jié)果間沒有顯著差異。由此說明干燥器底部的酵母菌體可以釋放出揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，使發(fā)病程度降低，而添加的活性炭可以將這些揮發(fā)性物質(zhì)吸附，減少其對灰霉菌侵染草莓的影響。

圖2 菌株W4682產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對儲藏期草莓灰霉病的防治效果Fig.2 Effect of the volatile organic compounds produced by the strain W4682 on suppression of botrytis fruit rot of strawberry

酵母菌定殖草莓果實產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)對草莓灰霉病的防治效果Effect of the volatile organic compounds from yeast-infested fruits of strawberry on suppression of botrytis fruit rot of strawberry

2.5 酵母菌定殖草莓果實產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)對草莓灰霉病的防治

從圖3和圖4的結(jié)果中可知，當(dāng)干燥器底部為空白時，隔板上放置的草莓果實其平均發(fā)病率為100.0%，平均病情嚴(yán)重度為7.6(T1);當(dāng)干燥器底部為未接酵母菌的草莓果實時，隔板上放置的草莓果實的平均發(fā)病率為97.6%，平均病情嚴(yán)重度為6.0(T2)，底部的草莓果實平均發(fā)病率為100.0%，平均病情嚴(yán)重度為7.7(T3);而當(dāng)干燥器底部為接種酵母菌W4682的草莓果實時，隔板上放置的草莓果實平均發(fā)病率僅為21.4%，平均病情嚴(yán)重度為0.8(T4)，且底部的草莓果實平均發(fā)病率也僅為35.0%，平均病情嚴(yán)重度為1.2(T5)。很明顯未接種酵母菌的草莓無法抑制草莓灰霉病發(fā)生，而草莓接種了酵母菌W4682后不僅可以控制被接種果實的病害發(fā)生，還可以產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，控制隔板上未接種酵母菌的草莓上病害的發(fā)生。

圖4 酵母菌定殖草莓果實產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)對草莓灰霉病的防治效果Fig.4 Effect of the volatile organic compounds from yeast-infested fruits of strawberry on suppression of botrytis fruit rot of strawberry

3 結(jié)論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)ITS-5.8S rDNA結(jié)構(gòu)既具保守性(反映生物物種的親緣關(guān)系)，又具高變性(揭示生物物種的特征核酸序列)［20］。測定ITS-5.8S rDNA的序列已經(jīng)被作為酵母菌鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化研究的重要手段，測定的結(jié)果也已成為研究酵母菌分類的必要數(shù)據(jù)。但在某些情況下，單獨使用ITS-5.8S rDNA的序列測定是無法確定其分類地位的。只有同時采用傳統(tǒng)的形態(tài)特征和生物學(xué)特性的分類鑒定法［21］，才能確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，更客觀地反映菌株的實際分類地位，得到更為可靠的結(jié)果。因而經(jīng)形態(tài)學(xué)、生物學(xué)及ITS測定后，鑒定菌株W4682為漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。目前報道的漢遜德巴利酵母防病機制主要包括競爭營養(yǎng)和空間、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性［22-23］，本文中證實了漢遜德巴利酵母菌株W4682產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)同樣對灰霉菌的生長及灰霉病的發(fā)生都有較好的抑制作用，是其主要防病機理之一。這是首次報道漢遜德巴利酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)有抑菌效果和防病能力。

漢遜德巴利酵母菌株W4682接種草莓后不僅可以在被接種果實上定殖，控制其病害發(fā)生，還可以產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，控制同一密閉空間內(nèi)未接種的草莓上病害的發(fā)生。因此，在獲得相同防病效果的前提下，可以使酵母菌在田間和儲藏期的應(yīng)用更為方便，使生防酵母菌的實際施用劑量降低，為實際生產(chǎn)應(yīng)用提供了有利的條件。據(jù)報道，漢遜德巴利酵母可以防治芒果炭疽病和蒂腐病，甜櫻桃褐腐病，桃軟腐病，蘋果青霉病，柑桔綠霉病、青霉病和酸腐病等儲藏期病害［22，24-27］。但本研究中沒有測定菌株W4682產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對其它果實致腐真菌的防治效果，為了開發(fā)應(yīng)用工作的展開，其防病廣譜性的測定，需要進(jìn)一步研究探討。雖然本研究中所用的漢遜德巴利酵母菌株分離于健康的草莓葉片組織，且漢遜德巴利酵母是干酪中最常見的酵母菌之一，對干酪的成熟起著重要的作用［28］，其相關(guān)研究屢見不鮮，但也有報道稱其是人類條件致病菌［29］，因此分析驗證菌株W4682產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)組分以及檢測好菌株本身的安全性問題，都是下一步工作必須要解決的重點。

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