閔子揚(yáng) 童龍 楊紅波 李涵 成娟 張瓊 謝向陽(yáng) 孫小武

摘 要： 以‘紅栗2號(hào)南瓜子葉為外植體，探討外植體消毒時(shí)間、激素組合和培養(yǎng)基中秋水仙素濃度對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響，對(duì)所得植株的倍性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：外植體在3%（w） NaClO溶液中消毒15 min，污染率為0且外植體活力較高;MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+秋水仙素40 mg·L-1是誘導(dǎo)‘紅栗2號(hào)南瓜產(chǎn)生四倍體的最適培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率達(dá)到25.71%;組培苗形態(tài)及根尖染色體有四倍體存在。

關(guān)鍵詞： 南瓜; ‘紅栗2號(hào); 組織培養(yǎng); 秋水仙素; 誘導(dǎo); 四倍體

Study on polyploid induction of pumpkin by tissue culture combined with colchicines

MIN Ziyang1， TONG Long1， YANG Hongbo1，2， LI Han1，CHENG Juan1， ZHANG Qiong1，2， XIE Xiangyang2， SUN Xiaowu1，2

（1. Hunan Agricultural University， Changsha， 410128， China; 2. Hunan Province Melon Research Institute， Shaoyang， 422001， China）

Abstract：The cotyledon of pumpkin-‘Hongli 2is used as explant to study the influence of disinfect time，hormone combination and different concentrations of colchicine of medium on bud induction rate. ?The ploidy of regenerated plant is also identified .The results showed that the explants disinfect in 3% Naclo solution for 15 min，the pollution rate can be reduced to zero and the explants showed higher activity. MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+colchicine 40 mg/L was the optimal medium to induce ‘Hongli 2to generate tetraploid. The bud induction rate was up to 25.71%. The observation of somaclone form and root tip chromosomes showed the existence of tetraploid.

Key words： Pumpkin; ‘Hongli No. 2; Tissue culture; Colchicine; Induction; Tetraploid

南瓜是葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）中的一年生草本植物，起源于中、南美洲，栽培種及野生近緣種共有 30 個(gè)，其中有5個(gè)南瓜栽培種，而在我國(guó)栽培的主要有 3 個(gè)：南瓜（Cucurbita moschata Dvch.）又名中國(guó)南瓜、筍瓜（C. maxima D.）又名印度南瓜、西葫蘆（C. pepo L.）又名美洲南瓜。南瓜栽培歷史悠久，適應(yīng)性強(qiáng)，種植面積大，具有世界性蔬菜的美稱，不僅產(chǎn)量高、耐貯藏，而且南瓜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值十分豐富，富含胡蘿卜素、戊聚糖、果膠、甘露醇、葫蘆巴堿、腺嘌嶺、礦質(zhì)元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中所含的一些藥用成分對(duì)多種疾病均有療效，尤其是南瓜多糖，是預(yù)防糖尿病的活性成分，受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注[1-2]。然而，我國(guó)南瓜的優(yōu)良品種類型少，品種更新?lián)Q代慢，并且隨著近年來(lái)生產(chǎn)面積的不斷擴(kuò)大，規(guī)?；N植和連作障礙，南瓜病害有逐年加重的趨勢(shì)，尤其是針對(duì)南瓜的主要病害如疫病、白粉病、病毒病等的抗病性研究嚴(yán)重滯后于生產(chǎn)。

與正常倍性植株相比多倍體植株一般表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更加豐富，貯運(yùn)性更好并且具有較強(qiáng)的抗病性和抗逆性等特點(diǎn)，所以越來(lái)越受到育種工作者的關(guān)注。利用組織培養(yǎng)與秋水仙素相結(jié)合獲得四倍體植株是多倍體育種的一個(gè)重要途徑，這已經(jīng)在西瓜[3]和甜瓜[4]等瓜類作物的多倍體育種中得到了應(yīng)用，但是在南瓜上的相關(guān)報(bào)道還比較少。本文通過(guò)對(duì)組織培養(yǎng)和秋水仙素相結(jié)合的方法誘導(dǎo)南瓜四倍體的研究，為南瓜新品種的選育提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為‘紅栗2號(hào)南瓜種子，由湖南省瓜類研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌苗的獲得 選取籽粒飽滿、大小均勻一致的‘紅栗2號(hào)南瓜種子，剝?nèi)シN殼，在25 ℃ 的恒溫水中浸種5～6 h。在超凈工作臺(tái)上用75%（φ） 的酒精表面消毒30 s后用無(wú)菌水沖洗3遍，然后置于3%（w）的NaClO溶液中分別消毒9、12、15、18 min以觀察不同消毒時(shí)間對(duì)無(wú)菌苗萌發(fā)的影響，消毒期間要不停搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水沖洗5～6次，將消毒過(guò)的種子放在無(wú)菌濾紙上吸干表面的水分后接種到不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)，待種子發(fā)芽后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，光照周期為16 h·d-1，光強(qiáng)2 500 lx，整個(gè)培養(yǎng)期間一直處于（25±1）℃ 的溫度條件下。試驗(yàn)中每處理接種3瓶，每瓶接種6個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.2.2 外植體的切取和不同激素組合對(duì)芽誘導(dǎo)的影響 以‘紅栗2號(hào)南瓜剛轉(zhuǎn)綠2 d的子葉為外植體，在取用子葉時(shí)，去掉子葉邊緣部分后將剩下的橫切為二，再取其近葉柄端[5]縱切為二，每片子葉得到2塊約3 mm×5 mm的外植體。將從子葉上切取的外植體正面朝上接種到添加不同質(zhì)量濃度的6-BA（2.0、3.0、4.0 mg·L-1）和NAA（0.1、0.2 mg·L-1）激素組合的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照16 h·d-1，光強(qiáng)2 500 lx、溫度（25±1）℃，25 d后觀察統(tǒng)計(jì)不同激素濃度組合對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響。試驗(yàn)中每種激素組合接種3瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.2.3 培養(yǎng)基中秋水仙素濃度對(duì)‘紅栗2號(hào)四倍體誘導(dǎo)效果的影響 在1.2.2中篩選的最適南瓜芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將切取的外植體分別接種在添加不同濃度秋水仙素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，秋水仙素質(zhì)量濃度分別為20、30、40、50、60、70 mg·L-1，同時(shí)以未添加秋水仙素的最適芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)條件為光照16 h·d-1，光強(qiáng)2 500 lx、溫度（25±1℃），25 d后觀察統(tǒng)計(jì)不同秋水仙素濃度對(duì)芽誘導(dǎo)率及成活率的影響。試驗(yàn)中每個(gè)處理接種3瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.2.4 不定芽的生根培養(yǎng) 參照任桂紅、林榮[6]的方法，將長(zhǎng)至2 cm左右的不定芽轉(zhuǎn)接到MS+NAA 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽生根以形成完整植株。

1.2.5 多倍體植株的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)鑒定：對(duì)所得植株外觀進(jìn)行觀察，并且與正常植株相比較，觀察指標(biāo)包括植株高度、莖粗度、葉片大小、葉片厚度、葉片顏色。（2）根尖染色體計(jì)數(shù)鑒定：在陳解放[7]的關(guān)于南瓜根尖染色體計(jì)數(shù)方法的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)，將解離時(shí)間調(diào)整為10 min，卡寶品紅染色液染色時(shí)間增加到15 min，其他不變，以此來(lái)觀察所得植株根尖的染色體倍性組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響

在組織培養(yǎng)的過(guò)程中，外植體的消毒是最基礎(chǔ)也是最重要的步驟，消毒情況的好壞嚴(yán)重影響著試驗(yàn)的進(jìn)程，所以獲得污染率較低且活力較高的外植體是至關(guān)重要的。本試驗(yàn)中先用75% 的酒精處理30 s然后用3% 的NaClO溶液處理不同的時(shí)間，其對(duì)種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表1。

表1 NaClO不同處理時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響

[消毒時(shí)間

/min＼&外植體數(shù)量

/個(gè)＼&萌芽數(shù)量

/個(gè)＼&污染數(shù)量

/個(gè)＼&污染率

/%＼&萌芽率

/%＼&9

12

15

18＼&18

18

18

18＼&15.33

15.00

13.67

9.67＼&8.33

3.33

0.00

0.00＼&46.28 a

18.50 b

0.00 c

0.00 c＼&85.17 a

83.33 b

75.94 c

53.72 d＼&]

[注] 不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05水平上差異顯著。后表同。

從表1可以看出：消毒效果與消毒時(shí)間的長(zhǎng)短有密切關(guān)系，當(dāng)消毒時(shí)間只有9 min的時(shí)候污染率達(dá)到46.28%，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，消毒效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)到15 min的時(shí)候污染率為0。但是，隨著消毒時(shí)間的增加NaClO對(duì)種子的毒害作用越來(lái)越強(qiáng)，當(dāng)消毒時(shí)間為18 min的時(shí)候種子的萌芽率只有53.72%。從表中可以看出消毒時(shí)間18 min與消毒15 min相比污染率都為0，但種子萌芽率降低了22.22百分點(diǎn)，所以消毒15 min是較適宜的處理時(shí)間。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)不但外植體的萌芽率降低，而且萌芽的外植體畸形率也隨之提高，具體表現(xiàn)為下胚軸不伸長(zhǎng)或稍微伸長(zhǎng)，子葉扭曲或子葉呈白化狀無(wú)法轉(zhuǎn)綠。

2.2 不同激素組合對(duì)芽誘導(dǎo)率的影響

外源激素是誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生不定芽所必需的物質(zhì)，不同激素配比決定著芽誘導(dǎo)率的高低。本試驗(yàn)中不同激素配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)的效果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，當(dāng)NAA濃度一定時(shí)隨著6-BA濃度的增加，芽分化率逐漸提高，最高可達(dá)到44.42%;當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)隨著NAA濃度極小幅度的增加，芽分化率急劇下降，說(shuō)明低濃度的NAA能有效地誘導(dǎo)芽的分化而高濃度的NAA卻抑制芽的分化。當(dāng)NAA濃度為0.1 mg·L-1，6-BA濃度為3.0 mg·L-1或4.0 mg·L-1的時(shí)芽誘導(dǎo)率沒(méi)有明顯差異，但是在3.0 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)出的芽生長(zhǎng)狀況良好（圖版—a），而在4.0 mg·L-1的時(shí)誘導(dǎo)出的芽有較多畸形芽存在（圖版—b）。綜合評(píng)價(jià)認(rèn)為MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1是誘導(dǎo)南瓜子葉形成不定芽的最適培養(yǎng)基。

2.3 培養(yǎng)基中秋水仙素濃度對(duì)‘紅栗2號(hào)四倍體的誘導(dǎo)效果

在正常的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入適宜濃度的秋水仙素來(lái)誘導(dǎo)四倍體芽（包埋法）能顯著提高四倍體的誘導(dǎo)率，這已經(jīng)在其他種類的瓜類作物上得到了驗(yàn)證，本試驗(yàn)在他人的研究成果上采用“包埋法”對(duì)‘紅栗2號(hào)南瓜子葉進(jìn)行了四倍體誘導(dǎo)，具體情況見(jiàn)表3。

由表3可知：隨著秋水仙素濃度的提高，死亡外植體數(shù)目逐漸增加，當(dāng)秋水仙素達(dá)到70 mg·L-1時(shí)外植體全部死亡;在低濃度秋水仙素（0～40 mg·L-1）條件下芽分化率差別不大，但是當(dāng)其濃度大于40 mg·L-1時(shí)秋水仙素對(duì)外植體的毒害作用明顯加強(qiáng)導(dǎo)致芽誘導(dǎo)率急劇下降;四倍體芽的出現(xiàn)率跟秋水仙素的濃度密切相關(guān)，在低濃度下出現(xiàn)率為0，在適宜的濃度范圍內(nèi)隨著秋水仙素濃度的提高四倍體芽的出現(xiàn)率也隨之提高，在40 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值25.71%，但是超過(guò)適宜濃度以后秋水仙素對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用明顯加強(qiáng)，導(dǎo)致四倍體誘導(dǎo)率降低。綜上所述認(rèn)為MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+秋水仙素40 mg·L-1是誘導(dǎo)‘紅栗2號(hào)南瓜產(chǎn)生四倍體的最適培養(yǎng)基（圖版—c）。

2.4 不定芽的生根效果

將長(zhǎng)至2 cm左右的不定芽轉(zhuǎn)接到MS+NAA 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基上，很容易誘導(dǎo)不定芽生根以形成完整植株，在誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中15 d以后生根率達(dá)到98%（圖版—d）。

2.5 植株的倍性鑒定

2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在植株形成以后對(duì)其外部形態(tài)進(jìn)行觀察以大致了解其倍性構(gòu)成情況，對(duì)比正常二倍體組培苗（圖版—e）觀察發(fā)現(xiàn)有一些植株高度較高，莖明顯增粗，葉片稍微變小，葉片厚度增加，表現(xiàn)出四倍體植株的形態(tài)特征（圖版—f）。

2.5.2 根尖染色體計(jì)數(shù) 分別取正常二倍體組培苗根尖和表現(xiàn)出四倍體形態(tài)特征的組培苗根尖進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，表現(xiàn)出四倍體形態(tài)特征的組培苗染色體數(shù)目大于44條（圖版—g），而正常二倍體植株染色體數(shù)目為44（2n=2x=44）條（圖版—h）。試驗(yàn)過(guò)程中誘導(dǎo)得到了組培苗（圖版—i）。

3 討論與結(jié)論

外植體消毒完成以后表面會(huì)殘留一些水分，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)如果不用無(wú)菌濾紙吸干表面的水分而是直接進(jìn)行無(wú)菌苗的誘導(dǎo)，污染率將大幅上升，吸干表面水分以后接種就可以得到有效的改善，這可能是因?yàn)橥庵搀w表面有大量水分存在的情況下，微生物更容易繁殖。

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的叢生芽在后續(xù)發(fā)育的過(guò)程中不易伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出老小苗現(xiàn)象，將叢生芽切成單芽轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后單芽容易死亡，這可能是由于芽體內(nèi)激素水平不平衡的緣故。

秋水仙素有劇毒，在組織培養(yǎng)的過(guò)程中對(duì)外植體有毒害作用，明顯抑制不定芽的分化甚至導(dǎo)致外植體死亡，這與鄭永強(qiáng)、徐坤的結(jié)論相同[8]。另一方面，秋水仙素在誘導(dǎo)四倍體植株產(chǎn)生的過(guò)程中又是必不可少的能顯著提高誘變率，后面可以進(jìn)一步研究有沒(méi)有物質(zhì)能夠在不影響秋水仙素誘導(dǎo)效果的前提下降低其毒害作用或?qū)ふ仪锼伤氐奶娲T變劑，這對(duì)以“混培法”來(lái)誘導(dǎo)多倍體的產(chǎn)生至關(guān)重要。

南瓜根尖染色體數(shù)目較多，形態(tài)較小，壓片時(shí)不易分散，并且組培苗的根大多部分木質(zhì)化不易解離所以觀察起來(lái)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，后面試驗(yàn)的過(guò)程中要進(jìn)一步研究多倍體植株的形態(tài)跟倍性之間的關(guān)系，爭(zhēng)取在植株生長(zhǎng)前期就可以大致確定植株的倍性構(gòu)成情況，這對(duì)后續(xù)的工作具有指導(dǎo)意義。

‘紅栗2號(hào)南瓜以子葉為外植體在秋水仙素存在的情況下通過(guò)組織培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)四倍體植株的產(chǎn)生具體步驟如下：選取籽粒飽滿、大小均勻一致的‘紅栗2號(hào)南瓜種子，剝?nèi)シN殼，在25 ℃ 的恒溫水中浸種5～6 h后在超凈工作臺(tái)上用75%（φ）的酒精表面消毒30 s然后置于3%（W）的NaClO溶液中消毒15 min，無(wú)菌濾紙吸干表面水分后接種到不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)4 d后光照培養(yǎng)，子葉轉(zhuǎn)綠后切取近葉柄端轉(zhuǎn)接到MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+秋水仙素40 mg·L-1的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的形成，待芽長(zhǎng)至2 cm左右后轉(zhuǎn)接到MS+NAA 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，最后對(duì)誘導(dǎo)出的植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定，以確定是否為四倍體植株。

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