林耀才

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院，廣東 深圳 518104)

烏骨藤為蘿藦科通關(guān)藤［Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.］的藤莖，性味苦，微寒，歸肺經(jīng)，具有止咳平喘，祛痰，通乳，清熱解毒等功效［1］。民間草醫(yī)常用于治療原發(fā)性肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤，具有一定的療效，且安全性較好。以其為原料制備的消癌平制劑廣泛用于肝癌、胃癌、食管癌、肺癌等腫瘤的治療［2～6］，具有療效好、毒性低的特點(diǎn)，可提高患者機(jī)體免疫力，改善晚期腫瘤患者的生存質(zhì)量，延長患者生存時間。烏骨藤含有甾體苷、生物堿、有機(jī)酸、多糖、樹脂及色素等化學(xué)成分，臨床用消癌平口服制劑均采用烏骨藤總提物入藥，存在服藥量大的不足?，F(xiàn)代藥理分析表明甾體總苷可能是其輔助抗癌的主要成分，本文研究烏骨藤總苷對SGC－7901、S180、P388腫瘤細(xì)胞的抑制作用，為開發(fā)烏骨藤組分中藥抗癌新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物 烏骨藤總苷(自制，C21甾體苷類成分含量＞50%，批號:20130812);5－氟胞嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限公司，10 mL(0.25 g)/支，批號:1305052);羥喜樹堿注射液(黃石飛云制藥有限公司，2 mL(2 mg)/支，批號:130801);注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，0.2 g/支，批號:13011025)。

1.2 瘤株細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株SGC－7901細(xì)胞株、小鼠肉瘤S180細(xì)胞和淋巴白血病細(xì)胞P388細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞生物研究所。

1.3 動物 SPF級昆明小鼠，雌雄各半，18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2013－0004。Balb/c裸鼠，雌雄各半，18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2013－0004。DBA/2小鼠，雌雄各半，18～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2012－0002。

1.4 儀器 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國SHEL－LAB公司);酶標(biāo)儀(美國Bio－Rad公司)。

2 方法

2.1 對人胃癌細(xì)胞SGC－7901的體外抑制試驗(yàn)烏骨藤總苷組設(shè)高、中、低3個劑量組(劑量分別為15、12、9 mg·mL－1)，陽性對照組使用羥喜樹堿(劑量為0.001 mg·mL－1)，空白對照組給予生理鹽水，每組設(shè)10個復(fù)孔。取對數(shù)生長期的SGC－7901細(xì)胞，計數(shù)，采用RPMI－1640培養(yǎng)液配置細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)2.0×105·mL－1)，將上述細(xì)胞液加入96孔板，置37℃的CO2培養(yǎng)箱中，加入MTT液，連續(xù)作用7 d，測定A值，計算各試驗(yàn)組對SGC－7901細(xì)胞的抑制率。

抑制率=(對照組A540－治療組A540)/對照組A540×100%

2.2 對人胃癌細(xì)胞SGC－7901的體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn)烏骨藤總苷組設(shè)高、中、低3個劑量組(劑量分別為240、180、120 mg·kg－1)，陽性對照組使用 5 － 氟胞嘧啶(劑量為0.025 mg·kg－1)，空白對照組使用生理鹽水，各組均采用腹腔內(nèi)注射方式給藥。取SGC－7901細(xì)胞(處于對數(shù)生長期)離心5 min(轉(zhuǎn)速1000 rpm)，然后濃縮至1 mL(含細(xì)胞4×107個)，先后加入纖維蛋白原和凝血酶液使之形成細(xì)胞凝塊，將其分割成等體積小塊。接種Balb/c裸鼠于前1 d腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺150 mg·kg－1，將瘤體接種于裸鼠腎囊下，瘤體移植后第2天開始連續(xù)給藥7 d，第8天將小鼠處死，測量腫瘤長徑和短徑，并計算腫瘤體積和腫瘤抑制率。

腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2［7］

腫瘤抑制率=(對照組腫瘤體積－用藥組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%

2.3 對小鼠移植肉瘤S180的抑制作用 取6只健康昆明小鼠，雌雄各半，腹腔注射液體石蠟油(0.5 mL/只)，7天后于小鼠腹腔接種S180細(xì)胞(0.5 mL/只)，接種后9 d斷頸處死小鼠，于無菌條件下取出腹水，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次后制成細(xì)胞懸液，于實(shí)驗(yàn)小鼠腋窩皮下接種0.2 mL(1×106個瘤細(xì)胞)細(xì)胞懸液，每批接種50只，接種后次日隨機(jī)分組，每組10只，烏骨藤總苷組設(shè)高、中、低3個劑量組(劑量分別為 540、270、135 mg·kg－1)，陽性對照組給予環(huán)磷酰胺(劑量為25 mg·kg－1)，空白對照組使用生理鹽水，各組均采用灌胃方式給藥，每天1次，連續(xù)10 d，于末次給藥后處死小鼠，稱體重，摘瘤稱重，計算抑瘤率。

2.4 對小鼠移植淋巴白血病細(xì)胞P388的抑制作用按常規(guī)方法［7］接種P388細(xì)胞懸液于DBA/2小鼠腹腔，每只小鼠接種0.2 mL(1×106個瘤細(xì)胞)，接種后次日隨機(jī)分組，每組10只，烏骨藤總苷組設(shè)高、中、低3個劑量組(劑量分別為540、270、135 mg·kg－1)，陽性對照組給予環(huán)磷酰胺(劑量為50 mg·kg－1)，空白對照組使用生理鹽水，各組均采用灌胃方式給藥，每天1次，連續(xù)10 d，記錄小鼠生存時間，計算生命延長率。

2.5 統(tǒng)計 統(tǒng)計方法采用兩組標(biāo)本計量資料的t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 對人胃癌細(xì)胞SGC－7901的體外抑制試驗(yàn)烏骨藤總苷對SGC－7901細(xì)胞的抑制率呈劑量依賴關(guān)系，與空白對照組差異明顯:烏骨藤總苷高劑量組與空白對照組比較P＜0.001，烏骨藤中劑量組與空白對照組比較P＜0.01。烏骨藤總苷高劑量組抑制率與羥基喜樹堿組相當(dāng)，烏骨藤總苷組中低劑量組抑制率顯著弱于羥基喜樹堿，結(jié)果見表1。

表1 烏骨藤總苷對SGC－7901胃癌細(xì)胞生長抑制作用(，n=10)

表1 烏骨藤總苷對SGC－7901胃癌細(xì)胞生長抑制作用(，n=10)

注:與空白對照組比較，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;與羥喜樹堿組比較，##P＜0.01

組別 藥物濃度(mg·mL－1) A540 抑制率(%)98烏骨藤總苷組空白對照組0.76 ±0.05 －15 0.03 ±0.02＊＊＊－9412 0.33 ±0.03＊＊ 58##90.58 ±0.09 26##羥喜樹堿組 0.001 0.01 ±0.01＊＊＊

3.2 對人胃癌細(xì)胞SGC－7901的體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn)腹腔內(nèi)注射烏骨藤總苷對腫瘤的抑制率呈劑量依賴關(guān)系，各用藥劑量組的抑瘤率與空白對照組比較有顯著差異:烏骨藤總苷高劑量組與生理鹽水組比較P＜0.01，烏骨藤中劑量組與空白對照組比較P＜0.01，烏骨藤低劑量組與空白對照組比較P＜0.05。烏骨藤總苷高劑量組抑瘤率與5－氟胞嘧啶組相當(dāng)，烏骨藤總苷組中低劑量組抑瘤率顯著弱于5－氟胞嘧啶組。烏骨藤甾體總苷各組給藥后體重和毛色均無明顯改變，結(jié)果見表2。

表2 烏骨藤總苷對小鼠SGC－7901胃癌細(xì)胞的生長抑制(，n=10)

表2 烏骨藤總苷對小鼠SGC－7901胃癌細(xì)胞的生長抑制(，n=10)

注:與生理鹽水組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與5－氟胞嘧啶組比較，##P＜0.01

組別 劑量(mg·kg－1) 腫瘤體積 抑制率(%)生理鹽水組10±3120 6±3* 49##烏骨藤總苷組78180 4.8 ±2.1＊＊ 54##240 2.7 ±2.1＊＊ 725 －氟胞嘧啶 0.025 2.5 ±1.4*

3.3 對小鼠移植肉瘤S180的抑制作用 結(jié)果表明，烏骨藤總苷對小鼠移植腫瘤S180有明顯抑制作用，與對照組比較具有顯著差異:烏骨藤總苷高劑量組與生理鹽水組比較P＜0.01，烏骨藤中劑量組與空白對照組比較P＜0.01，烏骨藤低劑量組與空白對照組比較P＜0.05。烏骨藤總苷高中低劑量組抑瘤率顯著弱于環(huán)磷酰胺組，結(jié)果見表3。

表3 烏骨藤總苷對小鼠移植S180的抑制作用，n=10)

表3 烏骨藤總苷對小鼠移植S180的抑制作用，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;與環(huán)磷酰胺組比較，##P＜0.01

組別 劑量(mg·kg－1) 腫瘤重量(g) 抑瘤率(%)對照組1.88 ±0.45540 1.18 ±0.52＊＊ 36.25##烏骨藤總苷組80.11270 1.10 ±0.61＊＊ 40.18##135 1.29 ±0.55* 30.78##環(huán)磷酰胺 25 0.75 ±0.36＊＊＊

3.4 對小鼠移植淋巴白血病細(xì)胞P388的抑制作用 結(jié)果表明烏骨藤總苷對小鼠移植P388有顯著抑制作用，使小鼠生存時間延長，與對照組比較差異顯著:烏骨藤總苷高劑量組與生理鹽水組比較P＜0.01，烏骨藤中劑量組與空白對照組比較P＜0.01，烏骨藤低劑量組與空白對照組比較P＜0.05。烏骨藤總苷高中低劑量組生命延長率顯著弱于環(huán)磷酰胺組，結(jié)果見表4。

4 討論

烏骨藤含有多種甾體苷、生物堿、有機(jī)酸、多糖、樹脂及色素等化學(xué)成分［8～10］，研究表明C21甾體苷具有明顯的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［9］。烏骨藤中甾體苷包括通光藤苷 A、B、C、D、E、J、K 及通光藤新苷 A、B、C 等［9］，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，烏骨藤中C21甾體苷類具有誘導(dǎo)和促使微管(腫瘤細(xì)胞賴以分裂、擴(kuò)散的載體)蛋白質(zhì)聚合、微管裝備與微管穩(wěn)定的獨(dú)特作用機(jī)制。

表4 烏骨藤總苷對小鼠移植P388的抑制作用(，n=10)

表4 烏骨藤總苷對小鼠移植P388的抑制作用(，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;與環(huán)磷酰胺組比較，##P＜0.01

組別 劑量(mg·kg－1) 生存時間(d) 生命延長率(%)對照組10.9 ±2.15540 15.8 ±3.12＊＊ 40.25##烏骨藤總苷組76.11270 14.8 ±2.61＊＊ 35.28##135 13.5 ±3.25* 28.78##環(huán)磷酰胺 50 18.8 ±2.86＊＊＊

臨床用消癌平片劑用法為每天3次，每次服8～10片，服用劑量太大，病人吞咽不方便，原因是現(xiàn)有烏骨藤口服制劑是以總提物入藥，工藝簡單、出膏率大、有效成分含量低導(dǎo)致，因而本研究擬對烏骨藤有效部位甾體總苷抗癌活性進(jìn)行研究。消癌平制劑臨床用于治療食道癌、胃癌、肝癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、宮頸癌、卵巢癌等多種實(shí)體癌及白血病等療效顯著，基于烏骨藤制劑臨床所針對的腫瘤種類，本文選擇了人胃癌細(xì)胞SGC－7901、小鼠移植S180、小鼠移植P388進(jìn)行體內(nèi)腫瘤抑制試驗(yàn)。

烏骨藤總苷的體外和體內(nèi)試驗(yàn)表明，烏骨藤總苷對SGC－7901胃癌細(xì)胞株有直接生長抑制作用，其體內(nèi)腫瘤抑制率呈劑量依賴關(guān)系，烏骨藤總苷高濃度組對SGC－7901體內(nèi)抑瘤率達(dá)到98%，作用與5－氟胞嘧啶相當(dāng)。烏骨藤總苷對小鼠移植肉瘤S180的體內(nèi)試驗(yàn)表明，雖然烏骨藤總苷抑瘤率與空白組有顯著差異，但烏骨藤總苷高中低3組的抑瘤率均弱于陽性藥環(huán)磷酰胺。小鼠移植淋巴白血病細(xì)胞P388的抑制試驗(yàn)結(jié)果與肉瘤S180的體內(nèi)試驗(yàn)類似，烏骨藤總苷抑瘤率與空白組有顯著差異，但烏骨藤總苷高中低3組對淋巴白血病細(xì)胞P388的體內(nèi)抑瘤率均弱于陽性藥環(huán)磷酰胺。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與目前臨床上消癌平制劑治療胃癌相對具有較好療效的結(jié)果一致。

本文研究結(jié)果表明烏骨藤總苷對人胃癌細(xì)胞SGC－7901、小鼠移植S180、小鼠移植 P388均較顯著的體內(nèi)抑制作用，有望開發(fā)成為劑量小、攜帶服用方便的新一代烏骨藤有效部位抗癌新藥。

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