茍冶然，龍小濱，白 磊，何 泉，陳 檢，張紹城，汪德強*，周建中*

(重慶醫(yī)科大學1.附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科;2.感染病性疾病分子生物實驗室，重慶400000)

葡激酶(staphylokinase，SAK)作為臨床溶栓治療的一線用藥，是由金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體合成的一種蛋白質(zhì)，不僅具有高效的纖溶活性和纖維蛋白專一性，且不會引起全身纖溶亢進[1]，免疫原性及血管開通后再梗塞是限制其臨床使用的主要原因[2-3]。

研究發(fā)現(xiàn)利用基因融合構(gòu)建的融合蛋白一般均保留所構(gòu)成的酶分子各自的酶活性[4]，因此推測如果將重組葡激酶與人α微球蛋白(α1M)及RGD(Arg-Gly-Asp)序列進行融合，所得的融合蛋白RGD-rSAKα1M 不僅具有高效的溶栓活性，并且借助α1M的免疫保護作用[5]降低SAK的免疫原性，還可通過RGD的抗血小板聚集作用[6-7]來降低其溶栓后再梗塞率，從而有效地解決臨床上應用SAK 所面臨的兩大關鍵問題?；诒菊n題組的前期工作[8-10]，本研究擬構(gòu)建RGD-rSAK-α1M 重組蛋白表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達，純化后鑒定其生物活性，為研發(fā)一種新型低免疫原性溶栓劑提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

重組葡激酶(rSAK)、人α微球蛋白截短體(α1M)、RGD 短肽、大腸桿菌DH5α、BL21、質(zhì)粒PEGX-6P-1 和3C蛋白酶(本實驗室提供)。高保真rTaq 酶、dNTP、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、Not Ⅰ、DNA Marker、分子量蛋白Marker 和質(zhì)粒純化試劑盒(Takara 公司)。質(zhì)粒提取試劑盒(Promega 公司)。纖溶酶原、凝血酶、尿激酶標準品和纖維蛋白原(中國食品藥品檢定院)。其它相關試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重疊延伸PCR:在本實驗室所構(gòu)建的人α微球蛋白基因、重組葡激酶的基礎上，設計重疊延伸引物，測序結(jié)果如表1所示。

rSAK的正反向引物分別為SAK-F 與重疊引物overlap-R，其中SAK-F 中加入了RGD 四肽序列(粗體部分)，SAK-F 下劃線斜體字代表限制性內(nèi)切酶Sal Ⅰ的酶切位點;α1M的正反向引物分別為重疊引物overlap-F 與α1M-R，其中重疊引物斜體部分的18個堿基序列與重組葡激酶C端的相應堿基序列同源，α1M-R 下劃線斜體字代表的酶切位點為限制性內(nèi)切酶Not Ⅰ，α1M-R 和SAK-F 反向互補。為了SAK 與α1M的功能結(jié)構(gòu)域的折疊不互相影響，重疊延伸引物(overlap F 和overlap-R)引入了GSG 連接序列(linker sequence，波浪線部分)。用引物SAK-F和overlap-R 對重組葡激酶模版PCR擴增，同時采用重疊引物overlap F及α1M-R 對α1M 蛋白PCR擴增，實驗條件均設定為:預變性(94℃，10 min)，變性(94℃，1 min)，退火(50℃，1 min)，延伸(72℃，55 s)，循環(huán)30次。上述兩組PCR 產(chǎn)物膠回收方法見文獻[11]，純化膠回收產(chǎn)物后以1∶1 比例進行混合作為模版，將SAK-F 與α1M-R 作為正反向引物擴增PCR，反應條件同上。重疊延伸PCR 示意圖如圖1所示。

表1 重疊延伸PCR引物Table1 The primers of overlapping PCR

1.2.2 表達質(zhì)粒的構(gòu)建:將實驗室構(gòu)建并保存好的PEGX-6P-1 質(zhì)粒同正確測序的重疊延伸PCR 產(chǎn)物在37℃水浴條件下同時進行Sal Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切3 h，使用T4DNA 連接酶將目的和載體基因在16℃金屬浴中過夜連接。

1.2.3 克隆菌的轉(zhuǎn)化:連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌(E.coli)DH5α 感受態(tài)細胞中，接種于氨芐抗性LB平板上，放置于37℃溫箱中過夜。

1.2.4 陽性轉(zhuǎn)化菌種篩選及雙酶切鑒定:從轉(zhuǎn)化后的LB 平板上挑選多個單克隆菌，依次接種于LB 培養(yǎng)基中(5 mL 氨芐抗性)，放置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，200 r/min)至A600為0.2，取出將菌液作為模板進行PCR 反應。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，從而篩選陽性單克隆菌。依照試劑盒說明書上的操作步驟，將陽性結(jié)果的菌液繼續(xù)過夜培養(yǎng)至A600為0.8～1.0，取出提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒以Sal Ⅰ和Not Ⅰ進行雙酶切(37℃，4 h)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定雙酶切結(jié)果。酶切結(jié)果陽性的重組質(zhì)粒送本實驗室(重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學實驗室)測序中心測定核苷酸序列并與目的基因片段比對。

1.2.5 轉(zhuǎn)化表達菌及誘導表達融合蛋白:根據(jù)雙酶切鑒定結(jié)果選取陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21，再接種于LB 平板上(氨芐抗性)，放置于37℃溫箱中過夜孵育。從恒溫箱中孵育后的LB 平板上挑選多個單克隆菌，依次接種于LB 培養(yǎng)基中(300 mL 氨芐抗性)，放置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，200 r/min)至A600值為0.4～0.6，加入IPTG(終濃度為0.2 mmol/L)后放入搖床于18℃低溫誘導20 h。

圖1 重組葡激酶和人α微球蛋白的重疊延伸PCRFig1 Overlapping PCR of recombinant SAK and α1M

1.2.6 His-GST 融合蛋白的酶切和目的融合蛋白的純化:(4℃，4 000 r/min)離心15 min 收集菌體，加入PBS(0.1 mmol/L，pH 7.4)、NaCl(300 mmol/L)攪拌均勻，冰浴中超聲破菌儀破菌至菌液清亮。破菌后(4℃，12 000 r/min)離心30 min 收集上清液，以7 滴/s低速過鎳柱，留取穿透液。先采用10 柱體積PBS(0.1 mmol/L，pH 7.4)洗脫雜蛋白，然后用咪唑溶液(100 mmol/L)來洗脫含His-GST 標簽的融合蛋白，結(jié)果用SDS-PAGE 蛋白電泳驗證。重新挑菌誘導破菌離心取上清液過鎳柱，以PBS(0.1 mmol/L，pH 7.4)10 柱體積洗脫雜蛋白，向鎳柱中加入終濃度為1 g/L的3C蛋白酶(酶切緩沖液配比:150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，pH 7.0)放置于冰箱4℃酶切8～12 h，將收集的洗脫液用SDS-PAGE 電泳分析。洗脫液過DEAE柱，SDS-PAGE 蛋白電泳驗證結(jié)果，超濾DEAE-葡聚糖凝膠所得到的所有含目的融合蛋白的洗脫液至1 mL。用分子篩(Superdex 75)繼續(xù)純化濃縮樣品，洗脫曲線通過電腦記錄，依次選取洗脫峰尖附近所對應的蛋白進行取樣，結(jié)果通過SDS-PAGE 蛋白電泳驗證。電泳完成后，用抗SAK 和抗α1M的抗體分別進行免疫印跡(Western blot)方法見文獻[12]。驗證后將相應的目的蛋白樣品用等體積超濾緩沖液(5 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，50 mmol/L NaCl)進行超濾濃縮至濃度為1 g/L，分裝后置于－80℃保存。

1.2.7 融合蛋白的溶栓活性鑒定:用纖維平板溶圈法[9]。用尿激酶標準品活性的對數(shù)和溶圈直徑的對數(shù)做一標準曲線，通過測量各蛋白樣品融圈的橫徑和豎徑，計算其融圈直徑d =橫徑+豎徑/2，將d帶入建立的回歸方程計算各種樣品的溶栓活性。

1.2.8 抑制血小板聚集實驗:取20mL 用枸櫞酸鈉(3.8%濃度，0.1 體積)處理過的新鮮人血液，用離心機以1 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，然后取離心后上清即富血小板血漿(PRP)，取300 μL 加入20 μL待測樣品，放置于恒溫箱中37℃，繼而加入致聚劑ADP 使其終濃度為10 μmol/L，在490 nm 波長處采用血小板聚集儀測定透射率，依據(jù)光透射率的增加量來測算出血小板的聚集率。血小板聚集抑制率計算方法如下:li% = (PAGmblank-PAGmCi/PAGmblank)×100% (PAGmblank代表空白最大血小板聚集率，PAGmCi代表相應藥物最大血小板聚集率)。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白的克隆

以本實驗室保存的重組葡激酶rSAK、人α微球蛋白的表達載體為模版進行PCR擴增，凝膠回收后進行重疊延伸PCR，其產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果(圖2)顯示:同預期結(jié)果一致，出現(xiàn)了單一特異性條帶在1 000 bp附近。

圖2 融合蛋白的重疊延伸PCRFig2 overlapping PCR of fusion protein

2.2 構(gòu)建表達質(zhì)粒與測定序列

重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果可見載體片段與重疊延伸PCR 產(chǎn)物片段(1 000 bp)(圖3)。重組質(zhì)粒測序結(jié)果與目的基因片段對比顯示:基因片段連接完全正確，未發(fā)生錯位及突變。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig3 Restriction analysis of the recombinant plasmid

2.3 表達與純化目的蛋白

超聲破菌所得上清液的SDS-PAGE 結(jié)果顯示，目的融合蛋白在大腸桿菌(E.coli)BL21 中大量表達，且以可溶性蛋白形式表達(圖4，泳道2)。用目的蛋白洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫His-GST 標簽的融合蛋白，仍然含有大量雜蛋白，以相對分子量(Mr)在26 000 處最明顯(圖4，泳道4)。以1 g/L的3C蛋白酶進行過夜酶切后，所得目的融合蛋白大小與預期一致，大約在相對分子量(Mr)36 000 處(圖4，泳道5)。DEAE 層析柱進一步純化，可見一明顯的目的蛋白洗脫峰(圖5)。收集相應洗脫液超濾濃縮后SDS-PAGE 驗證(圖4，泳道6)。分子篩(Superdex 75)進一步純化，洗脫曲線如圖6所示。SDS-PAGE 鑒定洗脫峰尖組分所含蛋白，純化度達90%以上(圖4，泳道7)。洗脫體積為67 mL，按計算公式:log WM= －0.015 4 Ve+5.586 06(Ve 為洗脫體積)計算，融合蛋白的表觀分子量約為36 ku。電泳完成后，用抗SAK 和抗α1M的抗體分別進行免疫印跡(Western blot)驗證，結(jié)果如圖7所示，獲純度達90%以上的目的融合蛋白。

圖4 融合蛋白的表達與純度鑒定Fig4 Expression and purity identfication of the fusion protein

圖5 DEAE 交換柱層析圖Fig5 Chromatogram of DEAE ion exchange column

2.4 融合蛋白溶栓活性鑒定

纖維蛋白平板溶圈法鑒定結(jié)果如圖8所示。重組葡激酶與尿激酶標準溶栓活性相當，且在rSAK中加入人α微球蛋白及RGD 短肽序列沒有明顯降低葡激酶的纖溶活性(表2)。

圖6 分子篩柱層析圖Fig6 Chromatogram of molecular sieve column

2.5 抗血小板聚集活性的測定

測定結(jié)果表明RGD-rSAK-α1M 與相應濃度的rSAK 相比，具有顯著抑制ADP 激活血小板聚集的作用(P＜0.01)，與單獨使用相應濃度的RGD 無明顯差異(圖9)，同時，表明其抗血小板聚集活性具有一定的劑量效應依賴關系。

圖7 RGD-重組葡激酶-人α微球蛋白免疫印跡結(jié)果Fig7 Western blot result of RGD-recommbinat SAK-α1M

圖8 目的蛋白纖溶活性效果圖Fig8 Fibrinolytic activity of target protein

表2 目的蛋白比活性對比圖Table2 The comparison of thrombolytic activity

圖9 抗血小板聚集活性效果圖Fig9 The anti-platelet aggregation activity(±s，n=3)

3 討論

葡激酶(staphylokinase，SAK)是一種具有極大臨床應用前景的新型溶栓制劑，與尿激酶(urokinase，UK)、內(nèi)生組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)相比，具有更高的纖溶活性和纖維蛋白專一性，溶栓后出血并發(fā)癥少[13]。但作為一種葡萄球菌來源的異體蛋白，進入機體后誘發(fā)的免疫反應及溶栓后可能再次梗塞限制了其日常的預防和恢復治療的應用。國內(nèi)外許多個研究已通過定點突變、化學修飾及構(gòu)建融合蛋白等方法，對SAK 進行結(jié)構(gòu)改造研究，以期降低其免疫原性及溶栓后再梗率。

應用OptimumGeneTM基因優(yōu)化技術(shù)優(yōu)化SAK 基因序列，并采用重疊延伸PCR 技術(shù)，在遠離SAK 活性位點的部位連接上α1M 基因片段，構(gòu)建出新的融合蛋白表達質(zhì)粒PEGX-6P-1-RGD-rSAK-α1M，在大腸桿菌BL21 上清液中表達。所表達的融合蛋白N端帶有His-GST 標簽蛋白，可被3C蛋白酶特異性地識別并裂解去除，最后通過DEAE 和分子篩(Superdex 75)純化，使目的融合蛋白的純度達90%以上，并經(jīng)Western blot 驗證。本實驗曾嘗試構(gòu)建rSAKRGD-α1M 及rSAK-α1M-RGD 融合蛋白，結(jié)果均以包涵體形式表達，這可能是因為這兩種融合表達有較大的疏水表面暴露，導致了融合蛋白質(zhì)的寡聚化，進而形成包涵體。目前融合蛋白的構(gòu)建已在蛋白分子結(jié)構(gòu)改造中顯示出一定的優(yōu)勢，大量研究證實，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建的新的融合蛋白，一般均保留有各組分酶分子各自的酶活性，這為葡激酶的改造提供了新的思路。通過纖維蛋白平板溶圈法測定目的融合蛋白的體外溶栓活性及血小板聚集儀測定其抗血小板聚集活性的結(jié)果證明，本研究構(gòu)建的融合蛋白RGD-rSAK-α1M 保留了SAK的溶栓活性，且其抗血小板聚集作用較單純重組葡激酶明顯提高。下一步試驗中將通過動物模型驗證該融合蛋白是否能借助α1M的免疫保護機制來降低葡激酶的免疫原性，同時驗證是否通過RGD 降低了葡激酶出血副反應及溶栓后再梗塞率。RGD-rSAK-α1M是一種新型SAK 融合蛋白，具有溶栓、抗栓雙重功能，有望成為心腦血管疾病溶栓的第3代藥物。

[1]劉超龍.重組葡激酶靜脈溶栓療法在老年急性心肌梗死治療中的臨床應用價值分析[J].中國當代醫(yī)藥，2012，19:187-189.

[2]Chen Y H，Song G，Jiang F，et al.Crystal structure of a staphylokinase:variant a model for reduced antigenicity[J].Eur J Biochem，2002，269:705-711.

[3]Ohman EM，Harrington RA，Cannon CP，et al.Intravenous thrombolysis in acute myocardial infarcion[J].Chest，2001，119:252-277

[4]Kotb E.The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombi[J].Biotechnol Prog.2014 May;30(3):656-72.doi:10.1002/btpr.1918.Epub 2014 May 7.

[5]Grewal JS，Tsai JY，Khan SR，et al.Oxalate-inducible AMBP gene and its regulatory mechanism in renal tubular epithelial cell[J].Biochem J，2005，387(Pt3):609-616.

[6]Zhang JG，Krajden OB，Kainthan RK，et al.Conjugation to heperbranched polyglycerols improves RGD-mediated inhibition of platelet function in vitro.Bioconjug Chem，2008，19:1241-7.

[7]景麗麗，周建中，張良珂.RGD 靶向溶栓藥物的研究進展[J].心血管病學進展.2010，31:209-212.

[8]楊可，楊震，王德強，周建中，等.重組葡激酶的表達純化及纖溶活性鑒定[J].重慶醫(yī)科大學學報，2012，37:232-235.

[9]陳檢，楊可，王德強，周建中，等.重組葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表達、純化及鑒定[J].細胞與分子免疫學雜志，2012，28:1208-1211.

[10]Zhang Y，Gao Z，Zhang Z，et al.Cloning，purification，crystallization and preliminary X-Ray sstudies of human α1-microglobulin[J].Acta Crystallogr Sect F Stryc Biol Cryst Commun，2012，68(pt 6):692-694.

[11]徐珍，張玉芹，聶永莉.不同酶切體系對膠回收純化DNA濃度的影響[J].醫(yī)學研究雜志，2010，39:54-57.

[12]Sugimoto K，Ohkawara H，Nakamura Y，et al.Receptor for advanced glycation end products-membrane type1 matrix metalloproteinase axis regulates tissue factor expression via RhoA and Rac1 activation in high-mobility group Box-1 stimulated endothelial cells[J].US National Library of Medicine National Institutes of Health，2014，9.

[13]Kowalski M，Brown G，Bieniasz M，et al.Cloning and expression of a new recombinant thrombolytic and anthithrombotic agent-a staphy-lokinase variant[J].Acta Biochimica Polonica，2009，56:41-53.