劉亞等

摘要[目的] 對深圳梧桐山毛棉杜鵑根內(nèi)真菌進(jìn)行分離、鑒定，為深圳梧桐山毛棉杜鵑優(yōu)良菌株的篩選奠定基礎(chǔ)。[方法]采用根段直接培養(yǎng)法從毛棉杜鵑的根內(nèi)分離得到14個菌株，采用rDNAITSPCR分子生物學(xué)方法對所得菌株進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]深圳梧桐山毛棉杜鵑根內(nèi)真菌豐富，所獲的14個菌株均屬于子囊菌門（Ascomycota）；除瓶頭霉屬（Phialocephala）和軟盤菌屬（Mollisa）外，其余菌株分別與Bionectria ochroleuca、Gloeotinia temulenta、Aspergillus sydowii、Paecilomyces javanicus和Fusarium oxysporum同源或近緣，均首次在杜鵑花科植物根內(nèi)發(fā)現(xiàn)。[結(jié)論]該研究為毛棉杜鵑菌根化育苗技術(shù)的優(yōu)良菌株篩選研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞毛棉杜鵑；根內(nèi)真菌；菌落形態(tài)； rDNA ITS序列

中圖分類號S718.81文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）29-009-04

毛棉杜鵑（Rhododendron moulmainense）為杜鵑花科杜鵑屬馬銀花亞屬常綠灌木或小喬木，其花朵艷麗，花色豐富，具有較高的觀賞價值。深圳市梧桐山風(fēng)景名勝區(qū)有較大面積的毛棉杜鵑天然林，盛花期整體景色壯麗，是該景區(qū)的特色景點。開展毛棉杜鵑資源的開發(fā)利用，不僅具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，也具有較高的社會效益和生態(tài)效益。

杜鵑花科植物為典型的菌根依賴型植物，能與真菌形成具有圈狀結(jié)構(gòu)的菌根共生體，即杜鵑花菌根（Ericoid mycorrhiza）。不同種類的杜鵑花屬植物或不同生態(tài)環(huán)境的同種杜鵑花植物，其根內(nèi)真菌的種類和組成具有較大差異性。筆者采用根段培養(yǎng)法，對深圳梧桐山野生毛棉杜鵑根內(nèi)真菌進(jìn)行分離與培養(yǎng)，并運用rDNAITSPCR分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌株鑒定，探討毛棉杜鵑菌根真菌多樣性，以期為毛棉杜鵑菌根化育苗技術(shù)的優(yōu)良菌株篩選研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料梧桐山自然風(fēng)景區(qū)位于廣東省深圳市東部，113°17′～114°18′E，22°23′～22°43′N。2014年3月下旬于梧桐山自然風(fēng)景區(qū)采集一批毛棉杜鵑野生幼苗作根內(nèi)真菌的分離研究。

1.2方法

1.2.1根內(nèi)真菌的分離及培養(yǎng)。根內(nèi)真菌分離培養(yǎng)基使用改良的馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基，菌株培養(yǎng)基使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。選取毛棉杜鵑健壯纖細(xì)的根系，在清水中洗凈泥土和雜質(zhì)，瀝干水分。在超凈工作臺下先在75%乙醇中浸泡15 s，無菌水漂洗3～5次；再在0.1%升汞中浸泡1～2 s，無菌水漂洗3～5次。把根系剪成長約0.5 cm的小段，用無菌濾紙吸干水滴，每個平板5條根段，置于分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)，共50個根段。用接種棒蘸取少量最后一遍漂洗根系的無菌水，均勻涂抹于平板，作為對照排除雜菌。把培養(yǎng)根段和對照的平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)14～28 d。

待菌落從根段中長出，用接種針挑取菌絲至PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)的一致性和均勻性。若菌落形態(tài)有差異，進(jìn)行二次分離，如此反復(fù)直至純化。把純化后的菌株根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行描述記錄和分類整理，包括菌落直徑、顏色、質(zhì)地、是否有液體分泌物、邊緣、菌落外形等。

1.2.2菌株分子生物學(xué)鑒定。

菌株DNA提取參考莊彩云等方法。PCR擴增采用真菌通用引物，ITS1F：5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3′，ITS4B：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′。PCR擴增體系（25 μl）：2×MightyAmp Buffer Ver.2（Mg2+，dNTP plus）（TaKaRa）12.5 μl；引物各0.8 μl；DNA模板20 ng；MightyAmp DNA Polymerase（1.25 U/μl）（TaKaRa）0.5 μl；ddH2O定容至25 μl。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，38個循環(huán)；68 ℃延伸7 min。

ITS區(qū)段PCR擴增產(chǎn)物的檢測及測序：12 g/L PCR產(chǎn)物的Agarose在80 V電壓下電泳40 min，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)檢測，若條帶清晰則樣品可用于測序。

PCR擴增產(chǎn)物測序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。把得到的序列提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast相似性比對，下載相似度較高的序列，經(jīng)過ClustalX軟件比對并校正后，采用MEGA6軟件的NeighborJoining程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1菌落形態(tài)

從野生毛棉杜鵑幼苗根內(nèi)分離純化14個菌株，按照菌落的形態(tài)特征分為6類（表1）。接種于PDF培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)21 d后，生長最快的菌株菌落直徑可達(dá)8.0 cm，生長最慢的僅有0.8 cm；菌落顏色以灰色或深灰色為主，還有白色和黃色；質(zhì)地多為絨氈狀，還有薄蠟質(zhì)和銀耳狀；均沒有液體分泌物；少數(shù)菌落中間隆起。

43卷29期劉 亞等深圳梧桐山毛棉杜鵑根內(nèi)真菌的分離與鑒定

2.2菌株ITS序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

把測得的序列提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast相似性比對（表2）。下載相似度最高及較高的序列，以親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)的Schizophyllum commune（GeneBank登錄號EF155505）為外群，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），14個菌株聚為11類。其中，菌株2、3、7、8與Mollisia聚在一起獲得99%的支持率，序列相似度均達(dá)到99%；菌株7、8與Mollisia cinerea的序列相似度均達(dá)到93%。菌株13和10與Phialocephala 具有99%的序列相似度，菌株13與P. fortinii菌株（GeneBank登錄號AB671499）的相似度為99%。菌株1和菌株4分別與GeneBank登錄號EU076958 菌株 （Uncultured Helotiales sp.） 和KF498574.1菌株 （Sordariomycetes sp.） 具有較高的相似度（表2）。

此外，菌株6、9、11、12和14分別與Bionectria ochroleuca、Gloeotinia temulenta、Paecilomyces javanicus、Fusarium oxysporum、Aspergillus sydowii等菌株聚在一起，序列相似度在99%以上，表明它們與對應(yīng)菌株同源或為同一菌種。

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

從深圳梧桐山毛棉杜鵑野生幼苗根段中分離得到14個內(nèi)生真菌的菌株。依據(jù)菌落形態(tài)特征分為6類，菌落顏色以灰色或深灰色為主；基于rDNAITS序列分析和NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，14個菌株聚為11類，均隸屬于子囊菌門，其中柔膜菌目菌株的數(shù)量（菌株2、3、7、8、13、10、4、9）最豐富，占菌株總數(shù)的57.1%。

3.2討論

3.2.1菌株數(shù)量和菌株類型數(shù)量。

張春英從浙江、湖南等4個樣地采集了24株云錦杜鵑（每個樣地分別采集6株，取200個根段），從800個根段中共分離培養(yǎng)得到280個菌株。應(yīng)用菌落形態(tài)、菌絲體顯微特征和rDNAITS片段的RFLP圖譜分析，確定了14個RFLP類型和3個未能鑒定的類型。在14個RFLP類型中，有7個類型與現(xiàn)有的杜鵑花類菌根菌親緣關(guān)系密切，分別為Oidiodendron maius、Cryptosporiopsis ericae和5種尖苞樹科植物的內(nèi)生真菌的同源或近緣種；2個類型為黑色有隔內(nèi)生真菌，即Phialocephala類。楊兵采用與張春英的研究方法，從上海、杭州、寧波3個地區(qū)18株毛鵑的600個根段內(nèi)，分離培養(yǎng)得到366個菌株，確定了19個RFLP類型，其中9個類型為尖苞樹科尖苞樹屬植物的內(nèi)生真菌，另有8個未知的子囊菌和2個其他未知類型。劉振華從吉林、重慶、云南3個樣地的牛皮杜鵑（Rhododendron chrysanthum）、小杜鵑（Rhododendron）、越橘（Vaccinium）等9種共24株杜鵑中，分離培養(yǎng)得到500個菌株，利用菌落形態(tài)結(jié)合rDNAITS序列分析鑒定出3種杜鵑花類菌根真菌Oidiodendron maius、Meliniomyces variabilis、Cryptosporiopsis ericae，1種黑色有隔內(nèi)生真菌Phialocephala fortinii和2種尖苞樹科植物內(nèi)生真菌或其近緣種。

深圳梧桐山毛棉杜鵑自然群落中極少見到野生幼苗，采集的樣本較少，但在50個根段內(nèi)分離得到14個菌株，經(jīng)過ITS序列分析被歸為11類不同菌種的同源或近緣種。雖然采樣植株較少，菌株數(shù)量不多，但菌株類型較豐富，反映了梧桐山毛棉杜鵑根內(nèi)真菌也具有較高的菌種多樣性。

3.2.2菌落形態(tài)分類和ITS分子分類結(jié)果的比較。

傳統(tǒng)的真菌鑒定方法依據(jù)菌落形態(tài)特征及菌體的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)，但真菌形態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且不少菌種的菌落形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)在不同培養(yǎng)基上會發(fā)生變化。另一方面，大多數(shù)菌根真菌在培養(yǎng)過程中不產(chǎn)生孢子，更增加了菌種鑒定的困難。隨著GeneBank數(shù)據(jù)庫的建立和生物信息學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用rDNAITS序列分析進(jìn)行真核生物的系統(tǒng)發(fā)育、分類鑒定和多樣性研究已成為一種有效且快速的方法。

其他學(xué)者對杜鵑花類菌根菌的研究也表明不同菌落形態(tài)的菌株的rDNA序列具有同源性。在該研究所獲得的14個菌株中，根據(jù)菌落形態(tài)特征和rDNA ITS序列分析分別劃分為6類和11類，所獲結(jié)果稍有差異。其中，同屬菌落形態(tài)C類的菌株1、10、13，在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹上并未聚在一起，菌株1與菌株10和13的分支距離很遠(yuǎn)。分別同屬菌落形態(tài)D類的菌株（菌株6、14）和菌落形態(tài)F類的菌株（菌株9、11、12），也在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹上分離。然而，有些菌落形態(tài)類似的菌株，如菌株2、3、7、8，在rDNA序列上具有一致性，反映了它們是同一種或近緣種。由此可見，rDNAITS序列分析結(jié)果更可信。

3.2.3菌株鑒定。

目前國內(nèi)外已有研究表明，從杜鵑花科植物中分離并回接確認(rèn)為杜鵑花類菌根真菌的都屬于子囊菌類。該研究對毛棉杜鵑進(jìn)行菌根分離得到的14個菌株均屬于子囊菌門，分別屬于柔膜菌目、肉座菌目、散囊菌目。其中菌株2、3、7、8與皮盤菌科軟盤菌屬Mollisia同源；菌株7和8與M. cinerea的序列相似度達(dá)93%，反映了它們具有較高的同源性。楊秀麗[11]和劉鳳紅等[12]分別在大興安嶺地區(qū)的杜香（杜鵑花科杜香屬）和長白山地區(qū)的篤斯越橘根內(nèi)也分離得到同屬Mollisia minutella的同源菌株；劉仁陽等在梵凈山雷山杜鵑的根內(nèi)也分離得到M. cinerea的同源菌株，反映了Mollisia屬菌種可與杜鵑花科植物形成菌根共生體。

該研究還分離獲得了2個與Phialocephala具有較高同源性的菌株，其中1個與P. fortinii具有99%的序列相似度（菌株13）。Phialocephala屬的真菌通常被歸為深色有隔內(nèi)生真菌[13]。近年有關(guān)Phialocephala屬的真菌在杜鵑花科植物根內(nèi)出現(xiàn)的研究已有報道，如楊秀麗[11]、劉鳳紅等[12]和劉振華[9]分別報道了Phialocephala屬同源或近緣真菌為大興安嶺地區(qū)和長白山地區(qū)杜鵑花科植物菌根菌的優(yōu)勢種。

該研究未分離到Hymenoscyphus eircae、Oidiodendron sp.、Cryptosporiopsis ericae、Meliniomyces variabilis等典型的杜鵑花類菌根菌種。值得關(guān)注的是分離獲得的Bionectria ochroleuca、Gloeotinia temulenta、Aspergillus sydowii（聚多曲霉）、Paecilomyces javanicus（爪哇擬青霉菌）和Fusarium oxysporum（尖孢鐮刀菌）的同源或近緣種，均是首次在杜鵑花科植物根內(nèi)出現(xiàn)。其中，Bionectria ochroleuca對多種植物病原菌具有拮抗作用[14-15]；Gloeotinia temulenta和Fusarium oxysporum通常為植物致病性真菌[16-18]；Paecilomyces javanicus為昆蟲天敵真菌[19]。該研究回接了2個曲霉菌株到毛棉杜鵑幼苗上，未見有致病性且具有促生作用（另文報道），它們與毛棉杜鵑的生態(tài)關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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