丁 偉,張明俐,史吉平,柳鵬福,宋禮華

(1.安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,安徽合肥 230032;2.中國科學院上海高等研究院可持續(xù)技術(shù)研究中心,上海 201210)

表達谷氨酸脫羧酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

丁 偉1,2,張明俐2,史吉平2,柳鵬福2,宋禮華1,*

(1.安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,安徽合肥 230032;2.中國科學院上海高等研究院可持續(xù)技術(shù)研究中心,上海 201210)

谷氨酸脫羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的關(guān)鍵酶,本研究通過基因工程構(gòu)建了一株產(chǎn)GAD的重組枯草芽孢桿菌,并對其產(chǎn)GAD的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。分別通過單因素法、正交實驗、極差分析和響應面法確定了最佳培養(yǎng)基成分(g/L)及發(fā)酵條件為:蔗糖23.5,豆粕10、乙酸銨為8.5、磷酸二氫鉀4.1、七水硫酸鎂0.5,pH7.0,培養(yǎng)溫度37 ℃。在優(yōu)化條件下GAD酶活達到0.413 U/mL,與優(yōu)化前的GAD酶活0.143 U/mL相比,酶活提高了188.8%。本研究有助于后續(xù)開發(fā)枯草桿菌生產(chǎn)γ-氨基丁酸的工藝,以克服現(xiàn)在γ-氨基丁酸生產(chǎn)工藝中,大腸桿菌安全性的問題和乳酸菌成本過高的問題。

谷氨酸脫羧酶,γ-氨基丁酸,重組枯草芽孢桿菌,發(fā)酵條件優(yōu)化

γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)是一種廣泛存在的四碳骨架非蛋白氨基酸[1],具有神經(jīng)傳遞、降低血壓、利尿、鎮(zhèn)定安神等生理作用[2-3],最近的研究還發(fā)現(xiàn)GABA可以提高大腦中蛋白質(zhì)合成的速率[4]、抑制小氣道肺部惡性胰腺增生[5]。在食品、化工、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)都有巨大的應用前景[6]。

當前GABA的生產(chǎn)主要是利用微生物中的谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC4.l.l.15)催化L-谷氨酸生成,谷氨酸脫羧酶廣泛存在于各種生物體內(nèi),可以催化L-谷氨酸脫去羧基生成GABA和二氧化碳[7],是生物合成γ-氨基丁酸的關(guān)鍵酶。目前對通過GAD催化生產(chǎn)GABA的研究主要集中在乳酸菌(Lacticacidbacteria,LAB)和大腸桿菌(Escherichiacoli)上[8-9],乳酸菌催化生產(chǎn)安全性高,但發(fā)酵困難,產(chǎn)量低,成本高。大腸桿菌催化生產(chǎn)GABA研究也比較多,大腸桿菌催化產(chǎn)量高,成本低,但發(fā)酵過程容易產(chǎn)生內(nèi)毒素,有安全隱患。對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)GAD轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)GABA的研究很少?？莶菅挎邨U菌廣泛應用在食品生產(chǎn)上,是公認安全(Generally recognized as safe,GRAS)的微生物[10]。有報道將從短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)克隆得到的GAD基因片段,構(gòu)建到大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體pLip上,電轉(zhuǎn)化枯草168得到重組枯草芽孢桿菌[11],該重組菌相對于原始的枯草168,GAD的酶活和GABA轉(zhuǎn)化濃度都得到一定提高,但遠遠還未達到理想中的結(jié)果[12]。

本文從大腸桿菌基因組上擴增得到編碼L-谷氨酸脫羧酶的基因gadB,構(gòu)建了一株高表達GAD的枯草桿菌,然后通過發(fā)酵條件的優(yōu)化,使得發(fā)酵酶活提高了188.8%,確定了最佳發(fā)酵參數(shù),為利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)GABA奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和主要試劑 枯草芽孢桿菌168,大腸桿菌E.coliDH5α為本實驗室保存?？莶輻U菌表達載體pHT01購自德國MoBiTec公司。

GABA標品 Sigma公司;其他試劑 均購自國藥集團(分析純)。引物合成和DNA測序 蘇州金唯智公司;PCR清潔和質(zhì)粒抽提試劑盒 Axygen公司;PrimeSTAR酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶 Takara公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,氯化鈉10;固體LB培養(yǎng)基(g/L):液體LB中加入1.5%(w/v)的瓊脂粉。原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,氯化銨5,七水硫酸鎂0.49,磷酸二氫鉀2,調(diào)pH到7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體pHT01-gadB的構(gòu)建 根據(jù)大腸桿菌gadB基因序列(GenBank No:M840251)設計引物:F-gadB-BamHI:CATGGATCCATGGATAAGAA GCAAGTAAC;R-gadB-XbaI:CGATCTAGATCA GGTAGCTTTAAAGCTGTTC,高保真PrimeSTAR酶擴增,gadB片段用BamH I和XbaI雙酶切,與雙酶切的pHT01載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài),氨芐抗性平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子。根據(jù)質(zhì)粒pHT01設計引物,F-pHT01:CTTGAAATTGGAAGGG AGATT;R-pHT01:CAACCATTTGTTCCAGGTAAGG,對陽性菌落進行菌落PCR驗證測序驗證。

1.2.2 重組枯草桿菌168/pHT01-gadB的構(gòu)建 將測序正確含有g(shù)adB基因的穿梭表達載體pHT01-gadB按文獻中方法[13],電轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168菌株,氯霉素抗性平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子,接LB(氯霉素抗性)培養(yǎng)基37 ℃,200 r/min,12 h培養(yǎng)后,按1%接種量轉(zhuǎn)接原始發(fā)酵培養(yǎng)基,37 ℃,200 r/min,5 h后,加IPTG至終濃度0.2 mmol/L誘導,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,按1.2.3所述酶活測定,具有GAD酶活的即為構(gòu)建的工程菌。

1.2.3 GAD酶活測定 10 mL轉(zhuǎn)化反應體系逐步加入以下物質(zhì):取10 mL發(fā)酵菌液,10000 r/min,10 min離心收菌體,加20 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.2),磷酸吡哆(Pyridoxalphoshate,PLP)0.2 mmol/L,谷氨酸鈉0.5 mol/L。溫度30 ℃,200 r/min,反應30 min,立即沸水浴10 min,終止其反應。8000 r/min,10 min離心取上清液,計算酶活[14]其中按照文獻[15]進行HLPC檢測GABA濃度。

酶活力單位定義:反應液中,每分鐘催化底物生產(chǎn)1 μmoLγ-氨基丁酸所需要酶量為1個活力單位(U)。

1.2.4 碳氮源單因素篩選 在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分和發(fā)酵條件不變的情況下,分別選擇不同的2%碳源:葡萄糖、可溶性淀粉、甘油、麥芽糖、山梨醇、蔗糖;1%有機氮源:蛋白胨、酵母粉、豆粕、牛肉膏、玉米漿和0.5%氮源:尿素、硫酸銨、氯化銨、乙酸銨、檸檬酸二銨進行發(fā)酵培養(yǎng),然后測定不同碳氮源對酶活和生物量的影響。

1.2.5 二水平正交實驗 根據(jù)原始發(fā)酵培養(yǎng)基選擇要考察的6個因素:蔗糖、豆粕、乙酸銨、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀和起始pH,選擇合適正交表進行實驗,通過極差大小進行分析,確定最優(yōu)因素水平組合[16]。

1.2.6 響應面法 根據(jù)二水平正交實驗分析得到的3個主要因素蔗糖、乙酸銨和磷酸二氫鉀,選用Design Expert8.0.6軟件,通過RSM中的Box-Behnken設計進行響應面實驗設計[17],各因素和水平見表1。

表1 因素與水平(BBD)

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌168/pHT01-gadB的構(gòu)建

大腸桿菌基因組DNA中PCR擴增得到gadB基因片段電泳檢測大小為1400 bp,如圖1,成功從大腸桿菌基因組DNA中擴增出了預期大小的片段。用BamH I和XbaI雙酶切后,插入同樣雙酶切的pHT01載體中,隨機挑取6個轉(zhuǎn)化子用引物F-pHT01和R-pHT01做菌落PCR鑒定,電泳檢測如圖2,所擴增的6株菌均成功擴增出了1500 bp左右條帶(由于引物設計位于多克隆位點上下游各100 bp左右,因此擴增片段比原插入片段略大),證實gadB基因片段成功插入表達載體中,質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建完成的pHT01-gadB質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入枯草168菌株中,得到預期工程菌。

圖1 gadB基因PCR片段Fig.1 The PCR fragmen of gadB gene注：M:2000 DNA Marker;1～5為gadB PCR片段。

圖2 陽性克隆的菌落PCR鑒定Fig.2 Clony PCR identification of positive colonies M:2000注：DNA Marker;1～4,6、7為菌落PCR;5為對照片段。

2.2 碳源和氮源單因素法篩選結(jié)果

分別按照材料與方法中所述選擇了碳源、有機氮源和無機氮源,檢測了每種條件下的GAD酶活和發(fā)酵液OD600,從而判斷發(fā)酵的生物量,結(jié)果如圖3所示,確定最佳碳源為蔗糖,最佳的有機氮源為豆粕,最佳的無機氮源為乙酸銨。

圖3 不同碳氮源對OD600和GAD酶活的影響Fig.3 The influence of OD600 and GAD activity bydifferent carbon source and nitrogen source

2.3 二水平正交實驗結(jié)果及分析

二水平正交實驗設計、GAD酶活及極差分析的結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設計和極差分析

根據(jù)極差分析結(jié)果,GAD酶活各因子影響順序為:蔗糖>磷酸氫二鉀>乙酸銨>pH>豆粕>七水硫酸鎂。同時取豆粕、起始pH與七水硫酸鎂選取各自最好的水平上,豆粕濃度為10 g/L,pH為7.0,七水硫酸鎂為0.5 g/L。通過響應面法(RSM)重點研究蔗糖、磷酸二氫鉀及乙酸銨這三個主要因素。

2.4 響應面法(RSM)

2.4.1 響應面實驗設計和結(jié)果分析 利用RSM中的Box-Behnken設計(BBD)對蔗糖、磷酸二氫鉀、乙酸銨三個因素為自變量,以GAD酶活(U/mL)為響應值,設計三因素三水平的響應面實驗,共有17個實驗點,每個實驗點3個平行。

這17個實驗點分為兩類:一是中心實驗點,該實驗點以GAD酶活為響應值,自變量取值為實驗設計水平的中間值,中心點實驗重復5次,以估計實驗誤差。二是非中心實驗點,共12個。表3為實驗及結(jié)果。

表3 響應面試驗方案及GAD酶活

根據(jù)響應面實驗結(jié)果(表3),利用Design-Expert8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行二元多項回歸擬合,GAD酶活對蔗糖(A)、磷酸二氫鉀(B)和乙酸銨(C)的二元多項回歸模擬方程為Y=0.43+0.068A+0.018B+0.017C-0.018AB+0.015AC-4.000×10-3BC-0.098A2-0.12B2-0.12C2。

表4 模型可信度分析

2.4.2 響應面圖分析 蔗糖(A)、磷酸二氫鉀(B)和乙酸銨(C)三個變量交互作用的等高線和3D響應面圖如圖4A～圖4C,各因子及其交互作用對響應值的影響結(jié)果通過圖4可以直觀反映出來。

圖4A表示乙酸銨為8 g/L時,蔗糖含量和磷酸氫二鉀含量對GAD酶活的影響,由響應面圖知道,蔗糖含量和磷酸氫二鉀含量的影響顯著,GAD酶活響應值變化明顯,曲線陡峭。碳源和磷酸鹽維持在適宜水平對GAD酶活十分重要。

圖4B表示磷酸二氫鉀為4 g/L時,蔗糖含量和乙酸銨含量對GAD酶活的影響,由響應面圖知道,蔗糖含量和乙酸銨含量的影響同樣顯著。磷酸二氫鉀含量和乙酸銨含量有著相似的顯著影響,維持合適的碳氮比對GAD酶活很重要。

圖4C表示蔗糖為20 g/L時,磷酸二氫鉀含量和乙酸銨含量對GAD酶活的影響,通過響應面圖比較知道,圖4C中磷酸二氫鉀含量和乙酸銨含量的交互作用與圖4A和圖4B中的兩因素交互作用明顯不同,可能是由于磷酸鹽離子和乙酸根離子在發(fā)酵液中的相互作用,形成緩沖體系,維持發(fā)酵液的穩(wěn)態(tài),對GAD酶活影響更顯著。

圖4 三個變量交互作用對GAD酶活影響的等高線圖和響應面圖Fig.4 Contour line and response surface plot between three factors on GAD enzyme activity

2.4.3 發(fā)酵條件最優(yōu)組合及其驗證 采用Design-Expert8.0.6軟件的Optimization模塊對實驗結(jié)果處理,合理實驗水平上,以GAD酶活最高值為指標,得到蔗糖、磷酸二氫鉀和乙酸銨三個因素的最佳組合:蔗糖23.48 g/L,磷酸二氫鉀4.14 g/L和乙酸銨8.48 g/L,相對的響應面模型預測的最大酶活值0.439 U/mL。

為檢驗模型預測的準確性,選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖為23.5 g/L,磷酸二氫鉀為4.1 g/L和乙酸銨為8.5 g/L,其他條件不變。重復實驗3次,得到平均酶活為0.413 U/mL,與理論預測值0.439 U/mL的相對誤差很小,說明預測準確。

3 結(jié)論及討論

本文在成功構(gòu)建產(chǎn)谷氨酸脫羧酶(GAD)枯草芽孢桿菌的基礎上,對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化,確定了最佳培養(yǎng)基(g/L)為:蔗糖23.5,豆粕10、乙酸銨為8.5、磷酸二氫鉀4.1、七水硫酸鎂0.5,pH7.0,培養(yǎng)溫度37 ℃,搖瓶平均GAD酶活為0.413 U/mL,相比于優(yōu)化前(葡萄糖 20,蛋白胨 10,氯化銨 5,七水硫酸鎂 0.49,磷酸二氫鉀 2,調(diào)pH到7.0)的0.143 U/mL,酶活增加了188.8%。本研究有助于后續(xù)開發(fā)枯草桿菌生產(chǎn)GABA的工藝,以克服大腸桿菌安全性的問題和乳酸菌成本過高的問題,為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供基礎。

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Construction of recombinantBacillussubtilisexpressing glutamate decarboxylase and the optimization of fermentation conditions

DING Wei1,2,ZHANG Ming-li2,SHI Ji-ping2,LIU Peng-fu2,SONG Li-hua1，*

(1.Basic Medical College,Anhui Medical University,Hefei 230032,China;2.Research Center for Sustainable Technology,Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China)

Glutamate decarboxylase(GAD)is a key enzyme involved in the biosynthesis ofγ-aminobutyric acid. In this study,a recombinantBacillussubtilisexpressing glutamate decarboxylase was constructed through genetic engineering,and fermentation conditions for production of GAD were optimized by single-factor test,orthogonal test and response surface methodology,and the conditions were as follows,sucrose 23.5,soybean meal 10,ammonium acetate 8.5,potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4)4.1,magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4·7H2O)0.5,initial pH7.0 and 37℃ of culture temperature. Compared with the initial 0.143 U/mL,GAD activity was incresed by 188.8% and reached 0.413 U/mL under the optimized conditions. This study would contribute to the subsequent development ofγ-aminobutyric acid production process inB.subtilis,for the sake of bypassing the safty issue related toEscherichiacoliand high cost associated with Lactic acid bacteria duringγ-aminobutyric acid production nowadays.

glutamate decarboxylase(GAD);γ-Aminobutyric acid(GABA);recombinantBacillussubtilis;optimization of fermentation conditions

2015-03-25

丁偉(1990-),男,碩士,研究方向:微生物基因工程,E-mail:dingwei2008bengbu@163.com。

*通訊作者:宋禮華(1957-),男,博士，教授,研究方向:生物基因工程,E-mail:songlh@ankebio.com。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0194-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.032