劉 波 鐘明艷 李慶萍 黃 敏 馬熙天

淋巴細胞亞群分析是檢測細胞免疫和體液免疫功能重要指標，它能總體反映機體當前的免疫功能、狀態(tài)和平衡水平，我們通過測定肺腺癌患者化療前后免疫功能的變化，為免疫治療提供一定依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇從2013年4月－2015年6月我院住院的70例患者，男性40例，女性30例;年齡33～82歲，中位年齡55歲。所有患者經(jīng)支氣管檢查取得病理、手術組織病理或經(jīng)過CT引導下或B超引導下穿刺下取得明確病理診斷結(jié)果。根據(jù)化療方法將患者分為培美曲塞組、多西他賽組，于化療前及化療結(jié)束后分別取靜脈抗凝血2 m l和血清2 m l，抗凝血用于檢測免疫活性細胞。

1.2 設備與方法

我院 CD3、CD4、CD8、CD4/CD8 及 NK 細胞特異性細胞固定及檢測法，SemiBio細胞免疫芯片以細胞分離固定技術為基礎，利用抗原抗體特異性反應，通過芯片基板達到將特異性細胞進行固定、分離的目的，完成檢測。具體主要流程:(1)靜脈標本血2 ml搖勻K2EDTA抗凝血加于相應編號380 ml磷酸鹽緩沖液中，即刻混勻。(2)將濕盒置于水平臺，加室溫水至濕盒底部被完全覆蓋。(3)取出玻片置于濕盒架上，將包被面朝上，按序?qū)撕炠N于玻片一端，后將玻片置于濕盒架上。(4)吸取5 ml稀釋血樣，滴入玻片方框區(qū)域中心。確認沒有血樣流出，且方框內(nèi)無氣泡，蓋緊盒蓋，濕溫(20～30℃)孵育40 min。(5)孵育40 min后，將玻片按序插入玻片架。(6)將玻片架即刻放入磷酸鹽緩沖液中，旋轉(zhuǎn)提拉直至玻片呈無色透明。(7)將玻片架即刻放入過氧化酶染色中，靜置1 min。(8)將1 ml 2.5% ～3.5%過氧化氫溶液加入預先盛有水(至400 ml刻度線)專用缸中，攪拌均勻后制成新鮮工作溶液中。(9)將稍加瀝干的玻片架轉(zhuǎn)入新鮮過氧化氫工作溶液中，靜置4 min。(10)將玻片架轉(zhuǎn)入75%乙醇(400 ml)專用缸中，旋轉(zhuǎn)提拉直至干凈，提出后振去多余乙醇。(11)打開玻片架搭扣，將其置入SemiBio自動玻片干燥儀下干燥6 min，確保黑框內(nèi)干燥。(12)將玻片架放入復染液中，靜置1 min。(13)將玻片架轉(zhuǎn)入純水(500 ml)專用缸中，靜置30 s，其后根據(jù)玻片數(shù)量不等提拉相應次數(shù)，提出后振去多余水分。(14)打開玻片架搭扣將其置于SemiBio自動玻片干燥儀下吹干。(15)通過SemiBio全自動可視化細胞檢測儀現(xiàn)場或異地隨時進行細胞自動計數(shù)，重復步驟12-14。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPPSS19.0統(tǒng)計學軟件數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)標準差±s)表示，采用t檢驗或方差分析。

2 結(jié)果

(1)培美曲塞組化療前后CD3明顯增高(P＜0.05);CD4值增高(P ＜0.05);CD8明顯降低(P ＜0.05);CD4/CD8升高，(P ＜0.05)，NK 值明顯升高(P＜0.05)，見表1。(2)多西他賽組化療前后 CD3、CD4值稍升高，但無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05);CD8值變化無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05);CD4/CD8比值稍升高，無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。NK值稍減低，無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

多西他賽組與培美曲塞組化療前后CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、NK變化比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(表2)。

表1 多西他賽組與培美曲塞組化療前、后免疫指標的表達比較±s)

表1 多西他賽組與培美曲塞組化療前、后免疫指標的表達比較±s)

指標多西他賽組培美曲塞組化療前 化療后 t P 化療前 化療后t P.74 70.90 ±3.35 －1.277 0.160 CD4 31.36 ±5.74 34.44 ±1.67 －6.765 0.000 34.66 ±1.62 35.10 ±2.75 －1.015 0.105 CD8 32.02 ±1.73 29.20 ±2.93 5.862 0.000 32.02 ±1.73 31.78 ±2.28 0.593 0.555 CD4/CD8 1.50 ±0.45 1.64 ±0.52 －2.784 0.005 1.45 ±0.68 1.56 ±0.78 －0.784 0.620 NK 19.64 ±2.70 21.67 ±2.78 －3.684 0.000 21.38 ±CD3 64.52 ±5.74 70.9 ±3.34 －6.784 0.000 68.5 ±5 2.93 22.18 ±2.87 －1.378 0.171

表2 培美曲塞組與多西他賽化療前后的免疫指標變化值的比較±s)

表2 培美曲塞組與多西他賽化療前后的免疫指標變化值的比較±s)

指標 培美曲塞組 多西他賽組t P CD3 6.38 ±7.15 0.14 ±4.10 5.354 0.000 CD4 3.08 ±3.04 －1.16 ±4.10 3.039 0.000 CD8 2.82 ±3.26 0.24 ±2.96 4.142 0.000 CD4/CD8 0.98 ±0.86 0.43 ±0.37 1.354 0.107 NK 2.02 ±3.36 0.80 ±4.09 3.770 0.000

3 討論

培美曲塞是一種新的、多靶位葉酸拮抗劑，原理是通過細胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過程，抑制細胞復制的代謝過程，從而抑制腫瘤的生長。多西他賽為紫杉醇類抗腫瘤藥物，通過干擾細胞有絲分裂和分裂間期細胞功能所必須的微管網(wǎng)絡而起抗腫瘤作用。Hanna等［1］應用培美曲塞VS多西他賽二線治療NSCLC的Ⅲ期臨床研究實驗中證實在肺腺癌治療中培美曲塞優(yōu)于多西他賽，血液學毒性低于多西他賽，因此培美曲塞已經(jīng)越來越多應用于治療晚期肺腺癌。

T細胞在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中起重要作用［2］。CD3是CD4與CD8總和，CD4+T細胞包括調(diào)節(jié)T細胞，它在免疫反應中有免疫抑制和免疫調(diào)控作用［3］CD8+T細胞主要通過細胞毒作用殺傷腫瘤細胞，又稱細胞毒性細胞。CD4/CD8可作為NSCLC患者免疫紊亂指標［4］。在本研究中，通過多西他賽聯(lián)合順鉑化療后CD3、CD4、CD8、CD4/CD8比較均無統(tǒng)計學意義，表明多西他賽化療后期免疫功能無明顯下降;培美曲塞聯(lián)合順鉑治療后患者CD3、CD4、CD4/CD8值明顯升高，CD8值明顯降低，提示患者化療后機體免疫得到優(yōu)化，與國內(nèi)一些學者所報道一致［5-6］其原因可能是化療可能導致體內(nèi)淋巴細胞總數(shù)降低，體內(nèi)免疫自穩(wěn)機制打破原有免疫耐受，各淋巴細胞亞群向正常過程重建，化療使腫瘤細胞發(fā)生凋亡同時激活免疫應答，從而降低體內(nèi)腫瘤負荷，重建T細胞免疫功能［7］。本研究中，使用培美曲塞的肺腺癌患者免疫增強原因可能是培美曲塞的療效好于多西他賽，血液學毒性低，更有利于T細胞免疫功能重建，最終需進一步臨床研究證實。

NK細胞可通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)發(fā)揮殺傷性腫瘤細胞功能，還可通過分泌細胞因子、通過死亡受體介導靶細胞凋亡和釋放穿孔素顆粒酶誘導凋亡等途徑而殺傷腫瘤細胞［8］。化療藥物多為細胞毒性藥物，在殺滅腫瘤細胞同時也殺傷機體正常增殖和分化細胞，尤其是殺傷增殖分化的免疫細胞。一般認為，NK細胞發(fā)揮效應多為中、早期腫瘤，對于晚期腫瘤，NK細胞難以發(fā)揮作用。本研究中，培美曲塞組化療后NK細胞數(shù)增多，因為化療后晚期肺腺癌腫瘤退縮較快，從而導致NK細胞增殖，使患者免疫功能增強。

綜上所述，晚期肺腺癌免疫力低下，通過研究患者化療前后免疫功能指標變化情況，可為針對性使用化療用藥提供理論基礎，并進行針對性的免疫治療。

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