蔣丹等

摘要血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）和激肽釋放酶-肽酶系統(tǒng)（KKS），抑制血管緊張素II的生成，減少緩激肽的降解，從而達(dá)到降血壓的目的；植物來源的天然化合物具有來源廣泛、結(jié)構(gòu)多樣、特異性高、毒性低等特點(diǎn)，因而從植物中篩選安全有效的ACEI成為研究熱點(diǎn)。在此綜述了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的活性測(cè)定方法以及植物來源的不同結(jié)構(gòu)類型的ACEI研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞ACE活性測(cè)定；ACEI；植物源化合物

中圖分類號(hào)R282.71文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）29-023-04

截止至2013年5月，我國(guó)高血壓患者人數(shù)已突破3.3億，每3名成人中有1人患高血壓，其常見并發(fā)癥是腦卒中、心臟病及腎病，嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康。高血壓治療目標(biāo)是通過降壓治療使患者的血壓達(dá)標(biāo)（即血壓<140/90 mmHg），最大限度地降低心血管發(fā)病和死亡危險(xiǎn)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）是常用的降壓藥，治療高血壓的效果是明確的，尤其對(duì)高血壓伴充血性心力衰竭、心肌梗死后、左心功能不全、糖尿病腎病、蛋白尿者有益。一系列大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)期應(yīng)用ACEI治療高血壓，可明顯降低腦卒中及心血管事件的發(fā)生率。目前，開發(fā)和應(yīng)用ACEI作為降壓藥備受關(guān)注。ACEI的主要來源是化學(xué)合成、蛋白水解肽和植物提取物。合成法制備的ACE抑制劑成藥較早，且發(fā)展很快，藥效強(qiáng)勁，降壓效果明顯，但此類藥副作用明顯，常見有低血壓癥、腎功能損害、高血鉀癥、咳嗽、血管神經(jīng)性水腫、皮疹、味覺障礙等。天然來源的ACEI具有結(jié)構(gòu)多樣、來源廣泛、毒性較低等特點(diǎn)，筆者在此對(duì)ACE活性的測(cè)定方法及ACEI的結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行綜述，為高效低毒植物來源ACEI開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1ACE活性測(cè)定方法

1.1體外活性檢測(cè)

目前對(duì)體外血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性測(cè)定方法有分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、熒光法和毛細(xì)管電泳法（CE）等。

1.1.1分光光度法測(cè)定。

1971年，Cushman等建立了紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制劑的活性。分光光度法測(cè)酶活是以馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）或馬尿酰-甘氨酰-甘氨酸（HGG）為底物，底物被ACE分解產(chǎn)生馬尿酸和二肽，根據(jù)測(cè)定的馬尿酸或二肽的含量結(jié)合所得馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出ACE活力[11-12]。1981年Hurst等建立了動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)血清ACE活力，ACE催化底物HHL裂解，釋放出的馬尿酸與呈色劑在383 nm處有吸收，根據(jù)吸光度A求出ACE活力。駱琳等[14]建立了高通量ACE活性測(cè)定的96孔板法，該方法以呋喃丙烯酰三肽（FAPGG）為模擬底物，通過340 nm處吸光值的下降衡量ACE的活性，最多可同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品，上機(jī)分析時(shí)間僅需10 s，且該方法重性好、精密度高。采用分光光度法測(cè)酶活性具有設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉且重復(fù)性好的特點(diǎn)，是目前普遍采用的方法。

1.1.2高效液相色譜法。

高效液相色譜法可將底物HHL或HGG與產(chǎn)物馬尿酸完全分離，通過測(cè)定馬尿酸的生成量來評(píng)價(jià)ACE活性并計(jì)算抑制率。Wu等用C18色譜柱、梯度洗脫的方法成功分離了ACE的反應(yīng)產(chǎn)物與底物，建立了ACE酶活測(cè)定方法。洪韞嘉等以含0.1%甲酸和0.1%三乙胺的乙睛-水（22∶78，V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，在8 min內(nèi)完成了分析檢測(cè)，縮短了分析時(shí)間，該方法可用于ACEI的快速篩選。苑園園等用乙睛-水（20∶80，V/V，含0.5‰甲酸）為流動(dòng)相，流速1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm，柱溫35 ℃，在7 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)底物和產(chǎn)物的完全分離，分析速度快、操作簡(jiǎn)便。采用高效液相色譜法測(cè)定ACE酶活，相比分光光度法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、分析時(shí)間短等特點(diǎn)，但缺點(diǎn)是需要大型設(shè)備。

1.1.3熒光檢測(cè)法。

熒光檢測(cè)法用修飾后的酶底物作為熒光探針，通過檢測(cè)催化作用前后底物的熒光信號(hào)變化來判斷，該方法適用于成分復(fù)雜的反應(yīng)體系中，酶活較低時(shí)就可以充分利用熒光法高度靈敏的優(yōu)勢(shì)。ACE水解產(chǎn)物的組氨酰部分在堿性條件下與鄰苯二甲醛反應(yīng)生成熒光物，潘曦等用熒光光度法檢測(cè)該熒光物，從而測(cè)得ACE活性。熒光檢測(cè)法靈敏度高，酶活較低時(shí)可采用此方法，但該方法設(shè)備投入較高而限制了其應(yīng)用。

1.1.4毛細(xì)管電泳法。

毛細(xì)管電泳法是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。目前，用于ACE活性檢測(cè)的方法和毛細(xì)管區(qū)帶電泳法和毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法（MECC）。

Zhang 等采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測(cè)定了ACE的體外活性，建立了分析ACE活性的新方法，但未將生成物His-Leu和底物His-His-Leu完全分離。而高效毛細(xì)管電泳測(cè)定法解決了毛細(xì)管區(qū)帶電泳生成物分不開的缺點(diǎn)，用50 mmol/L pH 8.3 磷酸緩沖液（含1%的SDS）將HHL和HL完全分離，7 min即可完成分析過程。

徐小華等建立了MECC法快速測(cè)定ACE活性的方法，通過對(duì)電壓的分析、上樣時(shí)間的選擇、電極緩沖體系的調(diào)整，最后確定了電壓8.1 kV、上樣時(shí)間1 s、緩沖體系為pH 90 20 mmol/L 硼酸鹽緩沖液（含50 mmol/L SDS）時(shí)，分離效果最好。劉陽等用與徐小華等類似的條件，分析了人血清中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性，該法緩沖液是20 mmol/L pH 9.0 硼酸-硼酸鹽緩沖液（含50 mmol/L的SDS），壓力進(jìn)樣3 s、電壓16 kV、電泳時(shí)間7.5 min，5 min內(nèi)即實(shí)現(xiàn)了HHL與馬尿酸的分離。劉猛等在臨床試驗(yàn)中采用了劉陽等的方法，測(cè)定受試患者血清ACE活性。毛細(xì)管電泳法具有分離速度快、分離效果高、重現(xiàn)性好、樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)；但價(jià)格相對(duì)比較昂貴，且操作要求高、難度大，限制了該方法的使用推廣。

1.1.5酶偶聯(lián)法。

金化民等提出了用酶偶聯(lián)法測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的方法，前步反應(yīng)與Cushman等法一致，以Hip-Gly-Gly為底物，生成Hip和雙甘肽Gly-Gly，加入L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺（GGCN）和γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（GGT），催化GGCN與Gly-Gly偶聯(lián)，產(chǎn)生的3-羧基-4-硝基苯胺于410 nm檢測(cè)，此方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，適用于手工操作。

1.2體內(nèi)活性檢測(cè)

研究表明，體外檢測(cè)活性很高的ACEI，體內(nèi)檢測(cè)卻不一定有抑制活性。這是因?yàn)榻?jīng)過消化道內(nèi)酶的分解后，一些具有活性的物質(zhì)可能會(huì)被降解而失去活性，因此體內(nèi)檢測(cè)是評(píng)價(jià)ACEI功效的一個(gè)必要手段。

動(dòng)物試驗(yàn)是評(píng)價(jià)降血壓物質(zhì)效果的有效方法。用ACEI檢測(cè)的動(dòng)物試驗(yàn)可分兩類，一類是以原發(fā)性高血壓大鼠為試驗(yàn)對(duì)象，通過口服和靜脈注射不同劑量的ACEI來測(cè)定動(dòng)脈收縮壓的大小，并與對(duì)照組進(jìn)行比較；另一類是對(duì)己經(jīng)麻醉的大鼠通過靜脈注射六甲銨，再給其注射ACEI，通過與對(duì)照組進(jìn)行比較，研究ACE抑制劑的活性。

體內(nèi)檢測(cè)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、成本高，使其廣泛應(yīng)用受到限制，對(duì)于ACEI的開發(fā)來說，一般是先利用體外檢測(cè)方法進(jìn)行高通量、低成本、快速準(zhǔn)確的篩選，再通過體內(nèi)檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的工業(yè)化。

2植物來源的ACEI

近年來，從植物中篩選藥效高、毒性小的ACEI備受關(guān)注，研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)植物中多酚、黃酮、生物堿等化學(xué)成分能抑制ACE活性，可能成為有效的降血壓藥物。

2.1多酚類

多酚是多元酚類化合物，廣泛地存于各種蔬菜、水果和天然藥用植物中，具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、美容減肥等多種功效，并對(duì)多種酶的抑制作用。

丹參是益氣活血和治療心腦血管疾病的常用中藥，其有效成分主要是脂溶性的丹參酮和水溶研究了酸棗仁、何首烏、絞股藍(lán)、金銀花等8味中藥對(duì)ACE的抑制作用，并對(duì)ACE抑制率最高（87.3%）的金銀花提取物進(jìn)行了分離，發(fā)現(xiàn)其主要成分是綠原酸，但對(duì)純的綠原酸是否具有ACE抑制活性未進(jìn)行驗(yàn)證。王藝璇等研究了不同品種、成熟度的蘋果多酚對(duì)ACE活性的影響，發(fā)現(xiàn)未成熟的蘋果多酚含量高，ACE抑制活性更強(qiáng)。

2.2黃酮類

黃酮類化合物是具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的一類化合物，其羥基化合物以游離和糖苷的形式廣泛分布于植物界，具有抗氧化、抗病毒、降血糖、降血脂等藥理作用。

朱福等研究發(fā)現(xiàn)醋柳總酮黃酮（TFH）及其單體槲皮素（Que）、異鼠李素（Isor）對(duì)培養(yǎng)的兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（ASMC）ACE活性及血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成有顯著持久的抑制作用，且持續(xù)時(shí)間較卡托普利明顯延長(zhǎng)，對(duì)血漿ACE活性及AngⅡ 生成也有短暫抑制作用，這可能是其降壓及保護(hù)心血管的重要機(jī)制之一。劉發(fā)等研究了紅花（Carthamus tinctorius L.）中的紅花黃素的降壓作用，發(fā)現(xiàn)紅花黃素對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠具有明顯的降壓作用，其作用可能是通過抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。Ovaskainen等分析指出原花青素低聚體對(duì)ACE活性有很強(qiáng)的抑制作用，其中尤以二聚體和六聚體作用最為顯著。Lacaille-Dubois等通過體外篩選的方法研究原傘木、天蠶蛾物種和銳刺山楂中的不同組分和化合物對(duì)ACE的抑制作用，發(fā)現(xiàn)黃酮和原花青素在0.33 mg/ml的濃度下具有顯著的ACE抑制活性。

近年來，研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種黃酮類化合物對(duì)ACE有抑制作用，黃酮類ACE抑制劑如表1所示，部分黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

43卷29期蔣 丹等植物源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的研究進(jìn)展

2.3生物堿

生物堿是科學(xué)家研究最早的一類生物活性天然產(chǎn)物，它指的是具有堿性和顯著生物活性的含氮有機(jī)化合物。鉤藤堿是茜草科植物鉤藤的主要成分，具有降低血壓力、抗心律失常等作用，臨床用于治療高血壓、支氣管哮喘、癲癇等疾病。王珺穎從平貝母中分離得到3個(gè)甾類生物堿（去氫貝母堿、貝母堿和貝母素）均對(duì)ACE有抑制活性，測(cè)得這3個(gè)化合物的IC50分別為165.0、312.8、526.5 μmol/L，這是甾類生物堿對(duì)ACE具有抑制作用的首次報(bào)道。龍吉美

等在研究鉤藤堿對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎損傷的作用機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿能增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性，調(diào)控血管

緊張素受體，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和血管緊張素原mRNA的表達(dá)。李運(yùn)倫研究還發(fā)現(xiàn)鉤藤堿和異鉤藤堿能夠抑制血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的血管平滑肌增殖，因此可能對(duì)防治高血壓血管重塑具有積極的意義。

2.4萜類

萜類化合物是廣泛存在于自然界的天然烴類化合物，由異戊二烯分子聚合衍生而生，具有祛痰、止咳、驅(qū)風(fēng)、發(fā)汗、驅(qū)蟲、鎮(zhèn)痛等功效。靈芝三萜是靈芝中的重要活性成分，具抗腫瘤、抗病毒、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、抗氧化等活性。另外，梔子總環(huán)烯醚萜苷、樟芝三萜等均能夠抑制ACE的活性，是潛在的降血壓藥物。

2.5其他

近來年，很多學(xué)者均致力于植物源ACEI的研究和開發(fā)，李小多等比較了32種中藥對(duì)ACE的抑制作用，并對(duì)抑制作用最強(qiáng)的枸杞進(jìn)一步分離，得到2種化合物，一種東莨菪糖苷類物質(zhì)，另一種是莨菪亭，其中東莨菪糖苷類物質(zhì)對(duì)ACE的抑制率達(dá)96.67%。 Tsai等用不同溶劑提取蕎麥的不同部位，發(fā)現(xiàn)普通蕎麥殼的50%乙醇提取部分有較強(qiáng)的ACE抑制活性，但沒有對(duì)抑制ACE活性成分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

3展望

近年國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物源ACEI進(jìn)行了大量研究，篩選出種類繁多、抑制性強(qiáng)的ACEI，從植物中分離ACE抑制劑主要集中在活性藥物種類和活性部位的篩選，但其中的構(gòu)效關(guān)系與作用機(jī)理尚不明確，且很多植物中的活性成分含量較低，難以大量分離提取。因此，在尋找具有ACEI活性的植物資源、獲得新型ACEI的同時(shí)，應(yīng)明確其作用機(jī)理。同時(shí)，可通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)篩選更高效無毒的抑制劑，或利用生物化學(xué)方法對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行改造以獲得更穩(wěn)定高效的ACEI成為今后研究的方向。

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