鄒 蘭,胡月英,陳文學(xué),*

(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228;2.海南大學(xué)材化學(xué)院,海南?？?570228)

黑胡椒提取物對枯草芽孢桿菌生理代謝的影響

鄒 蘭1,胡月英2,陳文學(xué)1,*

(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570228;2.海南大學(xué)材化學(xué)院,海南?？?570228)

本文以枯草芽孢桿菌作為供試菌,分別研究了經(jīng)4個不同有機相的胡椒提取物處理后的枯草芽孢桿菌細胞內(nèi)的丙酮酸含量以及轉(zhuǎn)氨酶活性的變化,探討了胡椒提取物的抑菌機理。結(jié)果表明,處理后的枯草芽孢桿菌菌體內(nèi)的丙酮酸出現(xiàn)積累,其中以乙酸乙酯相的丙酮酸濃度最高,為0.527 g/L;此外,胞外谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活力增強,最高酶活力分別為28.62 Kar U和49.29 Kar U。這說明了胡椒提取物能破壞枯草芽孢桿菌的正常生理代謝,從而有效地抑制枯草芽孢桿菌的生長。

胡椒提取物,抑菌機理,枯草芽孢桿菌

長久以來,延長食品的貨架期,保證食品的安全以及品質(zhì)一直都是食品企業(yè)以及政府部門關(guān)心的問題。食品貨架期是指在標簽上規(guī)定的條件下，保持食品質(zhì)量(品質(zhì))的期限。影響食品貨架期的因素有:食物本身、環(huán)境因素、食品的包裝質(zhì)量[1]。為防止食品的腐敗、變質(zhì),延長食品貨架期,保持食品新鮮度,需要在食品中添加防腐劑。常見防腐劑有三種類型:化學(xué)防腐劑、天然防腐劑和益生菌[2]。

近幾年,人們對中草藥和植物精油的抗菌、抗病毒和抗氧化特性的研究越來越感興趣。有些植物精油還被用做食品防腐劑[3]。隨著人們對天然成分和無化學(xué)防腐劑食物的需求增大,天然的防腐劑將會越來越受到人們的青睞。如今,對藥用植物和香辛料的抗微生物活性的研究也已經(jīng)成為一種趨勢[4]。胡椒是一種藥食同源的香辛料,在我國的廣西、云南、臺灣、海南等地有廣泛的種植。目前,其在海南的種植面積約13.3萬hm2,產(chǎn)量高達1.2萬t[5]。胡椒可加入藥材中使用,具有鎮(zhèn)靜、止痛、消炎等功能;此外,胡椒還有抗癌、抗驚厥、殺蟲、消炎解熱等活性[6-8]。有研究表明[9-11],胡椒的醇提取物以及胡椒揮發(fā)油對常見的食品腐敗菌有較強的抑制作用。楊敏[12]等人研究了黑胡椒5種不同有機相提取物及兩種常用防腐劑對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、黑曲霉的最小抑菌濃度(MIC),胡椒提取物對這5個菌都有較強的抑菌活性,但并未對某一特定菌的生理代謝進行研究。本文通過對枯草芽孢桿菌丙酮酸含量及轉(zhuǎn)氨酶活性的測定,研究了胡椒提取物對菌體生長代謝的影響,為進一步揭示胡椒提取物的抑菌機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑胡椒購自南國超市;枯草芽孢桿菌菌種 來自于海南大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室;乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等試劑 均購自天津市富宇精細化工有限公司,均為分析純;牛肉膏、瓊脂 均購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白胨 購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;丙酮酸標準樣品和2,4-二硝基苯肼(DNP) 購自阿拉丁公司;α-酮戊二酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸 均購自于上海源葉生物科技有限公司。

FW177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;WF-300EH型超聲清洗機 寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;ZHWY-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩箱 上海智誠分析儀器制造有限公司;SW-CJ-1FD型潔凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程有限公司;722型可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胡椒抑菌物質(zhì)的提取 根據(jù)胡椒抑菌活性物質(zhì)提取的最佳條件[13],利用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液浸泡胡椒粉末480 min,經(jīng)抽濾及真空減壓濃縮得到膏狀胡椒提取物(胡椒油樹脂),置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用?液萃取法對胡椒粗提物進行分離純化,分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇作為萃取劑,收集萃取液并經(jīng)真空濃縮蒸發(fā)依次得到石油醚相提取物、氯仿相提取物、乙酸乙酯相提取物、正丁醇相提取物。

1.2.2 菌種的活化及培養(yǎng) 將枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中活化后保存?zhèn)溆?。?.9%的NaCl來制備含菌量在106～107cfu/mL范圍內(nèi)的菌體懸浮液。將1 mL的菌懸液加入到49 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中。實驗組中加入終濃度為MIC的用80%的酒精溶解后的胡椒各個有機相提取物,對照組中加入相同體積的乙醇。各組均在轉(zhuǎn)速為130 r/min的37 ℃的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 丙酮酸含量的測定

1.2.3.1 丙酮酸標準曲線的繪制 丙酮酸含量的測定可采用苯肼[14],首先準確稱取0.4 g丙酮酸,充分溶解于去離子水中,定容至200 mL,配制成2 g/L的標準丙酮酸溶液,再分別稀釋成不同濃度的丙酮酸溶液。試管中依次加入1 mL 2,4-二硝基苯肼(DNP)和0.1 mL不同濃度的丙酮酸標準溶液,37 ℃水浴20 min,再加入10 mL NaOH(0.4 mol/L),搖勻,測其在520 nm下的吸光度值。

1.2.3.2 處理菌液丙酮酸含量的測定 參考文獻[15],實驗組和對照組均在1、4、7、10、13、24 h分別取樣后,于轉(zhuǎn)速為6000 r/min的條件下離心15 min,取上清液1 mL并稍微稀釋,使?jié)舛忍幵跇藴是€的范圍內(nèi)。將1 mL DNP試劑和0.1 mL稀釋樣品(加入0.3 mL 8%三氯乙酸)加入到試管中,37 ℃水浴反應(yīng)10 min,再加入10 mL的0.4 mol/L NaOH溶液,搖勻。以不加胡椒提取物的培養(yǎng)物為空白對照,測各組在520 nm處吸光值,根據(jù)標準曲線即可計算得樣品中的丙酮酸濃度。

1.2.4 轉(zhuǎn)氨酶活性的測定

1.2.4.1 轉(zhuǎn)氨酶標準曲線的繪制 轉(zhuǎn)氨酶活性的測定采用賴氏法[16]。首先配制0.1 mol/L磷酸鹽溶液(pH7.4)、2 mmol/L的丙酮酸標準溶液、1 mmol/L的2,4-二硝基苯肼(DNP)以及0.5 mol/L的NaOH,然后再配制谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)底物液(包含0.2 mol/L的L-丙氨酸,2.0 mmol/L的α-酮戊二酸和0.1 mol/L磷酸鹽溶液(pH7.4))和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)底物液(包含0.2 mol/L的L-天門冬氨酸,2.0 mmol/L的α-酮戊二酸和0.1 mol/L磷酸鹽溶液(pH7.4))。ALT標準曲線測定時,分別在試管中加入磷酸緩沖液、丙酮酸標準溶液和ALT底物液,混勻,在37 ℃下水浴加熱30 min;AST標準曲線測定時,分別在試管中加入磷酸緩沖液、丙酮酸標準溶液和AST底物液,混勻,在37 ℃下水浴加熱60 min;然后,各管均加入0.5 mL的DNP,混勻,37 ℃下水浴加熱20 min;再加入5 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液,混勻,37 ℃下水浴加熱10 min,取出,冷卻至室溫,在波長為505 nm下測定其吸光光度值,以吸光光度值為橫坐標,對應(yīng)的卡門氏單位(Kar U)為縱坐標,繪制出ALT和AST的標準曲線。

1.2.4.2 處理菌液轉(zhuǎn)氨酶活性的測定 參考文獻[17],加藥組與對照組分別在0、4、8、12、24 h取樣,于4 ℃下離心(10000 r/min,10 min)后,取上清液保存于冰水中。將0.5 mL的ALT底物液和AST底物液分別轉(zhuǎn)移到試管中并在37 ℃水浴中加熱5 min。取0.1 mL上清液于上述試管中并快速混勻后置于水浴(37 ℃)中加熱(ALT,30 min;AST,60 min)。再取0.5 mL DNP加入到各個試管中,混勻并于37 ℃水浴中反應(yīng)20 min,在室溫下冷卻10 min。再加入5 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉,混勻后于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min,然后在505 nm下測其吸光度。通過與標準曲線比對計算出AST和ALT的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒提取物對菌液丙酮酸含量的影響

丙酮酸是連接糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸途徑的重要的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物,如果丙酮酸積累,會對細胞的產(chǎn)能和物質(zhì)代謝產(chǎn)生影響,擾亂細菌正常的代謝過程[18-19]。圖1為丙酮酸的標準曲線,圖2是由與標準曲線比對得到的不同時間點取樣后相應(yīng)樣品的丙酮酸含量?？莶菅挎邨U菌對照組的丙酮酸含量隨著時間的延長而降低,氯仿相萃取物組的菌液丙酮酸含量在前4 h內(nèi)含量減少,之后呈逐漸上升趨勢。石油醚、正丁醇和乙酸乙酯萃取物組的菌液丙酮酸含量隨著時間的延長呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。其中以乙酸乙酯相的丙酮酸含量最高,在24 h時達到0.527 g/L。結(jié)果表明:各實驗組的丙酮酸含量都呈現(xiàn)了不同程度的積累。

圖1 丙酮酸標準曲線Fig.1 The pyruvate acid standard curve

圖2 胡椒提取物對枯草芽孢桿菌的丙酮酸濃度的影響Fig.2 Effect of pepper extract on B. subtilis pyruvate acid content

2.2 胡椒提取物對菌液轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

轉(zhuǎn)氨酶[20]是一種胞內(nèi)酶,它不僅能催化機體合成非必需氨基酸,而且可以通過轉(zhuǎn)氨基作用使大多數(shù)氨基酸脫氨基。氨基酸的氧化分解途徑雖然各不相同,但是它們最后形成產(chǎn)物如丙酮酸、延胡索酸和草酰乙酸等產(chǎn)物會進入三羧酸循環(huán)[21]。因此,如果轉(zhuǎn)氨酶泄漏,胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活性降低,必將導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)受阻,這將導(dǎo)致多肽及蛋白質(zhì)的合成受到影響。圖3和圖5分別是谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的標準曲線。圖4和圖6是根據(jù)ALT和AST標準曲線比對后得到的枯草芽孢桿菌的酶活力。由圖4可知,枯草芽孢桿菌對照組的ALT活力顯著低于各實驗組的ALT活力。在前8 h,各個實驗組的ALT活力均呈上升趨勢,隨后下降,在12～24 h內(nèi),除了乙酸乙酯相菌液的ALT活力出現(xiàn)降低外,其余各實驗組的酶活力有都有所增加。氯仿相、石油醚相、正丁醇相和乙酸乙酯相的最終ALT酶活力高于對照組,且經(jīng)正丁醇相處理后細菌的酶活力最高,達到28.62 Kar U。而圖6顯示了枯草芽孢桿菌經(jīng)胡椒提取物處理后各組在24 h內(nèi)AST活力的變化曲線。由圖6知:實驗組和對照組在前4 h內(nèi)AST的活力均呈上升趨勢;在4～8 h內(nèi),AST活力稍有降低,但經(jīng)氯仿相胡椒提取物處理的菌液在前8 h一直呈上升趨勢。8 h后,對照組的AST酶活力降低,其余實驗組的酶活力上升,盡管氯仿相組的菌液AST活力出現(xiàn)下降,但其活性仍然高于對照組,且其最終AST酶活力出現(xiàn)了上升趨勢。這可能是因為細胞壁遭到破壞,并且細胞膜的通透性增大,導(dǎo)致胞內(nèi)酶外泄[22]。氯仿相、石油醚相、正丁醇相和乙酸乙酯相的最終AST酶活力分別達到了41.68、39.20、34.92、49.29 Kar U,均高于對照組的22.63 Kar U,且經(jīng)乙酸乙酯相處理后,胞外AST酶活力最強。

圖3 ALT標準曲線Fig.3 The ALT standard curve

圖4 胡椒提取物對枯草芽孢桿菌ALT活力的影響Fig.4 Effect of pepper extract on B.subtilis ALT activity

圖5 AST標準曲線Fig.5 The AST standard curve

圖6 胡椒提取物對枯草芽孢桿菌AST活力的影響Fig.6 Effect of pepper extract on B. subtilis AST activity

3 結(jié)論與討論

本實驗通過考察枯草芽孢桿菌菌體內(nèi)丙酮酸含量、ALT和AST活力的變化,研究了胡椒的不同提取物對枯草芽孢桿菌生長代謝的影響。結(jié)果表明:經(jīng)胡椒提取物處理的菌液,其丙酮酸均出現(xiàn)不同程度的積累,其中以乙酸乙酯相萃取物處理的菌液丙酮酸含量最高;此外,胞外ALT和AST的活性增強,表明胡椒提取物破壞了菌體細胞的細胞膜,增大了細胞膜的通透性,導(dǎo)致酶的泄漏。同時,由于酶的泄漏,導(dǎo)致胞內(nèi)酶減少,活性降低,影響了細胞內(nèi)多肽和蛋白質(zhì)正常的合成和分解代謝。由此,可推斷其抑菌機理是胡椒提取物影響了菌體的正常代謝途徑,導(dǎo)致供給細胞生長繁殖所需的能量和關(guān)鍵物質(zhì)不能及時合成,導(dǎo)致菌體衰亡。

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Effect of pepper extract on the physiological metabolism ofBacillussubtilis

ZOU Lan1,HU Yue-ying2,CHEN Wen-xue1,*

(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Materials and Chemical Engineering,Hainan University,Haikou 570228,China)

Considering that black pepper extracts inhibit food spoilage and food pathogenic bacteria,the antimicrobial mechanism of four different organic phases of pepper extract againstBacillussubtiliswere explored. The antibacterial mechanism of pepper extract was elucidated by analyzing pyruvic acid content and transaminases activities of the target bacteria. The extract significantly increased pyruvic acid concentration in bacterial solutions,especially with the treatment of ethyl phase,the concentration of pyruvic acid were up to 0.527 g/L.And the activity levels of ALT and AST in the cultures of bacterial cell were increased severely with adding pepper extracts,and the highest enzyme activity was 28.62 and 49.29 Kar U,respectively. The results indicated that pepper extracts inhibited the metabolic and energy synthesis ofBacillussubtilis,which consequently affected the growth and metabolic ofBacillussubtilis.

pepper extract;antibacterial mechanism;Bacillussubtilis

2015-03-27

鄒蘭(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：18289765565@163.com。

*通訊作者:陳文學(xué)(1968-)，男，碩士，副教授，研究方向：熱帶農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究，E-mail:hnchwx@163.com。

海南大學(xué)博士啟動基金(kyqd1224)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)23-0148-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.022