帥麗喬娃,鄭國棟,黎冬明,張清峰

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045)

菝葜提取物抑菌作用研究

帥麗喬娃,鄭國棟*,黎冬明,張清峰

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045)

用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取經(jīng)50%乙醇超聲處理后的菝葜提取液。用四種供試菌,采用濾紙片法、最小抑菌濃度、半數(shù)抑菌濃度比較各萃取物的抑菌活性。結(jié)果:各萃取物對實驗菌均有抑制作用,萃取物抑菌活性大小為:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>氯仿相,與萃取物中的總多酚、總黃酮含量有關(guān)。其中乙酸乙酯相的抑菌效果最好,當(dāng)其濃度為80mg/mL時,對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌抑菌圈分別為13.6±0.12、13.2±0.10、12.9±0.07、(12.5±0.01)mm。乙酸乙酯相對四種菌的最小抑菌濃度分別為5、5、5、10mg/mL,其半數(shù)抑菌濃度分別為12.5、13.6、18.2、18.7mg/mL。結(jié)論:菝葜提取物有抑菌作用,特別是乙酸乙酯萃取物的抑菌效果最好。

菝葜,提取物,抑菌作用

目前使用的防腐劑絕大多數(shù)都是人工合成的,雖然價格低廉,但是過量的添加對食品的口感及人們的身體健康有不良影響,美國、英國、日本等已立法禁止使用的防腐劑有硼砂、水楊酸、對苯二酚、五氯酚、福爾馬林,我國頒布的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)也嚴(yán)格控制山梨酸及其鹽類、丙酸及其鹽類、苯甲酸及其鹽類、對羥基苯甲酸及其酯類等用量。因此,開發(fā)高效、安全、穩(wěn)定且便宜的新型天然防腐劑具有重要的意義[1]。由于天然提取物的安全優(yōu)勢,從植物中提取活性物質(zhì)是天然物質(zhì)研究的熱門課題。很多中藥具有清熱解毒、抗菌等作用,能抑制病原微生物的生長,屬理想的天然抑菌防腐材料[2]。這為植物源天然食品防腐劑、抑菌劑的研究和開發(fā)提供了寶貴資源。

菝葜是被子植物門百合科菝葜屬植物菝葜的干燥根莖,俗稱金剛藤、鐵菱角,味甘、澀、微苦、性平,分布于我國長江以南及東南亞等地區(qū)。菝葜含有較多的黃酮、多酚、鞣質(zhì)、有機酸、多糖及生物堿等活性物質(zhì)[3]。研究表明菝葜對胃腸炎、瘡癤、抗癌、梅毒、腰腿痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病有明顯效果[4]。劉世旺等[5]經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)菝葜乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為0.14、0.18、0.46、0.44g/12mL培養(yǎng)基。鄧家剛等經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)菝葜的6%水煎液和3%醇浸液對炭疽桿菌有抑菌作用[6],前人大多都是研究菝葜的醇提物、水提物的抑菌作用,本文除了研究醇提物和水提物外,還研究了石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層和正丁醇層的抑菌作用,提取物種類更多、更全面。實驗以菝葜6種極性提取物為研究對象,以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌為實驗菌株,采用濾紙片擴散法考察其抑菌效果、半數(shù)抑菌濃度和最低抑菌濃度,為研究菝葜抗菌活性和機理奠定實驗基礎(chǔ),也為進(jìn)一步開發(fā)與利用菝葜提供了研究數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菝葜 江西南昌市藥材店(產(chǎn)地:南昌),粉碎后過40目篩,得到樣品,備用;乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇 均為分析純,天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心;瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室冷藏保管。

LAC-5040S高壓滅菌鍋、YLE-200恒溫培養(yǎng)箱、BYY-200藥品冷藏箱 上海申安醫(yī)療器械廠;KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.2 總酚含量的測定 稱取一定量沒食子酸,配成0.1mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0.25、0.30、0.35、0.40、0.45mL標(biāo)準(zhǔn)溶液到10.0mL容量瓶中,分別加入1mL福林酚試劑后,搖勻放置5min,再分別加入2.00mL 7%碳酸鈉溶液,混勻,定容,室溫避光放置1h后,在765nm波長處測定吸光度。

準(zhǔn)確吸取待測樣液0.5mL于10mL容量瓶,加入福林酚試劑1.0mL,充分混勻后,加入2.00mL 7%碳酸鈉溶液,用蒸餾水定容,避光放置1h,于765nm測定吸光度值。根據(jù)回歸方程計算樣品中多酚類化合物的含量=(C1×10)/(M×V1×1000)式中:C1為樣品濃度值(mg);M為樣品質(zhì)量(g);V1為量取樣品體積,mL。

1.2.3 總黃酮含量的測定 稱取一定量蘆丁,用30%乙醇溶液配成0.124mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL放入10mL的容量瓶中,加5% NaNO2溶液1.0mL,搖勻放置8min,再加10% Al(NO3)3溶液1.0mL,搖勻,再放置6min,加4% NaOH溶液4.0mL,搖勻,定容,放置10min,以30%乙醇溶液作參比,在510nm波長處分別測定吸光度A。

樣品的測定方法:取待測液0.5mL,用30%乙醇溶液稀釋定容至25mL,準(zhǔn)確移取V2mL,按上述方法顯色,在510nm測定其吸光度,根據(jù)回歸方程計算總黃酮量。樣品黃酮含量=C2×25/(M2×V2×1000)。C2為樣品溶液中黃酮含量,mg;V2為量取樣品體積,mL;M2為樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.4 細(xì)菌培養(yǎng)基的制備 牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,水1000mL,pH7.2(配制固體培養(yǎng)基需加入20g瓊脂),在0.1MPa下高壓滅菌20min,備用。

1.2.5 供試菌株活化及菌懸液制備 將供試菌種接入試管斜面培養(yǎng)基上,于37℃,120r/min搖床中培養(yǎng)24h,培養(yǎng)完成后,置于4℃冰箱中冷藏備用。將配制好的液體培養(yǎng)基于121℃滅菌20min,室溫冷卻,用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)置于50mL滅菌液體培養(yǎng)基中,于37℃搖床中培養(yǎng)24h作為種子液,然后用無菌生理鹽水洗脫配制成含菌數(shù)約為108個/mL的菌懸液備用[8]。

“言不盡意”是指語言存在著一定的局限性，不能完整地表達(dá)“圣人之意”。此不能用名言來完全表達(dá)的“圣人之意”實即圣人所領(lǐng)悟的“道”。《易傳》認(rèn)為“立象以盡意”，即“象”可以更直觀地表達(dá)語言所不能及的“圣人之意”?？追f達(dá)在《周易正義》說“凡易者象也，以物象而明人事者，若詩之比喻也”[10](P27)，而“立象以盡意”正可體現(xiàn)這種比喻，高亨在《周易雜論》一書中談《周易》的藝術(shù)特點時也提及了其取象的這種特點：

1.2.6 菝葜不同極性提取物抑菌活性測定 將所得萃取物各取800mg,分別用10mL無菌水溶解得80mg/mL的藥液,再以無菌水為溶劑對上述80mg/mL每種溶液分別進(jìn)行兩次稀釋,每種萃取物得到80、40、20mg/mL三個濃度梯度的供試藥液,用無菌水作對照,考慮到供試藥液有限,本實驗采用濾紙片法。選用優(yōu)質(zhì)濾紙直徑為6mm圓形紙片,121℃高壓滅菌30min,再經(jīng)80℃烘干,置于干燥器中備用。取菌懸液0.2mL轉(zhuǎn)移至之前倒好的平板培養(yǎng)基表面,均勻涂布,制成含菌平板。在制備好的紙片上滴加0.02mL不同濃度的供試液,待其干燥后貼入含菌平板中,每個平皿放三片,重復(fù)三次實驗。在37℃的條件下培養(yǎng)24h后,用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法量取抑菌圈直徑(mm)。通過測定抑菌圈直徑大小評價不同組分對不同受試菌抑制作用[9]。

1.2.7 最小抑菌濃度 將不同菝葜提取物配制成80、40、20、10、5、2.5mg/mL的提取液。吸取0.1mL各菌懸液于培養(yǎng)基中,涂布均勻后,再用無菌鑷子夾取分別浸有不同濃度菝葜提取液和無菌水對照液的濾紙片(6mm)分別貼于涂布后的含菌平皿上。完成后,置于37℃下培養(yǎng)24h。觀察抑菌現(xiàn)象,以不長菌(抑菌圈>6mm)的最低濃度為最小抑菌濃度。

1.2.8 半數(shù)抑菌濃度 不同濃度的菝葜提取液加入到已滅菌的培養(yǎng)基中,混勻,加入到培養(yǎng)皿內(nèi),吸取200μL細(xì)菌菌懸液于其表面,用無菌涂布器將菌液涂布均勻。細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h,并進(jìn)行平板菌落計數(shù),計算抑菌率。以無菌水作為對照。

表1 不同極性提取物總酚和總黃酮含量±s,n=3)

注:不同小寫字母代表同行差異顯著(p<0.05),不同大寫字母代表同行差異極顯著(p<0.01)。

表2 不同極性提取物對細(xì)菌的抑制作用(以抑菌圈直徑表示,±s,n=3)

注:“-”表示未觀察到明顯的抑菌圈,抑菌圈直徑以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,抑菌圈直徑包含原孔洞初始直徑6mm。

每個濃度作3個平行樣,運用Excel 2003處理數(shù)據(jù),以樣品濃度和抑制率作圖,求出線性回歸方程,抑制率為50%時的濃度即為半數(shù)抑菌濃度[10]。抑菌率(%)=(對照實驗菌落數(shù)-相應(yīng)濃度的菌落數(shù))/對照實驗的菌落數(shù)×100。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用DPS7.5版分析軟件中的Duncan新復(fù)極差法對總酚、總黃酮含量、抑菌作用、最小抑菌濃度中的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚和總黃酮的回歸方程

以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得回歸方程為y=10.243x+0.0021,r=0.9991。以蘆丁濃度作橫坐標(biāo),吸光度作縱坐標(biāo),得回歸方程為y=1.9373x+0.0103,r=0.9992。

2.2 菝葜不同萃取相總酚和總黃酮含量的比較

由表1可看出,菝葜不同提取物的總酚、總黃酮含量差異較大,乙酸乙酯相和正丁醇相中總酚、總黃酮含量高于其他萃取相,各萃取相中總多酚、總黃酮含量依次為:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>氯仿相。

2.3 菝葜不同極性提取物抑菌活性

由表2可知,6種極性提取物對四種供試菌均有一定的抑制效果,隨著各極性提取物濃度上升,抑菌效果也加強,呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。6種極性提取物對革蘭氏陽性菌,如金黃色芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果強于革蘭氏陰性菌,如大腸桿菌和沙門氏菌,說明菝葜提取物對革蘭氏陽性菌的抑制效果更好。其中,乙酸乙酯相的抑菌效果最好,對實驗用菌都有很好的抑菌效果,濃度為80mg/mL對金色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈達(dá)13.6、13.2mm。不同萃取物的抑菌效果強弱依次為:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>氯仿相。Smullen等[11]通過對多種植物多酚提取物的研究,發(fā)現(xiàn)多酚類化合物有明顯抑菌作用。Pachaikani等[12]發(fā)現(xiàn)黃酮有抗菌,抗真菌功能。表1中不同萃取相的總酚、總黃酮含量與抑菌作用有明顯相關(guān)性,說明其抑菌成分可能主要是黃酮與多酚類。

2.4 最小抑菌濃度

石油醚相,氯仿相的抑菌效果不明顯,以下不進(jìn)行最小抑菌濃度和半數(shù)抑菌濃度的研究。由表3可以看出,各萃取相對不同菌種的最小抑菌濃度都在4.83～20.11mg/mL。相對而言,乙酸乙酯萃取物最小抑菌濃度較低。

表3 不同極性提取物的最小抑菌濃度±s,n=3)

注:以不長菌(抑菌圈>6mm)的最低濃度為最小抑菌濃度。

2.5 半數(shù)抑菌濃度

從圖1～圖4可以看出,隨細(xì)菌種類的不同和極性提取物不同,對同種和不同種類的細(xì)菌的半數(shù)抑菌濃度也不相同。乙酸乙酯相、正丁醇相、水相和醇提物對金黃色芽孢桿菌的半數(shù)抑菌濃度分別12.5、16.4、56.1、61.4mg/mL;對枯草芽孢桿菌的半數(shù)抑菌濃度分別13.6、18.3、62.6、65.8mg/mL;對大腸桿菌的半數(shù)抑菌濃度分別18.2、22.3、76.3、92.4mg/mL;對沙門氏菌的半數(shù)抑菌濃度分別18.7、21.0、71.8、73.1mg/mL。

圖1 不同極性提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌率(n=3)Fig.1 The antibacterial rate of different polar extracts on Staphylococcus aureus(n=3)

圖2 不同極性提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌率(n=3)Fig.2 The antibacterial rate of different polar extracts on Bacillus subtilis(n=3)

圖3 不同極性提取物對大腸桿菌的抑菌率(n=3)Fig.3 The antibacterial rate of different polar extracts on Escherichia.coli(n=3)

圖4 不同極性提取物對沙門氏菌的抑菌率(n=3)Fig.4 The antibacterial rate of different polar extracts on Salmonella. Sp(n=3)

3 結(jié)論

3.1 菝葜不同極性提取物的抑菌活性實驗表明,各極性提取物對4種致病菌均有一定的抑制作用,且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。對革蘭氏陽性菌的抑菌作用強于革蘭氏陰性菌。抑菌活性大小為:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>氯仿相,抑菌作用與總酚和總黃酮的含量呈正相關(guān)性。其中乙酸乙酯相的抑菌效果最好,當(dāng)其濃度為80mg/mL時,對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌抑菌圈分別為13.6±0.12、13.2±0.10、12.9±0.07、(12.5±0.01)mm。

3.2 半數(shù)抑菌濃度實驗和最小抑菌濃度實驗表明,對同一供試菌,乙酸乙酯相比其它相的半數(shù)抑菌濃度和最小抑菌濃度都低,對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度為5、5、5、10mg/mL,半數(shù)抑菌濃度為12.5、13.6、18.2、18.7mg/mL。

3.3 本實驗結(jié)果表明菝葜提取物有較好抑菌效果,其中乙酸乙酯萃取物抑菌效果最好。但其抑菌成分還不清楚,今后需要進(jìn)一步研究。

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Study on antibacterial effect of extraction fromSmilaxChinaL.

SHUAI Li-qiaowa,ZHENG Guo-dong*,LI Dong-ming,ZHANG Qing-feng

(Key Laboratory of Natural Product and Functional Food,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

The 50% ethanol extraction fromSmilaxChinaL.(SCL)by ultrasonic were further exacted with petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butanol,respectively. Antibacterial activities of extraction were tested by the filter paper method,the minimum inhibitory concentration and half bacteriostatic concentration of four G+and G-strains. The results showed that the extractions of SCL had antibacterial effect on the test bacteria. The antibacterial activities of SCL’s different polar extracts were in sequence of ethyl acetate,n-butanol phase,aqueous phase,ethanol extract,petroleum ether,chloroform phase. The results were associated with content of polyphenols and flavonoids in extraction. The activity of ethyl acetate extraction was the strongest,and suppressed zones of theBacillussubtilis,Escherichiacoli,SalmonellaandStaphylococcusaureuswere 13.6±0.12,13.2±0.10,12.9±0.07,(12.5± 0.01)mm in 80mg/mL,respectively. The minimum bacteriostatic concentrations of ethyl acetate relative to the four strains were 5、5、5、10mg/mL,respectively,half bacteriostatic concentrations were 12.5,13.6,18.2,18.7mg/mL,respectively. The results showed that the extraction of SCL had antibacterial effects,and the effects of ethyl acetate extraction were the best.

SmilaxChinaL.;extraction;bacteriostatic effect

2014-06-25

帥麗喬娃(1989-),女,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物的分離提取。

*通訊作者:鄭國棟(1969-),男,博士,副教授,研究方向:天然產(chǎn)物的分離提取、功能食品等。

國家科技部863計劃(2013BAD10B04);國家自然科學(xué)基金(31160320)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)07-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.001