蒲艷

AnnexinⅡ在肝細胞癌中的表達

蒲艷

目的 研究鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)在肝細胞癌中的表達意義。方法 以肝細胞癌組織和非腫瘤肝組織進行抑制差減雜交技術(shù)(SSH), 構(gòu)建正、反向差減雜交文庫, 差減片斷的PCR產(chǎn)物制備cDNA芯片, 篩選出肝細胞癌組織中差異表達基因。使用熒光實時定量技術(shù)驗證芯片結(jié)果, 免疫組化方法分析AnnexinⅡ在肝細胞癌和正常肝組織中的表達。結(jié)果 AnnexinⅡ在肝細胞癌中呈現(xiàn)高表達,在肝細胞癌和癌旁肝硬化組織中也呈現(xiàn)高表達, 正常肝臟組織沒有表達, 低分化肝細胞癌中具有增高的趨勢。結(jié)論 在肝細胞癌的檢查和診斷期間, AnnexinⅡ可以作為檢測標(biāo)準(zhǔn)之一, 觀察患者肝細胞惡化或轉(zhuǎn)移、侵襲的情況。

肝細胞癌；鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ；免疫組化

本次研究主要針對肝細胞癌中的AnnexinⅡ表達情況,觀察不同患者之間的表達差異性, 分析AnnexinⅡ在肝細胞癌中的表達。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究選取本院病理診斷為肝細胞癌患者, 并進行肝移植手術(shù)1例, 同時選取肝癌組織和非腫瘤肝組織數(shù)塊, 將其放入液氮中在-70℃下進行保存, 選擇本院肝癌石蠟組織標(biāo)本79例, 其中男56例, 女23例, 年齡43～74歲, 平均年齡54歲?；颊叩母伟┌Y狀按照WHO劃分標(biāo)準(zhǔn)進行劃分, 其中Ⅰ級21例,Ⅱ級37例,Ⅲ級21例。選取(本院鑒定中心提供)正常肝石蠟組織8例, 其中男5例,女3例, 年齡43～77歲, 平均年齡54歲。

1.2 材料 研究使用的材料主要包括：美國Clontech公司提供的PCR-SelectTMcDNA Substraction Kit；美國Qiagene公司提供的mRNA磁珠法純化試劑盒、Sigma公司出產(chǎn)的Trizol；Promega公司生產(chǎn)的Rnaseinhibitor和M-MLV RT；A&B公司出產(chǎn)的SYBR Green PCR Master Mixture;武漢博士的公司出產(chǎn)的AnnexinⅡ多克隆抗體；福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司出產(chǎn)的Elicision Plus, 分析純試劑選用進口分裝。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建抑制差減雜交文庫 將100 mg的肝癌組織和非腫瘤肝組織分別放入1 ml Trizol當(dāng)中勻漿, 氯仿和異丙醇抽提, 之后對所抽提RNA的A260及A280進行測定, 計算A260除A280確定RNA的純度及質(zhì)量, 使用磁珠法純化試劑盒純化分離mRNA, 操作按照說明書的使用標(biāo)準(zhǔn)進行, 構(gòu)建差減雜交文庫, 將第二輪PCR擴增產(chǎn)物克隆進入pMD-18T載體, 轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細菌, 并使用藍白斑法篩選陽性克?。?］。

1.3.2 進行cDNA芯片的制作 擴增陽性克隆中的插入片段, 純化PCR產(chǎn)物后進行cDNA芯片制備, 為cDNA測序及同源性的分析, 將cDNA芯片結(jié)果顯示在肝癌組織中的差異表達克隆進行測序, 并使用Blast進行比對, 進一步分析在發(fā)生或肝癌發(fā)展當(dāng)中具有影響較大的基因。

1.3.3 分別提取、逆轉(zhuǎn)錄肝癌組織和肺腫瘤肝組織RNA 選取cDN.40 ng, 上下游引物各20 mol/L及2×SYBR Green PCR Master Mixtur.10 μl, 在蒸餾水不足反應(yīng)體系20 μl, 在實時熒光定量PCR儀ABI Prism 7000上進行。計算樣本中AnnexinⅡ的mRNA拷貝數(shù)相對量。免疫組化按照Elivision plus試劑盒的操作要求進行, PBS代替一抗體作為陰性對照參考, 使用Leica RX型圖像分析系統(tǒng)采集圖像分析免疫組化的結(jié)果, Qwin軟件識別陽性表達面積和積分灰度值, 每一張切片采集5個視野, 視野為×200, 其中陽性的表達面積比在5%以上,反之為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 本次研究使用SPSS18.00統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計數(shù)資料采用秩和檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用單因素分析, 兩兩比較采用SNK法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA的完整性 本次檢驗的RNA和mRNA的A260/A280＞1.8,研究成功構(gòu)建差減文庫, 插入的片段通過PCR的鑒定, 結(jié)果在96%以上的克隆都具有擴增產(chǎn)物, 產(chǎn)物在200～700 bp之間, 通過對肝細胞癌中的高表達克隆測序, 并對其進行Blastn比對, 發(fā)現(xiàn)一個與AnnexinⅡ同源性為100%的基因, 檢驗分析認定為AnnexinⅡ基因。通過熒光定量檢測, 肝癌組織中的AnnexinⅡ的mRNA拷貝數(shù)是非腫瘤肝組織的4.05倍。

2.2 免疫組織化學(xué) 通過肝細胞癌組織和癌旁肝硬化組織與正常肝組織進行比較, 結(jié)果AnnexinⅡ的陽性表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 其中肝細胞癌、癌旁肝硬化與正常肝組織比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 而癌旁肝硬化組織與正常肝組織差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 見表1。

2.3 在肝細胞癌組織和正常肝組織當(dāng)中的AnnexinⅡ表達陽性率比較當(dāng)中, 肝細胞癌與正常組織差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；而高中分化、中低分化、高低分化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 見表2。

表1 肝細胞癌組織、癌旁肝硬化組織與正常肝組織當(dāng)中的AnnexinⅡ表達陽性面積百分比及積分灰度值比較(s)

表1 肝細胞癌組織、癌旁肝硬化組織與正常肝組織當(dāng)中的AnnexinⅡ表達陽性面積百分比及積分灰度值比較(s)

注：在組別比較之間, 肝細胞癌與正常肝組織相比,aP＜0.05；癌旁肝硬化與正常肝組織相比,bP＜0.05；癌旁肝硬化組織與正常肝組織相比,cP＞0.05

組別陽性面積百分比(%)積分灰度值(×106)肝細胞癌組織高分.10.589±14.108a.10.892±14.002a中分化 6.671±8.939a7.512±9.512a低分化 7.881±8.091a8.398±8.201a癌旁肝硬化組織.23.033±11.087bc.23.579±10.498bc正常肝組織0.054±0.0850.048±0.072

表2 肝細胞癌組織和正常肝組織中的AnnexinⅡ表達陽性率(n, %)

3 討論

本次研究通過實驗室研究分析, 采用芯片篩選的方法,觀察肝細胞癌的差異表達基因, 研究的可信度較高, 研究中的AnnexinⅡ已經(jīng)不僅僅只是參與炎癥反應(yīng)機制方面的內(nèi)容,同時AnnexinⅡ還是核心區(qū)保守, N端存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 可以通過癌基因pp60v-src、血小板源性生長因子受體和胰島素受體在酪氨酸23進行磷酸化修飾, 蛋白激酶C在絲氨酸25進行磷酸化修飾, 進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化等均發(fā)揮著重要的功能。通過研究發(fā)現(xiàn), AnnexinⅡ和細胞分類調(diào)控及腫瘤生長的關(guān)系非常緊密, 如果AnnexinⅡ的表達失調(diào), 那么癌細胞的表達也往往上調(diào)［2］。本次同源性研究中發(fā)現(xiàn)AnnexinⅡ的mRNA拷貝數(shù)是正常肝組織的4.05倍, 而其他也均表現(xiàn)為高表達的結(jié)果, 免疫組化分析當(dāng)中, 所有高中低分化肝細胞癌組織的陽性表達率均較高, 與正常肝組織的差異性較大,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 證實AnnexinⅡ在肝細胞癌當(dāng)中具有較強的差異表達性, 也已在一定程度判定肝細胞癌患者的發(fā)生及發(fā)展。

［1］ Stewart BW, Kleihues P. World Cancer Report. Ly-on: IARC.2003:1-351.

［2］ 陳建國, 宋新明.中國肝癌發(fā)病水平的估算與分析.中國腫瘤.2005.14(1):28-31.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.01.023

2014-08-05］

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