戈媛媛 趙東容 沈偉清 張建華

摘要：為掌握白僵菌發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)，白僵菌可工業(yè)化生產(chǎn)，以宜昌夷陵區(qū)白僵菌菌種為材料，對白僵菌液體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基、菌種生長形態(tài)、生長環(huán)境的pH值進行試驗研究，從而確定轉(zhuǎn)罐時間等液體發(fā)酵罐發(fā)酵技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明：在液體發(fā)酵培養(yǎng)中，碳、氮、磷為白僵菌生長必需的三要素，不同生長時期三要素比例不同，初期加入少量微量元素有助于提高白僵菌孢子生長速率和增加數(shù)量;在白僵菌液體發(fā)酵生長史中，初始pH值為6，繼而在pH值4～5的環(huán)境中生長速率最快;前42～45h在種子罐中主要產(chǎn)菌絲體，在轉(zhuǎn)罐后21～26h發(fā)酵罐中主要產(chǎn)孢子體。

關(guān)鍵詞：白僵菌;液固兩相發(fā)酵技術(shù);發(fā)酵罐;工業(yè)化

中圖分類號：S476.12文獻標識碼：A文章編號：1004-3020（2015）03-0029-04

TechnologyResearchofLiquidFermentationTankCultureofBeauveriabassiana

GeYuanyuan（1，2）ZhaoDongrong（1，2）ShenWeiqing（2）ZhangJianhua（1）

（1.DangyangCityForestPestControlandQuarantineStationYichang444100;

2.BeauveriaBassianaFactoryofDangyangCityForestPestControlandQuarantineStationYichang444100）

Abstract：InordertomasterthetechnologyoffermentationcultureofBeauveriabassiana，andputthecultureofexpandingBeauveriabassianaintoindustrialproduction，weusedBeauveriabassianastrainofYilingdistrict，YichangasthematerialandfermentationtechnicalparameterssuchastheappropriateliquidfermentationmediumandthegrowthmorphologyofstrainandpHvaluesofgrowthenvironmentwerestudiedbyliquidfermentationtankculturewhichcouldhelpidentifythetimeoftransferringliquidfromseedtanktofermentationtank.TheresultsshowedthatCarbon，NitrogenandPhosphoruswerethreekindsofnecessarynutrientelementsintheliquidfermentation.Besides，thesethreeessentialfactorsforthegrowthofBeauveriabassianahaddifferentproportion，theadditionofasmallamountofmicroelementintheliquidfermentationmediumattheearlystagecouldincreasegrowthrateandthenumberofBeauveriabassianaevidently;Beauveriabassianahasthecyclicgrowthhistorythatismutualtransformationbetweensaprophyteandmyceliuminitsmultistagecontinuousliquidfermentation，andthecomparativeanalysisofsporeformandthenumbersshowedthatthefastestgrowthappearedinthepHvaluebetween4and5whichthegrowthenvironmentofBeauveriabassianaownedbyselfregulationandartificialadjustment，althoughwehadgivenconditionthatthemediumwasapHof6initially;ConsideringthegrowthmorphologyandthenumberandtheactivityofBeauveriabassianaandtheworkshopoperationschedule，wemadethefollowingarrangements，andthefirstprocesswasproducingmyceliumintheseedtankfor42～45hours，andthesecondonewasproducingsaprophytewhichwasthestrainofsolidfermentationproductioninthefermentationtankfor21to26hours.

Keywords：Beauveriabassiana;solidliquidtwophasefermentationtechnology;fermentationtank;industrialization

白僵菌Beauveriabassiana是一種半知菌類的蟲生真菌，通過附著于蟲體表面，產(chǎn)生脂肪酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶溶解昆蟲的表皮，穿透昆蟲體壁在昆蟲體內(nèi)大量增殖，消耗寄主體內(nèi)養(yǎng)分，并不斷產(chǎn)生白僵素（大環(huán)脂類毒素）和草酸鈣結(jié)晶[1]這些物質(zhì)，引起昆蟲中毒，使體液機能發(fā)生變化，打亂新陳代謝以致死亡。從1890年美國的堪薩斯州將白僵菌供應給農(nóng)戶防治麥長蝽[2]，到1939年蘇聯(lián)的波斯必洛夫和謝胡里娜利用白僵菌防治森林害蟲松尺蠖，至今，由于白僵菌高孢粉無毒、無味、無環(huán)境污染、害蟲一經(jīng)感染可持續(xù)傳播等優(yōu)勢，白僵菌高孢粉已被作為國家林業(yè)局推廣的高效生物殺蟲劑之一，廣泛應用于松毛蟲、玉米螟、蠐螬等60多種農(nóng)林害蟲[1]。而同大多數(shù)應用于醫(yī)療、工業(yè)中的真菌生產(chǎn)一樣，白僵菌菌種培養(yǎng)也經(jīng)歷由液體、固體培養(yǎng)基單純性發(fā)酵到液固兩相發(fā)酵的改革。液固兩相發(fā)酵法將液體深層發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種方法相結(jié)合，克服單純液體發(fā)酵生產(chǎn)的芽生孢子穩(wěn)定性差的缺點，盡可能多的避免了由生產(chǎn)周期長造成的發(fā)酵中毛霉、黃曲霉等雜菌污染，以及隨氣候溫、濕度變化的影響造成“燒盤”[3]等現(xiàn)象，最大限度地利用了固體表面上產(chǎn)生氣生分生孢子的優(yōu)點，同時縮短了菌絲生長周期，生產(chǎn)方法簡便，原料易得，能耗成本低。因此，利用液固兩相發(fā)酵規(guī)模化、高科技、高效率生產(chǎn)意義重大，更有廣闊前景。在此筆者通過長期實驗，并同湖北省當陽市森防站白僵菌廠規(guī)模生產(chǎn)實踐，于2014年成功進行發(fā)酵罐生產(chǎn)高孢粉7t的基礎(chǔ)上，對液固兩相發(fā)酵技術(shù)中白僵菌發(fā)酵罐培養(yǎng)進行初步研究，為白僵菌擴大培養(yǎng)從而投入工業(yè)化生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種的制備

將選育的優(yōu)良菌種（使用的是從宜昌夷陵區(qū)僵蟲身上分離提純的白僵菌菌種）在超凈無菌工作臺上進行接種。讓母種先在搖瓶或小罐內(nèi)進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到大罐中發(fā)酵，大型發(fā)酵罐的菌種要經(jīng)過兩次擴大培養(yǎng)才能接入發(fā)酵罐[4]。

搖瓶培養(yǎng)是指在250mL三角瓶中裝入50mL液體培養(yǎng)基，121℃、0.15MPa滅菌0.5h后經(jīng)冷卻接入菌種，置于26℃的恒溫搖床上培養(yǎng)至發(fā)酵罐準備工作完畢即可。同時將種子罐、發(fā)酵罐在121℃、0.1MPa條件下進行空罐、實罐滅菌[5]1h;冷卻至26℃，用微孔壓差法或打開接種閥在火焰的保護下將搖瓶的菌種接入種子罐。

對搖瓶菌種和種子罐營養(yǎng)液接種前、后進行取樣鏡檢，以確保上罐的菌種和培養(yǎng)基百分百無感染，并排除因種子罐接種環(huán)節(jié)的感染等因素，否則后面的生產(chǎn)將無法繼續(xù)，所以在制備搖瓶菌種時應多制備幾組以備用。

1.2培養(yǎng)基研究

搖瓶培養(yǎng)基、種子罐培養(yǎng)基、發(fā)酵罐培養(yǎng)基均以培養(yǎng)真菌用的液體培養(yǎng)基PDA為基礎(chǔ)，加以部分元素的改進。搖瓶培養(yǎng)基：土豆，葡萄糖，蛋白胨，KH2PO4，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO47·H2O，水;種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)基：黃豆水，白砂糖，KH2PO4。

1.3發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)

接種后進行種子罐-發(fā)酵罐兩級連續(xù)發(fā)酵[1]培養(yǎng)：第一罐即種子罐，在給予罐體積的70%的培養(yǎng)液中接種量為5%，發(fā)酵溫度26±1℃，pH6.0，無菌空氣流量為常壓下8m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速為120～140r/min，第二罐發(fā)酵罐，同樣給予罐體積70%的新的培養(yǎng)液，以種子罐發(fā)酵后液體為菌液，發(fā)酵溫度26±1℃，pH5.8，無菌空氣流量為常壓下80m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速220～240r/min。根據(jù)上種子罐后不久、種子罐移種至發(fā)酵罐前，幾個重要時期及在菌種上種子罐后14，24，34，44h，種子罐移種發(fā)酵罐18，22，26h取樣顯微鏡觀察白僵菌形態(tài)和染色鏡檢、pH值檢測，判定感染與否以確保種子質(zhì)量和決策生產(chǎn)流程。

1.4數(shù)據(jù)處理

各形態(tài)孢子和代謝產(chǎn)物草酸鈣結(jié)晶以直接計數(shù)法計數(shù)總數(shù)量，部分數(shù)據(jù)采用Excel2003進行統(tǒng)計記錄。

2結(jié)果分析

2.1發(fā)酵罐培養(yǎng)基

碳、氮、磷是白僵菌生長不可缺少的營養(yǎng)元素，而在白僵菌生長的不同階段培養(yǎng)基成分又各有不同：產(chǎn)菌絲體時需要的營養(yǎng)豐富一些，氮較產(chǎn)孢期需要的多，而產(chǎn)孢期則需要的碳多，種子罐中碳源氮源比例為2∶3，發(fā)酵罐碳源氮源比例為1∶1;培養(yǎng)初期在營養(yǎng)液中加入少量的微量元素，比如錳和鐵[2]，有助于白僵菌孢子生長速率和數(shù)量的增加。

見以上表1：通過多次實驗，在給予相同菌種接種量、氮源、磷鹽，不同碳源的培養(yǎng)條件下，26℃水浴恒溫搖床培養(yǎng)，得出以下結(jié)論：白僵菌在對碳的利用中，對雙糖中的蔗糖利用效果要優(yōu)于單糖中的葡萄糖。由分生孢子發(fā)芽成芽管進而生長成菌絲的過程中，利用蔗糖作為碳源的白僵菌要比用葡萄糖作為碳源的白僵菌生長進度快、長勢好，節(jié)約培養(yǎng)時間。因此在大量生產(chǎn)條件下，粗制白砂糖可作為白僵菌碳源的首選。

氮源：玉米漿或黃豆水為白僵菌發(fā)酵的主要氮源。因為是工業(yè)化生產(chǎn)，考慮到成本問題，玉米和黃豆作為菌種培養(yǎng)的氮源比較有優(yōu)勢。但玉米漿制成的培養(yǎng)基液體比較渾濁，制片不利于鏡檢，所以主要還是選用黃豆熬水作為氮源。

磷鹽：為了維持培養(yǎng)基pH的相對穩(wěn)定，讓微生物生長速度朝著我們工業(yè)化生產(chǎn)有利的方向進行，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑。由于白僵菌在偏弱酸的環(huán)境中生長速度快，因此我們選用水溶液呈酸性的KH2PO4作為磷鹽的主要來源。

2.2培養(yǎng)時間和白僵菌形態(tài)

要想縮短周期、擴大生產(chǎn)、獲得生理狀態(tài)良好的孢子，掌握白僵菌發(fā)酵罐培養(yǎng)的各時段形態(tài)具有重要意義。

白僵菌菌種自接入液體培養(yǎng)基后，生活史的一個循環(huán)周期：分生孢子——發(fā)芽成芽孢子——萌發(fā)成芽管，芽管分枝上斷截產(chǎn)生節(jié)孢子——萌發(fā)成菌絲——繼續(xù)生長并產(chǎn)生草酸鈣結(jié)晶，部分老化斷裂增殖產(chǎn)生更多節(jié)孢子——老化的菌絲減少至無，節(jié)孢子萌發(fā)成新菌絲。

白僵菌發(fā)酵罐培養(yǎng)生長曲線圖中，可以看出：在44h的節(jié)點，給予菌種轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐的方式補充營養(yǎng)，可以使白僵菌繼續(xù)擴大繁殖，生長曲線也直接由穩(wěn)定期跨過衰亡期進入下一個生長循環(huán)期，大大減短了培養(yǎng)時間，擴大了菌種繁殖;在66h后，發(fā)酵罐中菌種受代謝產(chǎn)物、營養(yǎng)物質(zhì)匱乏等限制，菌種增量不明顯甚至下滑趨勢，延長培養(yǎng)時間已沒有太大意義，因此可停止發(fā)酵罐培養(yǎng)。

2.3酸堿度-時間曲線

每次投罐發(fā)酵培養(yǎng)中，初始給予菌種相同pH值的營養(yǎng)環(huán)境。從表4可以看出：白僵菌生長的適應環(huán)境為pH值4～6;總體以白僵菌發(fā)酵培養(yǎng)44h為界點，0～44hpH值由6減至4，為產(chǎn)生第一代新菌絲階段，63h后pH值呈現(xiàn)由4增值的趨勢，是菌絲逐漸老化代謝產(chǎn)生結(jié)晶和節(jié)孢子演變生成第二代菌絲，以節(jié)孢子為主的過程，此后就是菌絲與節(jié)孢子之間的循環(huán)演變，白僵菌的擴大繁殖。在此，人為的將白僵菌液體發(fā)酵培養(yǎng)時間分配成種子罐42～45h，發(fā)酵罐21～26h。

3結(jié)論與討論

在生物學界和農(nóng)林業(yè)系統(tǒng)經(jīng)過專家們長時間努力，在白僵菌育種方面已取得巨大成就，但同許多其它現(xiàn)代生物技術(shù)類似，白僵菌擴大培養(yǎng)獲得的成果在全國大部分地區(qū)未能產(chǎn)業(yè)化，瓶頸是發(fā)酵罐中穩(wěn)定的控制和順利的后處理不能通過的問題。因此白僵菌工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)仍是良莠不齊，從實驗室菌種選育到車間發(fā)酵罐大量生產(chǎn)，如何掌握好液體發(fā)酵罐培養(yǎng)中白僵菌多型孢子和菌絲各生長形態(tài)所適應的環(huán)境和所需要的營養(yǎng)元素，保障白僵菌菌種發(fā)酵按預定的最佳動力學過程進行，才是做到從量變到質(zhì)變的生產(chǎn)工藝之關(guān)鍵。

筆者通過以宜昌夷陵區(qū)白僵菌菌種為材料，對白僵菌液體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基、菌種生長形態(tài)、生長環(huán)境的pH值進行試驗研究，在當陽白僵菌廠成功投入工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，確定了轉(zhuǎn)罐時間等液體發(fā)酵罐發(fā)酵技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明：在液體培養(yǎng)基中，碳氮元素比例為種子罐2∶3，發(fā)酵罐1∶1;種子罐初始pH值為6，進入發(fā)酵罐生產(chǎn)，pH值在白僵菌自我調(diào)節(jié)與外界調(diào)節(jié)共同作用下維持4～5，孢子增長速率最大;積極掌握白僵菌液體發(fā)酵中節(jié)孢子與菌絲生長時間，從而合理分配種子罐-發(fā)酵罐兩級連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)時間，前42～45h在種子罐中培養(yǎng)，后21～26h在發(fā)酵罐中補充新料繼續(xù)培養(yǎng)。以最大程度節(jié)約生產(chǎn)成本，進行成功生產(chǎn)。另外對比固體發(fā)酵法生產(chǎn)和液固兩相發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)，雖然后者因為空壓機、發(fā)酵罐運行耗電較前者多，但綜合考慮，無論是從生產(chǎn)成本還是產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)量上考量都要較前者優(yōu)秀，因此液固發(fā)酵法生產(chǎn)擁有廣闊前景。

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（責任編輯：鄭京津）