黃 嬌，姜登軍

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶 404120；2.重慶萬州食品藥品檢驗所，重慶 404100)

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海拔高度對重慶產(chǎn)桔梗皂苷含量的影響

黃 嬌1，姜登軍2

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶 404120；2.重慶萬州食品藥品檢驗所，重慶 404100)

目的：探討海拔高度對重慶產(chǎn)桔梗中皂苷含量的影響。方法：采用UV定量測定桔梗中總皂苷和桔梗皂苷D、D2、去芹菜糖桔梗皂苷D的含量，采用手持 GPS 進行測定海拔高度。運用SPSS19.0軟件對海拔高度與4個有效成分含量進行相關(guān)性分析。結(jié)果：重慶產(chǎn)桔梗中皂苷的含量隨著海拔的升高而增加，采樣區(qū)域海拔高度與對應(yīng)桔梗中皂苷D、D2、去芹菜糖桔梗皂苷D、總皂苷含量的相關(guān)系數(shù)分別為r1=0.988(P1=0.012)，r2=0.987(P2=0.011)，r3=0.996(P3=0.004)，r4=0.960(P4=0.04)，表明海拔高度與桔梗皂苷的含量有相關(guān)性。結(jié)論：桔梗皂苷的含量與其生長海拔高度有關(guān)，為重慶產(chǎn)桔梗的科學種植提供理論依據(jù)。

桔梗；海拔高度；皂苷含量；UV；HPLC-ELSD

桔梗(Radix platycodi)為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.的干燥根，在我國藥用歷史悠久[1]。桔?？伤幨硟捎?，主要用于治療咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛、音啞、肺癰吐痰、瘡瘍膿成不潰等證[2]。近年來海內(nèi)外學者對桔梗中多種成分，特別是三萜皂苷類成分的藥理活性進行了較多研究[3-5]。桔梗的主要化學成分為齊墩果酸型五環(huán)三萜皂苷、桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D[6]等，其中桔梗皂苷 D為桔梗皂苷的主要成分[7]，藥典用其作為定量測定的主要指標。目前文獻多研究不同產(chǎn)地桔梗皂苷的含量測定，但還未見關(guān)于海拔高度對桔梗皂苷含量的影響研究[8-10]。重慶地處西南，地形異常復雜，從丘陵、平原到高山，海拔高差大，生態(tài)環(huán)境呈現(xiàn)多樣性，立體氣候明顯。三峽庫區(qū)的桔梗種植產(chǎn)區(qū)海拔高度相差懸殊，桔梗藥材質(zhì)量也存在著一定差異。為更科學合理有效地利用該藥材，本試驗以桔梗為試驗材料，以總皂苷和3種桔梗皂苷的含量為評價指標，測定重慶不同海拔桔梗中皂苷的含量，探討海拔對桔梗藥材質(zhì)量的影響，為其質(zhì)量評價及科學栽培提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計(島津UV-2401) ；98-1-B電子調(diào)溫電熱套( 天津市泰斯特儀器有限公司) ；MH-2000 調(diào)溫型電熱套( 北京科偉永興儀器有限公司) ；ME215S十萬分之一電子天平( 梅特勒-托利多儀器( 上海)有限公司) ；CP224S萬分之一電子天平 ( 梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；集思寶G130坐標定位儀GPS( 北京合眾思壯科技股份有限公司) ；島津LC-20A高效液相色譜儀，ELSD-LTII檢測器，島津工作站；SD3200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司) ；LK-COOA搖擺式高速中藥粉碎機。

1.2 試劑

桔梗皂苷D標準品(批號：111851-201204)，購自中國食品藥品檢定研究院；去芹菜糖桔梗皂苷D標準品(批號：Must-14050901)，購自成都曼思特生物科技公司；桔梗皂苷D2標準品(批號：YL2013112507)，購自上海一林生物科技公司；乙腈為色譜純，甲醇、乙醇、正丁醇、甲酸、冰醋酸、高氯酸、香草醛為分析純(川東化工集團有限公司化學試劑廠)；超純水 (自制)。

本實驗桔梗樣品于2013年10月采自萬州老土村，分別于不同海拔高度(500～1 150m)的陽坡和陰坡采樣，共20批。采集藥材后清洗去除泥沙，刮去根皮后干燥，即得桔梗樣品，并經(jīng)重慶萬州食品藥品檢驗所孟家安教授鑒定為桔梗科桔梗屬植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A. DC. 的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 桔梗總皂苷含量測定方法[11]

精密稱定桔梗皂苷D 5.65mg，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為0.565mg·mL-1的標準品溶液。精密吸取100～1 000μL標準品溶液，分別置于10mL具塞磨口試管中，于70℃水浴蒸發(fā)至干，精密加入5%香草醛-冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL，搖勻，于60℃水浴中加熱15min，冰水浴中冷卻3min，加冰醋酸5mL，隨行試劑作空白。于島津UV-2401紫外-可見分光光度計473nm波長處測定吸收度并建立標準回歸方程：Y=1.789X+0.012，R=0.999。

精密稱取已干燥桔梗藥材粉末1.0g，準確加入8倍量70%乙醇，回流提取3次，每次1.5h，合并濾液，水浴蒸發(fā)至干。浸膏加水5mL溶解，所得溶液緩緩通過已處理好的D-101樹脂柱(徑高比 1∶5)，以100mL水洗脫，棄去水液，再以60mL 70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸干，用20mL水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3 次，每次20mL。合并正丁醇液，減壓蒸干，殘留物加甲醇溶解定容于10mL 容量瓶中，搖勻，備用。吸取200μL，于島津UV-2401紫外-可見分光光度計473nm波長處測定吸收度，計算總皂苷含量。

2.2 3種桔梗皂苷含量測定

2.2.1 色譜條件 桔梗皂苷D測定條件：色譜柱：Kinetex C18色譜柱(4.6mm×100mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，流速：0.4mL·min-1；進樣量：20μL。梯度洗脫程序如下：0.01～10min，20%A；10～54min，33%A；54～66min，4%A。桔梗皂苷D2測定條件：色譜柱：Kinetex C18色譜柱(4.6mm×100mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，流速：0.8mL·min-1；進樣量：20μL。梯度洗脫程序如下：0.01～10min，25%A；10～54min，39%A；54～66min，4%A。去芹菜糖桔梗皂苷D測定條件：色譜柱：KinetexC18色譜柱(4.6mm×100mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.01%磷酸溶液(B)，流速：1.0mL·min-1；進樣量：20μL。梯度洗脫程序如下：0.01～1min，23%A；10～50min，15%A；54～66min，4%A。

2.2.2 標準品溶液制備 精密稱定桔梗皂苷D標準品5.65mg、去芹菜糖桔梗皂苷D 5.01mg、桔梗皂苷D23.51mg，分別置于10mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過即得，進樣20μL。3種桔梗皂苷的對照品和樣品色譜見圖1。

2.2.3 供試品溶液制備[12]精密稱定各桔梗藥材粉末(過二號篩)2g，置于錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，在500W功率下超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足重量，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取標準品溶液1、5、10、15、20、25μL注入液相色譜儀。按照“2.2.1”項下色譜條件，測得桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2峰面積積分值，以標準品溶液進樣量的自然對數(shù)為橫坐標(X)，峰面積積分值的自然對數(shù)為縱坐標(Y)進行線性回歸，得到桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2的線性回歸方程分別為：Y=0.985x+11.886，r2=0.999 2；Y=0.999x+12.121，r2=0.999 8；Y=0.992x+11.88，r2=0.999 9；表明桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2分別在0.563～14.075μg、0.452～11.208μg、0.344～8.600μg進樣量范圍內(nèi)與峰面積積分呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 取供試品溶液重復進樣5次，每次20μL，計算桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2的峰面積RSD分別為1.26%、1.87%、1.56%，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24h后進樣20μL，桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2的峰面積RSD分別為0.93%、2.07%和0.87%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批藥材，按照“2.2.3”項下制備6份供試品溶液，依照相同色譜條件測定桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2的含量平均值分別為0.58%、0.30%和0.34%，RSD分別為2.83%、2.01%和2.01%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱定2g桔梗藥材粉末5份(桔梗皂苷D、去芹菜桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2含量分別為0.58%、0.30%和0.35%)，分別精確加入桔梗皂苷D標準品1mL(含桔梗皂苷D 0.563mg)、去芹菜桔梗皂苷D標準品1mL(含去芹菜桔梗皂苷D 0.452mg)和桔梗皂苷D2，標準品1mL(含桔梗皂苷D20.344mg)，按供試品制備方法處理，計算回收率。桔梗皂苷D、D2、去芹菜桔梗皂苷D樣品的平均回收率分別為99.58%、99.92和101.3%，RSD分別為1.09%、1.62%和1.32%，表明該法的回收率符合要求。

2.2.9 樣品測定 分別稱取不同海拔高度的桔梗藥材，按照“2.2.3”項下方法制備樣品溶液，精密吸取供試品溶液20μL，注入色譜儀，測定結(jié)果見表1。

圖1 3種皂苷標準品HPLC色譜

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及相關(guān)性分析

運用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0，對采樣區(qū)域海拔高度與對應(yīng)藥材所測總皂苷和3種皂苷D的含量進行相關(guān)性分析。采樣區(qū)域海拔高度與對應(yīng)藥材桔梗皂苷D含量相關(guān)系數(shù)為r1=0.988，P1= 0.012(雙側(cè))<0.05，說明兩者之間有顯著性差異；海拔高度與對應(yīng)藥材桔梗皂苷D2含量相關(guān)系數(shù)為r2=0.987，P2=0.011(雙側(cè))<0.05，說明兩者之間有顯著性差異；海拔高度與對應(yīng)藥材去芹菜糖桔梗皂苷D含量相關(guān)系數(shù)為r3=0.996，P3=0.004(雙側(cè))<0.01，說明兩者之間有顯著性差異；海拔高度與對應(yīng)藥材總皂苷含量相關(guān)系數(shù)為r4=0.960，P4=0.04(雙側(cè))<0.05，說明兩者之間有顯著性差異。結(jié)果表明，海拔對桔梗皂苷的含量有直接影響。

3 討論

三萜皂苷是桔梗的主要活性與特征性成分[3]。植物生存環(huán)境中的生態(tài)因子可分為生物因子和非生物因子，海拔高度屬于地形因子，是非生物因子的一種[13]。為更好地指導重慶桔梗藥材的科學栽培，本實驗采用同一采收期、不同海拔高度的桔梗作為實驗材料，探討海拔高度對桔梗中皂苷類成分含量的影響。實驗結(jié)果表明，重慶萬州桔?？傇碥蘸徒酃Ｔ碥誅、D2、去芹菜糖桔梗皂苷D的含量從500～1 100m呈現(xiàn)上升趨勢，與采樣區(qū)域海拔高度呈正相關(guān)性。

表1 桔梗皂苷含量測定 (%)

三萜皂苷類化合物是植物體內(nèi)重要的次生代謝物，其含量和組成隨著植物遺傳背景、組織類型、生長年齡、生理狀況以及環(huán)境因子的變化而發(fā)生顯著變化，最終取決于三萜皂苷合成途徑中的一些關(guān)鍵酶及其在細胞中的表達水平。鯊烯是三萜皂苷類的前體物質(zhì)，皂苷類化合物合成的關(guān)鍵酶包括β-香樹脂合酶(β-AS)、 P450 和 GT 酶，均為光誘導酶，即在光的存在下，酶活性迅速升高。GT 酶的活性還與溫度有關(guān)，溫度過低可影響合成酶活性，進而影響皂苷的生物合成。光強度較大時三萜皂苷的合成較為旺盛，植物體內(nèi)的光反應(yīng)與電子傳遞需要光能激發(fā)，光反應(yīng)產(chǎn)物是參與初生代謝和次生代謝的必需物質(zhì)[13-14,18-19]。桔梗是喜光植物，不同海拔高度的日照、溫度均有所差異，從而影響桔梗皂苷的生物合成及代謝。本研究結(jié)果符合相關(guān)文獻研究結(jié)果[15-17]。

重慶產(chǎn)桔梗皂苷成分的含量分布趨勢可能與其所處的特殊地理環(huán)境有關(guān)，三峽庫區(qū)溝壑縱橫，晝夜溫差大，同一緯度不同高度的氣溫及日照變化明顯，從而影響桔梗皂苷的生物合成。當然，影響桔梗生長發(fā)育以及體內(nèi)皂苷類成分積累的因素比較復雜，可能是多種生態(tài)因子，如雨量、土壤肥力、溫度等協(xié)同作用的結(jié)果。在海拔1 100m 以上是否也存在海拔高度與桔梗皂苷含量的正相關(guān)性，仍需采集更多的樣本進行研究，后續(xù)將對影響桔梗次生代謝產(chǎn)物積累的關(guān)鍵生態(tài)環(huán)境因子進行深入研究。

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(責任編輯：尹晨茹)

The Effect of Altitude on Saponin Content of Platycodon grandiflorum in Chongqing

Huang Jiao1,Jiang Dengjun2

(1.ChongQing Three Gorges Medical College,Chongqing 404120,China; 2.ChongQing wanzhou institute for Food and Drug Control,Chongqing 404100,China)

Objective:To investigate the effect of altitude of Platycodon grandiflorum saponin content in Chongqing.Methods:The contents of total saponins and Platycodin D、Platycodin D2、Deapio-platycodin D were determined by UV and HPLC-ELSD,altitude using portable GPS determination. Correlation analysis of altitude and 4 effective ingredient content by SPSS 19.0.Results:The contents of platycodin increased with the increased of altitude in Chongqing,the sampling area altitude and the content of Platycodin D、Platycodin D2、Deapio-platycodin D and total saponins correlations werer1=0.988(P1=0.012)，r2=0.987(P2=0.011)，r3=0.996(P3=0.004)，r4=0.960(P4=0.04),the results show that the contents of platycodin was related to the altitude. Conclusion:The contents of platycodin was related to altitude,can be as the theoretical basis of Platycodon grandiflorum provides scientific planting produced in Chongqing.

Radix platycodi;Altitude;Saponin Content;UV;HPLC-ELSD

2015-04-08

重慶市教委科學技術(shù)研究項目(K131801)；重慶市科技攻關(guān)項目(CSTC,2011AC5062)

黃嬌(1982-)，女，重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校講師，研究方向為中藥質(zhì)量評價。

R284.1

A

1673-2197(2015)16-0030-04

10.11954/ytctyy.201516014