孟海玲 劉倩 林波 朱曉鵬 吳勇 羅素蘭 長(zhǎng)孫東亭

摘要：全世界有約800種芋螺，每種芋螺產(chǎn)生多達(dá)2000種的肽類毒素，這些毒素可以作用于電壓門控離子通道（Na+，K+，Ca2+）、配體門控離子通道（nAChRs. 5-HT3R，NMDAR）、G蛋白偶聯(lián)受體（神經(jīng)降壓素和血管加壓素）和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。雖然已有大量的芋螺毒素通過毒液分離、cDNA克隆和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得，但已發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素不足其總量的0.5%。A—超家族中。α-芋螺毒素基因結(jié)構(gòu)包含了一個(gè)內(nèi)含子和被該內(nèi)含子分開的兩個(gè)外顯子，成熟肽具有標(biāo)準(zhǔn)的4個(gè)半胱氨酸骨架（CC-C-C）。本研究利用具有保守性的。α-芋螺毒素基因內(nèi)含子序列，采用多個(gè)PCR退火溫度，從海南產(chǎn)疣縞芋螺中克隆到了1個(gè)新的具有6個(gè)半胱氨酸骨架（CC-C-C-CC）的M-超家族芋螺毒素基因和1個(gè)含有5個(gè)半胱氨酸新穎骨架（CC-C-C-C）的未知新家族芋螺毒素，并對(duì)它們的基因結(jié)構(gòu)、成熟肽序列，以及與其他M-超家族芋螺毒素的遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了深入分析。首次證實(shí)保守的α-芋螺毒素基因內(nèi)含子序列可能存在于其他超家族中。關(guān)鍵詞：多退火溫度：內(nèi)含子；PCR；芋螺毒素基因：進(jìn)化樹中圖分類號(hào)：Q781

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2015）02-0106-08Gene Cloning of Novel Conotoxins and Phylogenetic AnalysisMENG Hai-ling， LIU Qian， LIN Bo， ZHU Xiao-peng， WU Yong， LUO Su-lan， ZHANGSUN Dong-ting（Key Laboratory of Tropical Biological Resources， Ministry of Education； Key Lab for Marine Drug of Haikou， Hainan University，Haikou 570228， Hainan， China）Abstract： There are around 800 species of cone snails living in the world tropical ocean. Venom of each cone snail species consists of up to 2 000 conopeptides or conotoxins， which are targeting voltage-gated ion channels （Na+， K+， Ca2+）， ligand-gated ion channels （nAChRs， 5-HT3R， NMDAR）， G-protein—coupled receptors （neurotensin， vasopressin）， and neurotransmitter transporters （NET）. However， the number of conotoxins identified is less than 0.5% of the total conotoxins. The genomic a-conotoxin precursor genes of A-gene superfamily contain a long intron inserted in their pro-region and divided their encoding region into two exons. The aconotoxins consist of standard four-Cys framework （CC-C-C）. Here， the C.lividus genomic DNA was used as a template for gene cloning of novel non-a-conotoxins using the conserved intron of a-conotoxins by PCR at multiple annealing temperatures. Two novel conotoxin genes， Lv HI -M01&LvXX VD-M02， were cloned from genomic DNA of C. lividus native to Hainan， China， which do not belong to classic a-conotoxins. mi-M01 encodes a new member of M-superfamily with six-Cys framework （CC-C-C-CC）. And LvWW-M02 encodes a new conotoxin of unknown gene superfamily with five-Cys framework（CC-C-C-C）， which is a new cys pattern. Gene structure， sequence characteristics and phynolgeny of the two novel conotoxins were analyzed. It is the first time showing that the conserved intron sequence of a-conotoxins exists in other gene superfamily.Key words： multiple annealing temperature； intro； phynolgeny 1polymerase chain reaction （PCR）；conotoxin gene； （Life Science Research，2015，19（2）：106?113）

全世界有大約800種芋螺，一種芋螺可以產(chǎn)生多達(dá)2000種肽類毒素，用來捕獲獵物、防御或者威懾競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手[1]。這些毒素可以作用于電壓門控離子通道（Na+，K+，Ca2+）、配體門控離子通道（nAChRs，5-HT3R，NMDAR）、G蛋白偶聯(lián)受體（神經(jīng)降壓素和血管加壓素）和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此成為藥理學(xué)探針和藥物開發(fā)研究的熱點(diǎn)，用來治療神經(jīng)痛、帕金森綜合癥、老年癡呆癥、多發(fā)性硬化癥、精神分裂癥、癲癇、中風(fēng)、肌無力、癌癥、艾滋病、關(guān)節(jié)炎等疾病[2]。

芋螺毒素肽人多數(shù)包含10～50個(gè)氨基酸和0-5個(gè)二硫鍵[3]，大致分為兩種，一種是富含二硫鍵的芋螺毒素，即含有兩個(gè)或兩個(gè)以上二硫鍵；另一種是含有一個(gè)二硫鍵或者不含二硫鍵的芋螺肽。芋螺毒素前體蛋白包含三部分：位于N端保守的信號(hào)肽區(qū)，相對(duì)保守的前體肽區(qū)和位于C端極不保守的成熟肽區(qū)[4]。根據(jù)前體蛋白信號(hào)肽的序列相似性，至今可分為A-，B1-，B2-，B3-，C-，D-，E-，F(xiàn)-，G-，H-…等26個(gè)超家族；根據(jù)芋螺毒素成熟肽區(qū)半胱氨酸骨架及二硫鍵位置的不同，可分為26類（I，II，III…XXVI）；據(jù)其藥理活行靶位又可分為α-，γ-，ζ-，δ-，ι-，κ-，μ-，ρ-，σ-，χ-，ω-11個(gè)家族[4-6]。α-芋螺毒素是指特異性結(jié)合乙酰膽堿受體的芋螺毒素，其半胱氨酸骨架為I類CC-C-C，依據(jù)Cys2與Cys3，Cys3與Cys4之間氨基酸的數(shù)量，α-芋螺毒素被分為α（3，5）、α（3.6）、α（4，3）、α（4.5）、α（4，4）、α（4，6）、α（4，7）、α（4，8）、α（5.10）9種亞家族。目前已有大量的芋螺毒素通過毒液分離、cDNA克隆和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得[7-12]，但已發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素不足其總量的0.5%。因此，不斷發(fā)現(xiàn)更多新芋螺毒素顯得尤為重要。以往研究表明，11-、12-、M-、02-、03、P、S、T-超家族基因結(jié)構(gòu)為兩個(gè)內(nèi)含子隔開3個(gè)外顯子，而α-芋螺毒素基因只含有—個(gè)內(nèi)含子，它在前體肽區(qū)隔開兩個(gè)外顯子，使得第2個(gè)外顯戶包含部分前體肽區(qū)和完整的成熟肽區(qū)[13]，且其內(nèi)含子3'末端有一定的保守性[14]。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)其保守的內(nèi)含子3'末端與3'非翻譯區(qū)設(shè)汁引物，以海南產(chǎn)疣縞芋螺基因組DNA為模板，采用多個(gè)退火溫度克隆芋螺毒素新基因，期望發(fā)現(xiàn)更多新的芋螺毒素，用于后續(xù)的結(jié)構(gòu)與功能的深入研究。1 材料與方法1.1 材料與試劑供試材料疣縞芋螺（Conus lividus）活體，從海南島、西沙群島采集，-80℃保存；海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公刮）；pMDTM19-T Vector Cloning Kit（寶生物工程（大連）有限公司）；質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；其他化學(xué)試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物由上海生工合成，試劑配制：氨芐100mg/mL，IPTG24 mg/mL，X-Gal20mg/ml。1.2毒腺基因組DNA的提取-80℃活體直接凍存的疣縞芋螺，解凍后取毒腺組織約10mg，用海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA。1.3DNA克隆與測(cè)序提取的疣縞芋螺基因組DNA約0.1μg用作PCR模板，據(jù)內(nèi)含子3'末端保守序列及3'端非翻譯區(qū)基因序列設(shè)計(jì)引物，內(nèi)含子上游引物A1：GTGGTTCTGGGTCCAGCA；下游引物A2：GTC-GTGGTTCAGACCCTC。PCR程序?yàn)?4℃10min預(yù)熱，94℃ 30 s，Tm 30 s，72℃ 30s 30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。Tm設(shè)置為46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃共11個(gè)退火溫度分別進(jìn)行PCR。將每個(gè)溫度的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因，然后與pMDTM19-T載體4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有40μL，X-gal和10μL IPTC的氨芐瓊脂LB培養(yǎng)基上挑選白色菌落，每個(gè)培養(yǎng)基挑選20個(gè)菌落，用M13引物進(jìn)行PCR檢測(cè)重組子，陽性克降送上海生工進(jìn)行測(cè)序。1.4新芋螺毒素基因序列及其遺傳進(jìn)化分析測(cè)序結(jié)果用在線下具包VecScreen和DNAstar軟件進(jìn)行分析，得到芋螺毒素基因和前體肽序列，再經(jīng)NCBI上的BIASTN和ConoServer上的exact match系統(tǒng)比對(duì)，以及與芋螺毒素專利和其他相關(guān)文獻(xiàn)中的序列比較，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的M超家族芋螺毒素基因序列和1個(gè)新的未知超家族的含有5個(gè)半胱氨酸的芋螺毒素基因序列。并且基于ConoServer數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)相似的155個(gè)M超家族Ⅲ類芋螺毒素成熟肽區(qū)的蛋白序列，采用Clusta1X2軟件[15]多重序列比對(duì)后，導(dǎo)人MEGA6.0[16]軟件，用鄰近法（neighbor-joining method）[17]，JonesTraylor Thornton（JTT）[18]模式和成對(duì)刪除空白（pair-wisedeletion of gap ）[19]構(gòu)建進(jìn)化樹。2結(jié)果與分析2.1兩個(gè)新芋螺毒素基因的克隆根據(jù)a-家族芋螺毒素保守內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)引物，以疣縞芋螺基因組DNA為模板，通過在46℃～56℃范圍內(nèi)改變退火溫度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從11個(gè)批次的PCR產(chǎn)物中，挑選了220個(gè)陽性克隆測(cè)序，通過序列比對(duì)，得到的結(jié)果中大多數(shù)是具有1類半胱氨酸模式（CC-C-C）的α-芋螺毒素。但除此之外，我們還從退火溫度為48℃的PCR產(chǎn)物中篩選克隆到一條新的、具有III類半胱氨酸模式（CC-C-C-CC）的M-超家族芋螺毒素（圖1A）。從退火溫度為52℃的PCR產(chǎn)物中篩選克隆到一條具有新的半胱氨酸模式（CC-C-C-C）的、含有5個(gè)半胱氨酸的未知超家族芋螺毒素基因（圖1B），我們將該5-Cys半胱氨酸模式定義為第27類，即XXⅦ。根據(jù)芋螺毒素系統(tǒng)命名法，將含有Ⅲ類半光氨酸骨架模式的新毒素命名為L(zhǎng)vⅢ-M01，將含有5個(gè)半胱氨酸骨架的新毒素命名為L(zhǎng)vXXⅦ-M02。成熟的芋螺毒素一般是從胰蛋白酶切割位點(diǎn)R處，經(jīng)翻譯后修飾，從前體肽中被釋放出來、據(jù)此，這兩個(gè)新芋螺毒素基因的成熟肽區(qū)，分別含有32個(gè)和22個(gè)氨基酸。以往用這種方法克隆的芋螺毒素基因都是屬于A超家族中的α-芋螺毒素，而本實(shí)驗(yàn)首次用α-芋螺毒素基因的內(nèi)含子克隆到了新的非α-芋螺毒素基因，證實(shí)了保守的α-芋螺毒素基因內(nèi)含子序列不僅存在于A-超家族芋螺毒素基因中，也存在于其他超家族中，如M-或其他未知超家族基因中。2.2LvⅢ-M01的序列特征及其遺傳進(jìn)化分析2.2.1LvⅢ-M01的歸類M-超家族芋螺毒素有8種不同的半胱氨酸骨架，但是絕大多數(shù)具有第Ⅲ類半胱氨酸模式（ CC-C-C-CC），且此模式僅存在于M超家族，目前，依據(jù)信號(hào)肽的不同，M-超家族被分為MLKM和MMSK兩大類[20]，而依據(jù)Cys4與Cys5之間氨基酸數(shù)量的不同，M-超家族又被分為M-1，M-2，M-3，M-4和M-5 5個(gè)分支；此外，由于M-超家族毒素成熟肽氨基酸數(shù)目差異較大，將5個(gè)分支中成熟肽氨基酸數(shù)目小于22的毒素稱為Min-M家族，大于22的稱為Max-M家族[21、22]。在功能方面，M-超家族芋螺毒素不僅可以阻斷鈉離子通道（μ-家族），還可以阻斷鉀離子通道（K-家族）。目前，從疣縞芋螺中克隆到的M-超家族基因，僅有M-1，M-2，M-3 3個(gè)分支（表1），我們發(fā)現(xiàn)的LvII-I-MO1成熟肽區(qū)有32個(gè)氨基酸，而CyS4與Cys5之間有4個(gè)氨基酸，可以歸為M-4分支的Max-A4家族（圖2）。2.2. LvⅢ-M01的蛋白序列特征

芋螺毒素的前體蛋白序列經(jīng)翻譯后修飾加工，信號(hào)肽區(qū)、N端和C端前體肽區(qū)會(huì)被切除，產(chǎn)生成熟肽區(qū)，成熟肽區(qū)的氨基酸再經(jīng)修飾（PTMs）和二硫鍵折疊等翻譯后加下過程，最終生成有活性的毒素物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)的新芋螺毒素九LvⅢ-M01基因，經(jīng)在線ProP1.0 Servr軟件分析，其編碼產(chǎn)生的成熟肽序列號(hào)為：NTVTEYDLEICCNHG-PCHVSFPQLCGSRPCCR[25]。將LvⅢ-M01各種公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的M-超家族芋螺毒素的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與Vr3-NPP01、Vr3-SP03和Vr3-SPO1的相似度最高，其中Vr3-SP03和Vr3-SP01的前體肽序列中，除了在信號(hào)肽區(qū)又1個(gè)氨基酸的差異外，其余部分都相同，這兩個(gè)芋螺毒素的成熟肽完全一樣。若光看成熟肽區(qū)的相似性，LvⅢ-M01與Vr3-NPP01的相似度最高，其次是Vr3-SP03和Vr3-SPOl。在LvⅢ-M01成熟肽中，除了6個(gè)保守的Cys以外，儀有5個(gè)氨基酸與Vr3-NPPOl是相同的，與Vr-SP03和Vr3-SP0的成熟肽相比僅有3個(gè)是相同的，與其他的M-超家族芋螺毒素的序列差異很大（圖3）。以往研究表明，具有第Ⅲ類半胱氨酸模式的M-超家族芋螺毒素，形成3個(gè)Loop環(huán)，含有3對(duì)二硫鍵，其連接方式為C1-C4，C2-C5，C3-C6，那么LvⅢ-M01也可能具有與此相同的二硫鍵連接方式（圖3），仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)，LvⅢ-M01的Cys3與Cys4之間多達(dá)7個(gè)氨基酸，是目前發(fā)現(xiàn)的M-4分支中LoOp2間氨基酸個(gè)數(shù)最多的芋螺毒素，同時(shí)也是M-4分支中成熟肽序列最長(zhǎng)的成員（圖3）。在半胱氨酸環(huán)以外，LvⅢ-MO1有1個(gè)長(zhǎng)達(dá)10個(gè)氨基酸殘基的N-末端，與之成熟肽相似度最高的Vr3-NPPOl，也含有1個(gè)長(zhǎng)達(dá)11個(gè)氨基酸殘基的N-末端，在這兩個(gè)芋螺毒素的長(zhǎng)N-末端中，僅有1個(gè)亮氨酸殘基（L）是相同的。這種芋螺毒素成熟肽序列高變性賦予了不同芋螺毒素對(duì)其所作用的受體或離子通道的特殊選擇性，從而也大大增加了芋螺毒素的遺傳多樣性。2.2.3LvⅢ-M01與M-超家族芋螺毒素中半胱氨酸密碼子偏好性分析。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，芋螺毒素特定位置的半胱氨酸密碼子具有高度保守性：在此，分析了LvⅢ-M01和數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的220條含有Ⅲ類半胱氨酸模式的M-超家族芋螺毒素的6個(gè)半胱氨酸的密碼子（TCT/TGC）的使用頻率（圖4A）。為了研究半胱氨酸附近的密碼子的偏好性，我們還分析了Cys1，3，4，5密碼子前面的堿基使用頻率（圖4B）。研究發(fā)現(xiàn)Cvs1，3，6密碼子明顯偏好于TGC，其中Cys3偏好率高達(dá)90%；Cys2，4，5則沒有明顯的偏好，TGC與TGT各半；LvⅢ-M01只有Cysl的密碼子是TGC，而其他5個(gè)Cys的密碼子都是TGT，這與經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析的CVs3.6密碼子都明顯偏好于TGC有所不同。此外，半胱氨酸前面的堿基明顯偏好于G與T，且Cysl，3前面的堿基偏好于G，Cys2，4前面的堿基偏好于T。芋螺毒素二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成可能在其功能可變性中發(fā)揮著重要作用[26]，首尾兩個(gè)半胱氨酸密碼子的偏好性可能利于形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)以抵抗突變，而半胱氨酸之前的堿基偏好于GT，很可能是為了保護(hù)半胱氨酸使之免受突變，因?yàn)橐恍┮鹜蛔兊膹?fù)合物如DNA-Pol-V-Iike酶會(huì)作用于半胱氨酸密碼子TGT/TGC誘導(dǎo)突變過程[27]。我們還可以推斷，G可能更有利于半胱氨酸TGC的保護(hù)，因?yàn)槠糜赥GC的半胱氨酸之前的堿基偏好于C。2.2.4LvⅢ-MO1與M-超家族芋螺毒素的遺傳進(jìn)化分析我們發(fā)現(xiàn)的新芋螺毒素LvⅢ-MOI的成熟肽序列模式是X10CCX4CX7CX4CC，在Conosever數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索所有的M-超家族中含有第Ⅲ類半胱氨酸模式（CC-C-C-CC）的芋螺毒素序列，研究其成熟肽區(qū)半胱氨酸環(huán)內(nèi)CCX2-7CX2-9CX1-5CC的遺傳進(jìn)化特征，發(fā)現(xiàn)Cys2與Cys3，Cys3與Cys4，Cys4與Cys5之間氨基酸的數(shù)量和保守性都有很大的不同，并構(gòu)建了它們的遺傳進(jìn)化樹（圖5）。該進(jìn)化樹涵蓋了迄今已知的155個(gè)M-超家族芋螺毒素成員，從進(jìn)化樹可以看出，Ⅲ類模式芋螺毒素序列分為兩大支，進(jìn)一步可以分為Ma、Mb、Mc3個(gè)分支。屬于Ma進(jìn)化枝的芋螺毒素成員最多，有63個(gè)。其序列特征為Cys2后X2-7中有一個(gè)w（色氨酸）或者A（丙氨酸），且Cys3之后X2-9中有一個(gè)G（甘氨酸），序列通式為CC-W/-C-G-C-CC （W/A+G）；其次是屬于Mb進(jìn)化枝的成員數(shù)量較多，有58個(gè)。屬于Mc進(jìn)化枝的成員數(shù)量相對(duì)最少，有34個(gè)Mb與MC：進(jìn)化枝都有保守的P脯氨酸，不同的是Mb的脯氨酸緊挨著Cys2即PCC，Mc的脯氨酸緊挨著Cys5即CCP。本研究發(fā)現(xiàn)的LvⅢM01新芋螺毒素位于Mb分支，處于圖3中五角星標(biāo)的位置，它與芋螺毒素RⅢK、GⅢB、TxⅢB、PⅢA屬于同一個(gè)小分支，關(guān)系最近。2.3LvXXVII-M02的序列分析。LvXXⅦ-M02與數(shù)據(jù)庫(kù)中的芋螺毒素序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其基因序列與A-超家族Cal.6h的相似度高達(dá)99%，其氨基酸序列與之相似度也高達(dá)98%。但是其半胱氨酸的數(shù)量與模式卻差異很大，LvXXⅦ-M02有5個(gè)半胱氨酸，并不是經(jīng)典α-芋螺毒素所含有的I類半胱氨酸模式（CC-C-C），而是未知的CC-C-C-C新模式（圖6）。以往發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素的半胱氨酸模式都是偶數(shù)個(gè)半胱氨酸，從而成對(duì)地形成二硫鍵。奇數(shù)個(gè)半胱氨酸骨架到目前為止從未命名過，因此，本文發(fā)現(xiàn)的CC-C-C-C半胱氨酸新模式命名為第27類（XXⅦ），其二硫鍵的連接方式及其功能有待進(jìn)一步研究。在LvXXⅦ-M02的5個(gè)Cys密碼子中，與上述LvⅢ-M01的類似，也只有Cysl的密碼子是TGC，而其他4個(gè)Cys的密碼子都是TGT（圖1B）。在LvXXⅦ-M02的第4個(gè)半胱氨酸（C，Cys）對(duì)應(yīng)的、與之同源性高的α—芋螺毒素的氨基酸是酪氨酸（ Y，Tyr）（圖6）。檢查這兩個(gè)氨基酸的密碼子發(fā)現(xiàn)，酪氨酸（Y，Tyr）的密碼子是TAT，與LvXXⅦ-M02中第4個(gè)半胱氨酸（C，Cys）的密碼子TGT只在第二位不同，即A變成了T（A→T），是由于相應(yīng)α-芋螺毒素的Tyr密碼子的點(diǎn)突變而產(chǎn)生的。LvXXⅦ-M02與其他α-芋螺毒素序列的差異主要體現(xiàn)在半胱氨酸殘基上，跟以往發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素基因遺傳變異主要出現(xiàn)在非半胱氨酸殘基上恰好相反，這更增加了芋螺毒素的遺傳多樣性，為其藥用開發(fā)提供了更加豐富的藥源分子。3討論

本文以α-芋螺毒素基因內(nèi)含子3'末端保守序列為PCR的上游引物，以α-芋螺毒素基因的3'非翻譯區(qū)為下游引物，采用了11個(gè)PCR退火溫度，克隆到這兩個(gè)新基因。系列退火溫度范圍為46℃～56 0C，包括46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃， 53℃，54℃，55℃和56℃。研究發(fā)現(xiàn)，只有退火溫度在48℃下的PCR產(chǎn)物條帶稍大，而且轉(zhuǎn)化后陽性克隆驗(yàn)證時(shí)，其條帶明顯比其他條帶要大，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆到的是屬于M-超家族的新芋螺毒素LvⅢ-M01。可見α-芋螺毒素保守內(nèi)含子可能也存在于其他超家族基因中，而低溫度退火有利于長(zhǎng)片段的克隆。本文得到的LvXXⅦ-M02是在退火溫度52℃發(fā)現(xiàn)的，而且其與α-芋螺毒素Ca1.6h基因序列僅有一個(gè)堿基的差別，該差別使得LvXXⅦ-M02增加了一個(gè)半胱氨酸。從上述分析可以看出，是α-芋螺毒素Ca1.6b的Tyr密碼子的點(diǎn)突變而產(chǎn)生的基因突變產(chǎn)物，發(fā)生在Cys殘基上的突變，對(duì)毒素結(jié)構(gòu)和功能的改變影響是深遠(yuǎn)的，與原祖先毒素肽大相徑庭。我們經(jīng)過多次PCR重復(fù)測(cè)序，LvⅢ-M01和LvXXⅦ-M02的基因序列都是一致的，排除了PCR擴(kuò)增突變的可能性。此外，本實(shí)驗(yàn)所用疣縞芋螺來源于海南島海域。來自不同海域的芋螺，即使是同種芋螺也可能由于環(huán)境不同而表達(dá)不同的毒素[28]，更甚取自相同海域的同種芋螺不同個(gè)體之間也存在較大的種內(nèi)等位基因的差異[29，30]，這也是新芋螺毒素基因產(chǎn)生的重要來源之一。該研究利用具有保守性的α-芋螺毒素基因內(nèi)含子序列，從海南產(chǎn)疣縞芋螺中克隆到了1個(gè)新的具有6個(gè)半胱氨酸骨架的M-超家族芋螺毒素LvⅢ-M01基因和1個(gè)含有5個(gè)半胱氨酸新穎骨架的未知新家族芋螺毒素LvXXⅦ-M02，并對(duì)它們的基因結(jié)構(gòu)、成熟肽序列、以及LvⅢ-M01與其他M-超家族芋螺毒素的遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了深入分析。

為了深入研究LvⅢ-M01的分類地位及其遺傳進(jìn)化關(guān)系，我們基于Conosever數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了M-超家族芋螺毒素成熟肽區(qū)半胱氨酸環(huán)（CCX2-7CX2-9CX1-5CC）內(nèi)的進(jìn)化樹，從而發(fā)現(xiàn)了3個(gè)Loop區(qū)氨基酸的保守性，并據(jù)此分為Ma、Mb、Mc3個(gè)進(jìn)化枝支。之前的研究也有將O-超家族芋螺毒素分為01、02、03[9]，I-超家族分為I1、I2、I3[31]，但它們都是依據(jù)信號(hào)肽的保守性來進(jìn)行分類的，與真正起活性的成熟肽序列之間沒有太多的聯(lián)系。本文依據(jù)成熟肽氨基酸保守性進(jìn)行分類，這樣更便于指導(dǎo)研究芋螺毒素的功能。μ-家族芋螺毒素主要是通過離子靜電相互作用結(jié)合于鈉離子通道（Nav），從而阻斷離子電導(dǎo)[32，33]，例如PⅢA、TⅢA、GⅢA從屬于Mb分支，主要阻斷Nav1.4，其原因是這3種芋螺毒素在Loop3區(qū)都有一個(gè)精氨酸與Nav1.4的關(guān)鍵氨基酸I區(qū)Glu403和Ⅱ區(qū)Glu758相互作用[2.34-36]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的LvⅢ-M01 Loop3區(qū)也有一個(gè)精氨酸Arg（R），由此可推斷LvⅢ-M01有可能會(huì)阻斷Nav1.4，起到鎮(zhèn)痛的療效，其確切的功能有待進(jìn)一步研究。

最后，本研究利用α—芋螺毒素保守內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)引物，從海南產(chǎn)疣縞芋螺中克隆到新的兩條非α-芋螺毒素基因，不僅首次證實(shí)了α-芋螺毒素保守內(nèi)含子序列可能還存在于其他超家族基因中，如M-超家族的μ-家族，而且擴(kuò)充了芋螺毒素基因庫(kù)，豐富了芋螺毒素的多樣性，為下一步的人工合成、結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定廠基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)（References）：[1]GERWIG G J， HOCKING H G， STOCKLIN R， et d. Glycosylation of conotoxins[J]. Marines Drugs， 2013， 11（3）： 623-642. [2]LEWIS R J， DUTERTRE S， VETTER I，et al. Conus venom peptide pharmacology [J]. Pharmacological Reviews，2012，64（2）：259-298.[3]TERLAU H， OLIVERA B M. Conus venoms： a rich source of novel ion channel-targeted peptides [J]. PhysioJ Reviews. 2004， 84（l）：41-68.[4]HILLYARD D K， OLIVERA B M， WOODWARD S， et al. A molluscivorous Conus toxin： conserved frameworks in conotoxins[J].Biochemistry，1989，28（1）：358-361.[5]KAAS Q， YU R， JIN A H， et al. ConoServer： updated content， knowledge， and discovery tools in the conopeptide database[J].Nucleic Acids Research，2012，40（Database issue）JD325-D330.[6]KAAS Q， WESTERMANN J C， CRAIK D J. 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