劉玉林，莊 翔，陳俊霞*

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室;2.分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor，RI)是一種重要的胞質(zhì)內(nèi)酸性多功能蛋白，可能參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的RNA 水平，能與血管生長因子緊密結(jié)合，強烈抑制血管生長[1]。血管生成素(angiogenin，ANG)是一個強有力的血管生成因子，在體內(nèi)和體外均具有強烈的誘發(fā)血管生成的活性，能有效地誘導(dǎo)腫瘤血管新生和腫瘤細胞的增殖，并參與調(diào)控其他血管生成因子，具有核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象并且能促進核糖體RNA(rRNA)的轉(zhuǎn)錄。但是，RI 與ANG的相互作用機制少有報道，RI是否可能直接與體內(nèi)ANG某一部位結(jié)合，從而阻斷了腫瘤血管生成和細胞增殖的信號通路和核轉(zhuǎn)位進程，進而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移也是未知。有研究者發(fā)現(xiàn)在多人種肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateralizing sclerosis，ALS)患者中ANG 基因發(fā)生自然突變，提示ANG 突變而導(dǎo)致的成熟蛋白質(zhì)功能喪失可能與ALS 發(fā)病密切相關(guān)[2-3]。因此，我們針對ANG的活性位點(Active site)第37位和第138位，即編碼蛋白質(zhì)的第13位和第114位(前24位為信號肽)進行突變，利用蛋白相互作用研究方法初步確定兩者是否存在相互作用，為后續(xù)研究RI 與ANG的相互作用機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人膀胱癌BIU-87 細胞(南京凱基生物技術(shù)有限公司);質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-RI、pCMV-3×flag-ANG、pGEX-4T-RI(重慶醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室構(gòu)建保存);RPMI1640 培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清((TBD 公司);轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司);異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(Sigma公司);質(zhì)粒抽提試劑盒(OMEGA 公司);限制性內(nèi)切酶和T4 連接酶(Takara 公司);鼠抗人GST 抗體、FLAG 抗體和Protein A/G agarose(碧云天生物技術(shù)公司);氨芐青霉素(Amp)和卡那青霉素(Kana)(上海生工生物有限公司);Sepharose 4B gel(GE healthcare 公司);山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗和Alexa Fluor 594 標記山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488 標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 pCMV-3×flag-ANGH13R和pCMV-3×flag-ANGH114R突變體質(zhì)粒的構(gòu)建:以pCMV-3×flag-ANG為模板用Pyrobest 聚合酶進行PCR 突變反應(yīng)。pCMV-3×flag-ANGH13R突變引物序列:上游引物5'-CACACTTCCTGACCCAGCGCTATGATGCCAAACCAC AG-3' 下游引物5'-CTGTGGTTTGGCATCATAGCG CTGGGTCAGGAAGTGTG-3';pCMV-3×flag-ANGH114R

突變引物序列:上游引物5'-GAAAATGGCTTACCT GTCCGCTTGGATCAGTCAATTTTC-3'下游引物5'-G AAAATTGACTGATCCAAGCGGACAGGTAAGCCATT TTC-3'。PCR引物由上海生工生物公司合成，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對正確PCR 產(chǎn)物膠回收純化?；厥债a(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ酶消化質(zhì)粒模板后轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)接種于含氨芐抗生素的LB 平板上，次日隨機挑取單克隆接種于LB 液體培養(yǎng)基(含Amp)中，37℃，300 r/min 培養(yǎng)12～16 h，甘油保菌，提取質(zhì)粒，將提取質(zhì)粒酶切鑒定，并送上海生工測序。

1.2.2 細胞培養(yǎng):BIU-87 細胞用內(nèi)含10%優(yōu)級胎牛血清的RPMI 640 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.2.3 熒光共定位:人膀胱癌BIU-87 細胞接種于含蓋玻片的6孔板中，待長到80%左右時共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-myc-RI 和 pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R，48 h后取出6孔板，PBS 洗細胞3次，每次5 min;4% 多聚甲醛固定細胞30 min，PBS 洗3次，每次5 min;加適量0.1% Triton X-100 通透10 min，PBS 洗3次，每次5 min;3%BSA 封閉1 h，吸掉液體，加配制好的兔抗人RI 抗體和鼠抗人ANG 抗體，4℃靜置過夜，次日用PBS 緩沖液洗細胞3次，每次10 min，用配制好的Alexa Fluor 594 標記山羊抗兔IgG 與Alexa Fluor 488 標記山羊抗小鼠IgG 滴加在細胞面，37℃避光孵育1 h，PBS 緩沖液洗細胞3次，每次10 min;加適量的DAPI避光靜置孵育10 min，PBS 緩沖液洗細胞3次后70%甘油封片.共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.4 GST-RI融合蛋白的誘導(dǎo)表達及純化:將pGEX-4T-RI 或pGEX-4T-1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 菌株，挑取單菌落接種于LB(含Amp)培養(yǎng)基中，150 r/min、37℃搖床過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)入2×YTA(含Amp)培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)3 h至A600≈0.6～0.8，分別加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)3 h.離心收集菌體，加入1 mL 預(yù)冷的PBS 重懸菌體，冰浴超聲破碎(工作4 s，間歇6 s，超聲時間10 min)，離心收集上清，樣品進行10%SDS-PAGE 分離后用考馬斯亮藍染色鑒定融合蛋白表達。證實融合蛋白有正確表達后，大量搖菌誘導(dǎo)融合蛋白表達，冰浴超聲破碎菌體離心收集上清，按1 mL 上清加入10 μL的Glutathione sepharose 4B的比例于4℃孵育過夜，將混合液1 000×g 離心5 min，預(yù)冷PBS 洗滌3次，每次5 min，收集Glutathione sepharose 4B，用50 mmol/L Tris-HCl(pH =8.0)的還原型谷胱甘肽洗脫液洗脫珠子，1 000×g離心5 min，收集上清進行SDS-PAGE 分析，利用考馬斯亮藍染色法和蛋白印跡法檢測純化效果。

1.2.5 GST 融合蛋白沉降實驗:人膀胱癌BIU-87細胞接種于細胞瓶，待增殖至80%匯合左右時按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 說明書進行操作，分別將pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R、pCMV-3×flag、pCMV-3×flag-ANG 轉(zhuǎn)染BIU-87 細胞48 h后收集細胞，加入1 mL 預(yù)冷細胞裂解液，冰上裂解30 min，離心取上清。向上述蛋白中加入處理過的Glutathione sepharose 4B，4℃孵育過夜離心收集上清。將上清加入結(jié)合有GST-RI 或GST 蛋白的Glutathione sepharose 4B 中，4℃搖床孵育2 h，3 000 r/min離心，棄上清，預(yù)冷PBS 洗滌3次，每次1 min，小心吸棄上清，加，1×loading 緩沖液，100℃加熱10 min，Western blot檢測蛋白表達。

1.2.7 免疫共沉淀:人膀胱癌BIU-87 細胞接種于細胞瓶，將pcDNA3.1-myc-RI 或pcDNA3.1-myc 和pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R兩質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，48 h后收獲細胞，提取蛋白并加入2 μg的Myc 抗體，4℃孵育過夜，再加入充分重懸的protein A/G agarose，4℃孵育3 h，3 000 r/min離心5 min，收集瓊脂糖珠抗原抗體復(fù)合物，PBS 洗滌沉淀5次，去除上清，加入1×SDS-PAGE 電泳上樣緩沖液，混勻離心，100℃煮沸10 min，Western blot檢測分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pCMV-3×flag-ANGH13R 和pCMV-3×flag-ANGH114R突變體質(zhì)粒的鑒定

雙酶切電泳結(jié)果顯示，約6 400 bp 處條帶為pCMV-3×flag 質(zhì)粒，約500 bp 處條帶即為ANG 突變體，與PCR 結(jié)果吻合(圖1)。測序結(jié)果分析也表明突變體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 pCMV-3×flag-ANGH13R和pCMV-3×flag-ANGH114R突變體質(zhì)粒的酶切鑒定Fig1 The expressing plasmid pCMV-3×flag-ANGH13R and pCMV-3×flag-ANGH114R was verified by restriction double enzyme digestion(Hind Ⅲand BamHⅠ)

2.2 RI 和pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R蛋白在BIU-87 細胞中存在共定位

兩突變體蛋白主要在胞質(zhì)中表達，RI 蛋白的表達也主要位于細胞的胞質(zhì)，兩者融合后可觀察到有黃色的區(qū)域出現(xiàn)，用DAPI 標染細胞系，可以發(fā)現(xiàn)RI 和pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R蛋白在BIU-87 細胞胞質(zhì)有明顯的顏色融合(圖2)

圖2 RI 與ANG 突變體蛋白在BIU-87 細胞中的共定位Fig2 The co-localization between RI and ANG mutant in BIU-87 cells (×400)

2.3 GST-RI融合蛋白的表達及純化的鑒定

經(jīng)sepharose 4B gel 純化后的GST 和GST-RI融合蛋白分別在26和76 ku 處有特異性條帶(圖3)

圖3 GST 和GST-RI融合蛋白考馬斯亮藍染色及Western blot檢測結(jié)果Fig3 The result of GST and GST-RI fusion protein coomassie brilliant blue staining and Western blot

2.4 GST pull down 結(jié)果

pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R和pCMV-3×flag-ANG 蛋白能與GST-RI融合蛋白結(jié)合并被沉降下來;pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R和pCMV-3×flag-ANG 蛋白在BIU-87 細胞內(nèi)的表達也基本一致(圖4)。

圖4 RI 與ANG 及其突變體蛋白的GST-pull down 檢測結(jié)果Fig4 Verification of interaction between RI and pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R by GST-pull down

2.5 免疫共沉淀證明RI 與ANG 突變體的相互作用

pcDNA3.1-myc-RI 和pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R共轉(zhuǎn)染后，用anti-Flag 抗體于免疫復(fù)合物中可檢測到ANG 突變體蛋白的存在(圖5)。

圖5 免疫共沉淀實驗鑒定RI 與ANG 突變體蛋白間的相互作用Fig5 Verification of interaction between RI and pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R by co-immunoprecipitation assay

3 討論

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)在生命活動中扮演著重要的角色。ANG促血管生成和腫瘤細胞的增殖效應(yīng)的發(fā)揮依賴于ANG 與其他蛋白的相互作用。已知的和ANG 相互作用的蛋白有很多，RI 便是其中之一[4]。RI 富含亮氨酸重復(fù)序列(LRRs)，在含有該序列結(jié)構(gòu)的蛋白中，很多都是通過該區(qū)域進行蛋白質(zhì)間的相互作用。RI在膀胱癌細胞中過表達之后能顯著抑制動物新生血管的生成[5-6]，同時還能抑制RNAse 活性。實驗中pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R兩突變體與RI的相互作用和野生型的pCMV-3×flag-ANG 與RI的相互作用相比存在一定的差異(圖4)。前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)過表達RI，ANG 在mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平上都存在表達的下降，并在一定程度上抑制了血管內(nèi)皮細胞的增殖及遷移，并發(fā)現(xiàn)兩者在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)內(nèi)存在結(jié)合[7]。過表達RI 可以抑制人膀胱癌T24 細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT 發(fā)生[8]。眾所周知，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移很大程度上依賴于腫瘤新生血管為其提供基礎(chǔ)物質(zhì)，而腫瘤血管的新生與ANG 之間存在很大關(guān)系，RI 抑制人膀胱癌T24細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT的發(fā)生機制還未闡明，故通過RI 和ANG 突變體之間的相互作用進一步揭示膀胱癌在其發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)上的機制和關(guān)系。下調(diào)RI 體內(nèi)可促進腫瘤生長和人膀胱癌BIU-87 細胞轉(zhuǎn)移潛能，體外促進BIU-87 細胞的侵襲遷移能力[9]，同時也能夠明顯的增加T24 細胞的侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的能力[10]。干擾ANG 能有效降低ANG的表達，顯著抑制膀胱癌T24 細胞的增殖，調(diào)節(jié)凋亡關(guān)鍵蛋白的表達[11]。通過構(gòu)建ANG 突變體研究RI 與ANG 突變體相互作用來進一步探索兩者是通過怎樣形式結(jié)合或者相互作用影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。后續(xù)的工作將圍繞RI 與ANG 突變體相互作用在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)影響來進行，為下一步探索兩者相互作用的分子機制奠定基礎(chǔ)。

ANG 可以通過核轉(zhuǎn)位和激活PI3K/AKT/mTOR信號通路[12]來刺激腫瘤的生長和發(fā)展，RI 與ANG突變體的相互作用可能會在一定程度上通過這兩個方式來實現(xiàn)，因此，接下來將對其生物學(xué)方面進行研究，繼續(xù)探討RI 與ANG 相互作用的意義為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)，為腫瘤的治療提供科學(xué)依據(jù)。

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