付秋實 譚明明 王燁 王懷松

摘要：以不同基岡型的甜瓜品種為材料，研究了不同激素組合，AgNO3質量濃度以及基因型對甜瓜再生的影響。結果表明，不定芽誘導中最適宜的激素組合為MS+1.0mg-Lˉ6-BA+0.5mg-LˉABA（脫落酸），在此培養(yǎng)基上薄皮甜瓜‘IVF501和‘IVF509的不定芽誘導率分別為88.00%、79.60%，厚皮甜瓜‘IVF525和‘IVF604的不定芽誘導率分別為76.50%、74.75%。不同質量濃度的AgNO3對甜瓜不定芽分化的影響有差異，1.0mg·Lˉ1AgNO3有抑制愈傷組織分化的作用，能有效減少玻璃化的發(fā)生，當質量濃度為2.0mg-Lˉ1時，雖然明顯地抑制了愈傷組織分化，但同時降低了不定芽分化率。溥皮甜瓜‘IV F'501與厚皮甜瓜‘IVF525具有較高的不定芽誘導率，將誘導的不定芽轉入伸長培養(yǎng)基中（MS+6-BA0.05mg-Lˉ1），分化的不定芽能夠伸長長大，在生根培養(yǎng)基中（MS+IAA0.4mg·Lˉ3容易生根。薄皮甜瓜獲得完整再生植株需50—60d，厚皮甜瓜獲得完整再生植株需60—75d。

關鍵詞：甜瓜；離體再生；脫落酸（ABA）；硝酸銀（AgNO3）

甜瓜（Cucumis melo L.）是世界重要的經濟作物。植物組織培養(yǎng)技術是植物細胞工程和基因工程的關鍵技術之一。甜瓜高效再生體系的建立是遺傳轉化的基礎。在甜瓜組織培養(yǎng)方面，日前已有通過真葉、子葉、下胚軸等多種外植體再牛完整植株的報道。

添加ABA（脫落酸）是多種難以再生植物組織培養(yǎng)的有效措施。前人以子葉作外植體，6-BA為主要誘導激素，輔之以ABA，通過器官直接發(fā)生途徑，建立了不同基因型黃瓜子葉的再牛體系。李泠等報道，ABA在黃瓜再生中起到了重要的作川，與激動素相配合能促進植株分化，并能抑制異常胚狀體形成，促進正常胚狀體的發(fā)生。AgNO3（硝酸銀）是乙烯活性抑制劑，Bleecker&Kende認為，AgNO3是以競爭性作用于乙烯作用部位而促進器官和體細胞胚胎發(fā)生，其作用主要表現(xiàn)為抑制愈傷組織形成，增加外植體產生不定芽的數量及提高植株再生頻率。周音等研究表明，加入2.0mg-Lˉ1AgNO3還可有效防止生菜玻璃苗的產生。這在其他植物離體培養(yǎng)中也已得到證實。但是關于ABA以及AgNO3對甜瓜再生影響的研究鮮有報道，并且再生潛力也依基因型不同而明顯不同。我國有豐富的甜瓜種質資源，本試驗以不同基因型的甜瓜品種為材料，對影響再生的主要因素進行探討，以期為瓜類作物快速繁殖、種質資源保存和創(chuàng)新等提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1材料

供試材料為薄皮甜瓜‘IVF501與‘IVF509，厚皮甜瓜‘IVF525與‘IVF604，均由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組選育。

1.2方法

1.2.1 無菌苗的獲得選取飽滿種子，用無菌水浸泡5—6 h，然后將甜瓜種子去殼，經70%乙醇表面消毒30s，無菌水沖洗2～3次，再用2%（w）NaCl0滅菌15min，無菌水沖洗3—5遍次，用無菌濾紙吸干，平放接種于不加生長調節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，置于溫度為26℃、光強30～40μmol·mˉ2sˉ1、每天光照時間14h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，3～7d后，子葉開始變綠，胚根伸長，獲得無菌苗。基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖30g-Lˉ1，瓊脂7g·Lˉ1，pH5.8。

1.2.2 激素質量濃度篩選 甜瓜品種選用‘IVF501，激素選用6-BA與ABA。待無菌苗子葉剛剛轉綠時，從距離胚軸約2mm處剪下2片子葉，再橫切為兩部分，取近胚軸半片做外植體，葉背向培養(yǎng)基，葉面向上，分別接種于6-BA（1.0、1.5、2.0mg·Lˉ1）與ABA（O、0.5、1.0 mg·Lˉ1）不同質量濃度組合的培養(yǎng)基中，共9個處理，每皿接種9—11塊外植體，每個處理20皿，30d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率與不定芽誘導率.

愈傷組織誘導率/%=愈傷組織數量/外植體總數量×100：

不定芽誘導率/%=誘導出芽的外植體數量/外植體總數量×100。

1.2.3不同品種對不定芽誘導率與分化率的影響甜瓜品種選用‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604。根據1.2.2的試驗結果，選出不定芽誘導與分化率較高的激素組合，將4個不同品種的子葉外植體接種于此培養(yǎng)基上，共4個處理，每皿接種9—11塊外植體，每個處理20皿，30d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率與不定芽誘導率。

1.2.4添加AgNO3對不定芽誘導與分化的影響甜瓜品種選用‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604。在MS+1.0mg.L-16-BA+0.5mg.L-1ABA培養(yǎng)中，添加0、1.0、2.0mg·Lˉ1AgNO3，共12個處理，每皿接種8～10塊外植體，每個處理6皿，30d統(tǒng)計愈傷誘導率與不定芽誘導率。

1.2.5 不定芽伸長 由試驗篩選出再生率較高的1個薄皮甜瓜品種‘IVF501與1個厚皮甜瓜品種‘IVF525。將在誘導培養(yǎng)基上分化出不定芽的外植體切成小塊，轉至MS+0.05 mg -Lˉ16-BA的不定芽伸長培養(yǎng)基上，1周后切下單芽，繼代1次，15d觀察有效苗的獲得情況。

1，2.6生根甜瓜材料選用‘IVF501與‘IVF525，激素選用IAA。當芽長伸長至2—3cm時，選取健壯整齊的無根苗，用解剖刀白基部切下，轉至MS+0.4mg-Lˉ1LAA的生根培養(yǎng)基中，15d觀察獲得有效生根苗的情況。

2結果與分析

2.1激素質量濃度篩選

由表1可以看出，對于甜瓜品種‘IVF501，不定芽的誘導和分化與6-BA和ABA兩種激素配比密切相關，較低質量濃度的ABA與適宜質量濃度的6-BA配比，有較高的芽分化率。6-BA是甜瓜子葉分化的必需生長調節(jié)物質，當6-BA質量濃度為1.0 mg·Lˉ1時，不定芽的誘導率最高，隨著6-BA質量濃度的升高，疏松愈傷組織分化加快，當6-BA質量的濃度為2.0mg-Lˉ1時，芽成簇生狀，不利于單個芽的繼續(xù)分化。低質量濃度ABA對不定芽誘導與分化有促進作用，高質量濃度時則有抑制作用，當6-BA質量濃度為1.0mg·Lˉ1時，0.5mg·Lˉ1ABA較小添加ABA不定芽誘導率提高12.5%。MS+1.0nlg·L-16-BA+0.5mg·Lˉ1ABA的芽分化率最高為89.OO%、

2.2不同品種對不定芽誘導率與分化的影響

由表2可以看出，在MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1ABA培養(yǎng)基中，不同甜瓜品種的不定芽誘導與分化率不同，‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604的不定芽誘導率分別為88.OO%、79.60%，、76.50%、74.75%，愈傷組織誘導率分別為43.00%、46.27%、50.50%、54.55%。薄皮甜瓜‘IVF501、‘IVF509的不定芽誘導率明顯高于厚皮甜瓜‘IVF525、‘IVF604，但愈傷組織誘導率低于厚皮甜瓜.薄皮甜瓜‘IVF501與厚皮甜瓜‘IVF525具有較高的不定芽誘導率。

2.3 AgNO3對不定芽誘導與分化的影響

由表3可以看出，在MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1ABA培養(yǎng)基中，添加1.0mg·L-1AgNO3有抑制愈傷組織分化的作用，減少了玻璃化的發(fā)生 當質量濃度為2.0mg·L-1時，雖明顯的抑制了愈傷組織分化，但同時降低了不定芽分化率，并且玻璃化現(xiàn)象嚴重。當AgNO3質量濃度為1.0mg·L-1時，‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604的不定芽誘導率分別為76.27%、68.96%、63.46%、22.22%。因此1.0mg·L-1AgNO3對不定芽誘導與分化較適宜。

2.4不定芽伸長與生根

如圖l所示，將外植體上的叢生或單芽切下，接種到MS+0.05mg·L-16-BA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，叢生芽現(xiàn)在培養(yǎng)基伸長1周，再切下單芽，繼代培養(yǎng)，繼續(xù)伸長，15d左右，不定芽伸長2—3cm待無根苗長到2～3cm時，白基部切下，轉接到MS+0.4mg·L-1IAA培養(yǎng)基上，誘導生根。生根效果好。薄皮甜瓜獲得完整再生植株需50—60d，厚皮甜瓜獲得完整再生植株需60～75d。

圖l 不定芽伸長與生根

（A）5VF501不定芽伸長；（B）‘IVF525小定芽伸長；（C）‘VF501在生根培養(yǎng)基中生根；（D）‘IVF525在生根培養(yǎng)基中牛根。

3 討論與結論

植物離體組織培養(yǎng)中，不定芽再生頻率與植物基因型、外植體類型及生長調節(jié)劑配比等因素有關。6-BA是甜瓜再生分化的關鍵物質本試驗rft不定芽誘導最適6-BA質量濃度為1.0mg·L-1。在誘導不定芽的增殖生長中，加入較高質量濃度的6-BA，雖然對芽的分化有促進作用，但是容易產生叢芽，這與孫天國等的研究結果一致。因此在繼代過程中適當降低細胞分裂素質量濃度對芽的正常生長是有利的。

本試驗中ABA對甜瓜子葉的芽分化有促進作用，6-BA和ABA的不同配比影響甜瓜子葉不定芽的分化，不定芽誘導中最適宜的激素組合為MS+ABA0.5mg·L-1+6-BAl.0mg·L-1，在此培養(yǎng)基上能正常分化的不定芽較多并明顯伸長，不定芽的生長較快（表2，圖1）。添加ABA是多種難以再生卡植物組織培養(yǎng)的有效措施，應用到黃瓜組培上也獲得相似的結果。梅茜和張興國研究表明，在培養(yǎng)基中添加ABA可明顯提高黃瓜的芽再生能力，且以1.0mg· L-1為最適宜，如果不添加ABA，則很難產生不定芽.Sekioka等的研究表明在黃瓜的組織培養(yǎng)中，低質量濃度的ABA（O.1mg·L-1）促進胚狀體的正常發(fā)育，而高質量濃度的ABA（ 1.0mg·L-1）能顯著減少培養(yǎng)物的愈傷組織，并控制胚狀體處于球形胚或球形胚后期，這與王秀紅等的研究結果一致。

本試驗中不同濃度的AgNO3對甜瓜不定芽分化的影響有差異，1.0mg·L-1AgNO3有抑制愈傷組織分化的作用，能有效的減少玻璃化的發(fā)生，當質量濃度為2.0mg·L-1時，雖明顯地抑制了愈傷組織分化，但同時降低了不定芽分化率，并且玻璃化現(xiàn)象嚴重，這與前人的研究結果一致。AgNO3對植物形態(tài)發(fā)生具有促進作用，但其作用機理尚不十分清楚?？赡艿脑蚴侵参锝M織和細胞在離體培養(yǎng)時易產生乙烯并逐漸積累，乙烯積累可使培養(yǎng)物生長分化受到影響或毒害。Kevers等研究認為玻璃苗的產生與培養(yǎng)容器中的乙烯變化有明顯關系，玻璃化組織的外植體將ACC轉化為乙烯的能力也比對照高。Ag+是一種較好的乙烯活性抑制劑，培養(yǎng)基中添加AgNO，能有效抑制乙烯形成，減少或消除乙烯對細胞生長的不利影響。有的學者認為AgNO3是競爭性地作用于乙烯作用部位而促進器官發(fā)生，提高細胞的再生能力的。

不同甜瓜品種的不定芽誘導與分化率不同，‘IVF501、‘IVF509、‘IVF525、‘IVF604的不定芽誘導率分別為88.00%、79.60%、76.50%、74.75%（表2）薄皮甜瓜‘IVF501、‘IVF509的誘導率明顯高于厚皮甜瓜‘IVF525、‘IVF604，說明薄皮甜瓜冉生能力強于厚皮甜瓜。因此基因型對這種再生能力的獲得可能有決定性的影響。只有進行大量的試驗才能篩選出具有較好培養(yǎng)效果的基因型二本試驗中將誘導的不定芽轉入伸長培養(yǎng)基中（MS+6-BA0.05mg·L-1），分化的不定芽能夠伸長長大，在生根培養(yǎng)基中（MS+IAA0.4mg·L-l）容易生根 薄皮甜瓜獲得完整再生植株需50～60d，厚皮甜瓜獲得完整再生植株需60～75d。