唐 旺，李長龍，杜小燕，陳振文

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069）

PMSG和hCG誘導長爪沙鼠超數排卵方案的優(yōu)化

唐 旺，李長龍，杜小燕，陳振文

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069）

目的優(yōu)化PMSG和hCG誘導長爪沙鼠超數排卵方案。方法通過對動物周齡、激素劑量和間隔時間等系統(tǒng)研究，優(yōu)化出用于長爪沙鼠超數排卵的最佳動物周齡、激素組合劑量和間隔時間。結果 對6周齡長爪沙鼠使用10單位激素計量及間隔70 h可以獲得最佳超數排卵效果。在合籠16 h后80%的動物得以排卵，獲卵數為32．6±3．0枚/只，其中24．8±5．4枚/只可以發(fā)育至二細胞胚胎。結論本研究獲得了利用PMSG和hCG誘導長爪沙鼠超數排卵的優(yōu)化方案，為長爪沙鼠胚胎生物技術研究奠定了基礎。

長爪沙鼠;超數排卵;孕馬血清促性腺激素;人絨毛膜促性腺激素

長爪沙鼠是源自中國的實驗動物，隨著對長爪沙鼠實驗動物化研究的不斷深入，長爪沙鼠的應用領域不斷擴大，培育的長爪沙鼠模型品種也逐漸增多［1－9］。為了保存這些珍貴的動物資源，人們除了加強活體保種外，為了確保種子安全，還要開展動物胚胎冷凍保存［10］。這就需要更多的長爪沙鼠胚胎來源，超速排卵為解決胚胎來源提供了最有效途徑［11］。近年來隨著應用長爪沙鼠開展更為深入的研究，制作轉基因和基因敲除動物已成為迫切需求，應用長爪沙鼠開展特殊生物學特性的發(fā)育生物學研究也備受重視。但這些研究無不需要以長爪沙鼠胚胎為實驗材料，因此超數排卵就成了關鍵技術。雖然超數排卵在小鼠、金黃地鼠、大鼠等多種實驗動物已成為成熟技術，但在長爪沙鼠尚存在許多疑慮，國內外對長爪沙鼠超數排卵方案研究中鮮有較為穩(wěn)定高效的報道，在使用動物的周齡、激素劑量及間隔時間等也存在較大差異［12－14］，極大地阻礙了應用長爪沙鼠開展科學研究的進程和保種規(guī)劃的實施。本研究擬利用首都醫(yī)科大學飼養(yǎng)的長爪沙鼠通過對動物周齡、激素劑量及間隔時間的對比研究，優(yōu)化出高效穩(wěn)定的長爪沙鼠超數排卵方案。通過本研究不但可為長爪沙鼠資源冷凍保存奠定基礎，而且將加速應用長爪沙鼠開展科學研究的進展，擴大其在生命科學研究及生物醫(yī)藥產業(yè)中的應用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性普通級長爪沙鼠200只，10周齡以下，體重30～60 g;雄性普通級長爪沙鼠50只，10～12周齡，體重60～80 g。所有長爪沙鼠均來自首都醫(yī)科大學實驗動物部，飼養(yǎng)于控制溫濕度的普通環(huán)境中【SYXK(京）2013－0005】。

1.2 試劑和儀器

孕馬血清促性腺激素(PMSG）購自寧波第二激素廠(批號：140324），人絨毛膜促性腺激素(hCG）購自寧波第二激素廠(批號：140322），M2培養(yǎng)基(M7167，Sigma），M16培養(yǎng)液(M7292，Sigma），透明質酸酶(H1136，Sigma），生理鹽水，75%酒精等。35 mm無菌塑料培養(yǎng)皿，體視顯微鏡，倒置顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，滅菌手術器械(眼科剪、眼科鑷、顯微剪和顯微鑷等）。

1.3 實驗設計

1．3．1 動物周齡的優(yōu)化

隨機挑選5、6、7、8、9、10周齡的長爪沙鼠，每組20只，注射劑量為10 IU PMSG/hCG。激素注射間隔時間50 h，激素注射方式為腹腔注射，注射hCG后合籠，次日檢查陰道栓并取卵。

1．3．2 激素劑量的優(yōu)化

隨機將12只6周齡雌性沙鼠分為4組，每組3只，劑量分別為5、10、20、30 IU的PMSG/hCG。激素注射間隔時間50 h，激素注射方式為腹腔注射，注射hCG后合籠，次日檢查陰道栓并取卵。

1．3．3 激素間隔時間的優(yōu)化

隨機將60只6周齡雌性沙鼠分為3組，每組20只，劑量為10 IU的PMSG/hCG。激素注射間隔時間分別為50 h、70 h和90 h，激素注射方式為腹腔注射，注射hCG后合籠，次日檢查陰道栓并取卵。

1.4 取卵步驟

注射hCG后并與雄鼠合籠16～17 h后，在漏底飼養(yǎng)籠下托盤上檢查陰道栓脫落情況，并將超數排卵使用的雌性長爪沙鼠脫頸處死，俯臥噴灑75%酒精，打開背側腹腔，分別取出兩側輸卵管和卵巢置于盛有M2培養(yǎng)液液滴的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下，用顯微鑷撕開輸卵管膨大的壺腹部，釋出卵母細胞－卵丘細胞復合體，重復檢查確保將所有卵母細胞取出。將卵母細胞－卵丘細胞復合體收集到含有0．1%透明質酸酶的M2液滴中，處理3～5 min，移入M2液滴中，洗滌3次，在體視顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察，計算卵母細胞數;移入M16液滴中，放入CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，次日統(tǒng)計二細胞胚胎數。

1.5 統(tǒng)計學分析

對于不同激素劑量、不同周齡以及不同激素間隔時間各組間的比較，采用單因素方差分析方法進行統(tǒng)計學分析，P ＜0．05的值在統(tǒng)計學上具有顯著性差異。

2 結果

2.1 動物周齡對超數排卵的影響

通過注射10 IU激素劑量，激素間隔時間為50 h，對不同周齡(10周齡及以下）長爪沙鼠進行超排，結果顯示：5及以下周齡長爪沙鼠沒有檢查到陰道栓，取卵數為0;9～10周齡動物獲得平均7．1～7．6枚卵;6～8周齡鼠的動物平均每只獲得14．6～17．5枚卵。統(tǒng)計結果表明，6～8周齡動物超數排卵數量顯著高于與9～10周齡動物(P ＜0．05）;6周齡超數排卵率為80%，明顯高于其他周齡組(表1）。

2.2 激素劑量對超數排卵的影響

激素劑量是超數排卵的重要影響因素。通過腹腔注射激素，激素間隔時間50 h，對6周齡長爪沙鼠激素劑量優(yōu)化，結果如表2所示，5 IU激素劑量不能促進長爪沙鼠排卵，取卵數為0;10～30 IU激素劑量均能產生超數排卵效應，其中10 IU劑量組獲得55枚卵，每只平均取卵數為27．5枚。5 IU激素劑量組未檢測到陰道栓，在輸卵管也未發(fā)現排卵現象。10 IU以上劑量組均有排卵現象，排卵數隨著激素劑量的升高而降低。

表1 不同周齡長爪沙鼠注射10IU PMSG和hCG間隔50 h超數排卵效果比較Tab．1 Comparison of effects of different weeks old of Mongolian gerbils injected 10 IU PMSG and hGG at 50 hours intervals to superovulation

表2 不同劑量PMSG和hCG注射間隔時間50 h 6周齡長爪沙鼠超數排卵效果比較Tab．2 Comparison of effects of different dosages of PMSG and hGG injected at 50 hours intervals to superovulation in 6－weeks－old Mongolian gerbils

表3 不同間隔時間10 IU PMSG和hCG注射6周齡長爪沙鼠超數排卵情況比較Tab．3 Comparison of effects of different time interval of 10 IU PMSG and hGG injected to superovulation in 6－week－old Mongolian gerbils

2.3 激素給予間隔時間對超數排卵的影響

兩種激素給予間隔時間對超數排卵有很大的影響。通過10 IU激素劑量，對6周齡長爪沙鼠給予2種激素的間隔時間50 h、70 h和90 h觀察超速排卵效果，結果如表3所示，90 h未能達到超數排卵效果，平均取卵數僅為3枚;70 h獲得最佳的超數排卵效果，平均取卵數為32枚(圖1 A），發(fā)育至2－細胞(圖1 B）也更多，卵發(fā)育率由43%提高到76%，顯著優(yōu)于50 h和70 h組(P ＜0．05），圖1顯示取得的卵及其發(fā)育的2－細胞。

3 討論

排卵是由一系列極其復雜的生理過程累積而產生的結果，影響因素諸多，包括動物遺傳特性、體況、營養(yǎng)狀態(tài)、年齡、發(fā)情周期、卵巢功能、季節(jié)、溫度以及激素等［15］。野生和實驗室培育的長爪沙鼠均為“一雌一雄”長期同居的繁殖方式，一只死亡后另一只很難形成繁殖單元，強行合籠繁殖則導致嚴重爭斗致死［16－17］。長爪沙鼠的這種習性為后期配對增加了難點。為了克服這一問題，我們將離乳(4周）幼鼠雌雄分籠飼養(yǎng)，并且雄鼠(8周齡）單籠飼養(yǎng)，待實驗時，挑選合適周齡，并在注射激素后合籠，該方法可有效減少長爪沙鼠之間爭斗行為。

腹腔注射PMSG/hCG是一種有效地誘導長爪沙鼠超數排卵的方法。由于選擇動物隨機性，固定的發(fā)情周期對激素的作用會產生一定影響。年輕動物發(fā)情周期正在建立，機體自身分泌激素量少，容易受外界激素影響，此時注射激素可以降低動物自身激素對研究結果的影響。10周齡以上的長爪沙鼠在誘導超數排卵時，由于體內激素影響，不僅排卵數目少(少于10枚），并且超數排卵極不穩(wěn)定，超數排卵率也低于40%，在增加激素量后也未見較好效果，故未統(tǒng)計在實驗數據中。超排長爪沙鼠9～10周齡接近性成熟，發(fā)情周期趨于穩(wěn)定，超數排卵受本身激素影響較大;5周齡及以下的雌鼠其卵巢發(fā)育未成熟，卵巢不具備排卵的能力，而6～8周齡雌鼠具備較好的超數排卵條件［12，18－19］，實驗結果也表明該年齡段可獲得良好的超數排卵效果，尤其在6周段，雌鼠超數排卵不僅排卵數目較高，而且超數排卵成功率(80%）極高。

圖1 采集的卵及發(fā)育的2－細胞胚胎Note：A：The digested eggs(×6）; B：The fertilized eggs developed to 2－cell embryos(×11．5）．Fig．1 The collected eggs and the developed 2－cell embryos

超數排卵對PMSG/hCG的注射劑量有一定要求，已有的研究報道中長爪沙鼠超數排卵使用的激素劑量范圍較大(10 ～40 IU）［12－14］，參考價值較低。一般認為激素劑量過低，不能引起機體對激素的反應，或者不能抵御自身發(fā)情周期所分泌的激素影響;而激素劑量過高，機體對激素負反饋調節(jié)效應增強，抑制機體對激素產生效應;10～20 IU激素劑量能較好地克服自身發(fā)情周期影響，且不引起強烈的激素負反饋調節(jié)效應，能高效地誘導長爪沙鼠超數排卵效果［12－14，18－19］。本研究中優(yōu)化了激素劑量，發(fā)現10 IU PMSG/hCG可以有效誘導6～8周齡長爪沙鼠超數排卵。如果實驗過程中使用年齡和體重較大的動物，可適當增加激素劑量，以提高超數排卵效率［12，14］。

激素給予間隔時間也是超數排卵的重要影響因素。長爪沙鼠發(fā)情周期為4～6 d，PMSG/hCG的注射間隔時間需要探討。激素間隔時間過短，PMSG促進卵泡發(fā)育尚未達到最高效應，超數排卵后收集的卵較少;激素注射時間過長，PMSG效應減退，不能起到超數排卵效果［12－13］。本實驗結果發(fā)現，PMSG/hCG的最佳間隔時間為70 h，同時胚胎發(fā)育率也提高至76%。

本研究得到的長爪沙鼠高效穩(wěn)定的超數排卵方案為：6周齡雌鼠，PMSG/hCG的劑量為10IU，間隔時間為70 h，注射激素后立即與雄鼠合籠，在16～17 h后取卵。本實驗中，最多單只雌鼠能取得57枚卵，其中56枚見明顯原核(即受精卵），發(fā)育至2－細胞數占90%。本研究的優(yōu)化方案大大的提高了長爪沙鼠超數排卵效率，為長爪沙鼠資源保存和胚胎生物技術研究奠定了基礎。

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The optimization scheme of Mongolian gerbils superovulation induced by PMSG and hCG

TANG Wang，LI Chang－long，DU Xiao－yan，CHEN Zhen－wen
(School of Basic Medical Science，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective To optimize the scheme of Mongolian gerbil superovulation．Methods Based on the analysis of the animal－week－old，the dose and time interval of hormone，we got the best animal－week－old，dose and time interval of hormone for Mongolian gerbil superovulation．Results The 6 week old female Mongolian gerbils which injected of 10 IU PMSG and followed by 10 IU hCG in 70 hours later could get the best superovulation．We collected eggs at 16 hour after mate with male gerbils．The ovum pick－up rate reached 80%，the number of oocytes were 32．6±3．0，the number of the fertilized egg developed to 2－cell are 24．8±5．4．Conclusions This study summarizes the optimization scheme of Mongolian gerbil superovulation induced by PMSG and hCG and it supported the foundation for Mongolian gerbils embryo biotechnology．

Mongolian gerbil;Superovulation;PMSG;hCG

A

1671－7856(2015）07－0059－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．012

國家科技支撐計劃項目(2015BAI09B01;2011BAI15B01－32）;北京市自然基金重點課題(7141002）。

唐旺(1989－），男，碩士生，研究方向：實驗動物遺傳學，E－mail：522636161@qq．com。

陳振文(1959－），男，教授，博導，研究方向：實驗動物遺傳育種，E－mail：czwenteam@163．com。

2015－06－25