汪 晶，吳曉燕

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028；2.南京市鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210046)

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復(fù)方益氣止咳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

汪 晶1，吳曉燕2*

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028；2.南京市鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210046)

目的：建立復(fù)方益氣止咳顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用雙波長高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷的含量；采用薄層色譜法(TLC)對(duì)方中黃芪、陳皮、白術(shù)成分進(jìn)行定性鑒別。結(jié)果：薄層鑒別的色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾；毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷分別在5.5～220μg·mL-1、10.7～428μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為94.5%、102.34%。結(jié)論：該方法具有簡便、準(zhǔn)確及專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于復(fù)方益氣止咳顆粒的質(zhì)量控制。

橙皮苷；黃芪甲苷；白術(shù)；薄層色譜；高效液相色譜；質(zhì)量控制

復(fù)方益氣止咳顆粒是由黃芪、陳皮、白術(shù)、雞內(nèi)金等中藥飲片加工制備的顆粒劑，處方源于醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有健脾補(bǔ)肺、化痰止咳、益氣固表的作用，療效顯著，主治脾肺氣虛之證，如臨床咳嗽痰多、氣喘、食少納呆、腹脹便溏等多見癥狀。本研究采用薄層色譜法對(duì)方中黃芪、陳皮、白術(shù)成分進(jìn)行了定性鑒別，同時(shí)采用高效液相色譜法對(duì)制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，為進(jìn)一步提升該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀；Sartorius BP211D電子分析天平；硅膠G薄層板(青島海洋化工10cm×10cm；10cm×20cm)；超聲儀AS3120A(天津奧特賽恩斯)；水浴鍋(鄭州科創(chuàng)儀器有限公司)；暗箱紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 材料

黃芪甲苷(批號(hào)110781-200813)，橙皮苷(批號(hào)110721-201011)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)：111920-201004)，白術(shù)對(duì)照藥材(批號(hào)120925-201003)，均購于中國食品藥品檢定研究院；復(fù)方益氣止咳顆粒(三批,批號(hào)140511；140518；140525，院內(nèi)自制)；乙腈(美國天地)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC薄層鑒別

2.1.1 黃芪 取本品顆粒6g，平行三份操作，加甲醇50mL，超聲提取30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL，加熱使溶解，待冷卻后加入水飽和正丁醇振搖提取3次，每次30mL，合并正丁醇液，正丁醇液加濃氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去洗滌液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。按供試品溶液制備方法制備無黃芪藥材的陰性對(duì)照溶液；精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品，加入甲醇制成1mg·mL-1的對(duì)照品溶液。按薄層色譜法《中國藥典》(2010版)一部附錄(附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、陰性對(duì)照溶液及黃芪甲苷對(duì)照品各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以10℃以下放置的三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)下層溶液為展開劑，展開，展距12cm，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，于105℃加熱3～5min至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示：在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無斑點(diǎn)[1-2]。薄層色譜見圖1。

1.對(duì)照品(對(duì)照藥材)；2.樣品140511；3.樣品140518；

2.1.2 陳皮 取本品顆粒6g，平行三份操作，加甲醇50mL，超聲提取30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?0mL使溶解，作為供試品溶液；按供試品溶液制備方法制備無陳皮藥材的陰性對(duì)照溶液；精密稱取橙皮苷對(duì)照品，加入甲醇制備0.5mg·mL-1的對(duì)照品溶液；按照薄層色譜法《中國藥典》(2010版)一部附錄(附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、陰性對(duì)照溶液及橙皮苷對(duì)照品各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)為展開劑，展開4cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)上層溶液為展開劑，展至約10cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果顯示：在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無斑點(diǎn)[3]。薄層色譜見圖1。

2.1.3 白術(shù) 取本品顆粒6g，平行三份操作，加甲醇50mL，回流提取30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，水溶液加入正己烷萃取2次，每次20mL，合并正己烷萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備白術(shù)對(duì)照藥材溶液及缺白術(shù)藥材陰性對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法《中國藥典》(2010版)一部附錄(附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述對(duì)照藥材溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(10∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃下加熱，置紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果顯示：在供試品色譜中，與白術(shù)對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性樣品無斑點(diǎn)[4-5]。薄層色譜見圖1。

2.2 HPLC含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 采用Waters C18(250mm×4.6mm, 5μm)色譜柱；以乙腈(A)-0.4%乙酸水(B)為流動(dòng)相，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1mL·min-1，檢測(cè)波長為260nm、280nm，柱溫30℃。在該色譜條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留時(shí)間為21.2min，橙皮苷的保留時(shí)間為33.16min，分離度均大于1.5，樣品中其他成分對(duì)其測(cè)定無干擾。色譜見圖2。

表1 梯度洗脫

A.對(duì)照品色譜圖；B.樣品色譜圖；1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；2.橙皮苷

圖2 HPLC液相色譜

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖及橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制備毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度為220μg·mL-1、橙皮苷濃度為428μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品顆粒，研細(xì)，稱量2g顆粒，精密稱定，至25mL中具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇，超聲提取60min，放冷至室溫，精密稱定，補(bǔ)足揮發(fā)的甲醇量，過濾，取續(xù)濾液，微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、5.0mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成不同濃度對(duì)照品溶液，分別精密吸取不同濃度對(duì)照品及混合對(duì)照品母液10μL，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷對(duì)照品溶液10μL，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定其峰面積，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷峰面積的RSD(n=6)分別為0.93%、0.87%。結(jié)果表明精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)供試品溶液方法平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品供試品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均質(zhì)量濃度為12.4μg·mL-1，RSD為1.27%；橙皮苷的平均質(zhì)量濃度為153μg·mL-1，RSD為1.35%。 結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，其中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD(n=6)為2.10%；橙皮苷峰面積的RSD(n=6)為1.96%。結(jié)果表明：供試品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷在室溫條件下24h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取1g顆粒，精密稱定，加入至10mL容量瓶中，分別精密加入含有等量對(duì)照品成分的溶液，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行6份，分別精密吸取上述供試品溶液各10μL，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果顯示：毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為94.5%，RSD為3.23%；橙皮苷的平均回收率為102.34%，RSD為2.17%。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取3批顆粒樣品，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，每批次平行3份。計(jì)算每批次樣品中指標(biāo)性成分的質(zhì)量濃度。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

通過對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷[6]及橙皮苷進(jìn)行紫外掃描圖譜分析，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的最大吸收波長為260nm，橙皮苷的最大吸收波長為283nm；采用單波長直接測(cè)定兩種成分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在260nm條件下，橙皮苷峰形較差；在283nm條件下，樣品中其他成分影響毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測(cè)定，故采用雙波長檢測(cè)方法同時(shí)測(cè)定兩種成分含量[7]。

黃芪為方中君藥，傳統(tǒng)質(zhì)控指標(biāo)為皂苷類成分，對(duì)其黃酮類物質(zhì)質(zhì)量控制研究較少，本研究采用HPLC同時(shí)測(cè)定黃芪中黃酮類成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷及陳皮中橙皮苷的含量；同時(shí)采用薄層色譜法建立了復(fù)方益氣止咳顆粒中黃芪、陳皮、白術(shù)三種飲片的鑒別方法，結(jié)果準(zhǔn)確、方便，重現(xiàn)性好，為全面建立復(fù)方益氣止咳顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:283.

[2] 張玉東，徐士云. 益氣養(yǎng)血口服液中黃芪的薄層色譜鑒別法探討[J].中成藥，2007，29(10):1560-1561.

[3] 戴敬,楊曉婧,郝培培,等.女金丸薄層色譜鑒別方法研究[J].中成藥,2010,32(11):2021-2025.

[4] 李偉,文紅梅,崔小兵,等.白術(shù)的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2007，38(10):1460-1462.

[5] 壽旦,俞忠明,章建民.改良的白術(shù)藥材薄層色譜鑒別研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011,29(3):535-537.

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(責(zé)任編輯：李嵐春)

Study on Quality Standard of Fufang Yiqi Zhike Granule

Wang Jing1,Wu Xiaoyan2*

(1.Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine, Nanjing 210000,China; 2.Nanjing Drum Tower Hospital,Nanjing 210000,China)

Objective:To establish a quality standard for Yiqi Zhike Granule.Methods:Radix Astragali, Citri Reticulatae Pericarpium and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma were identified by thin layer chromatography(TLC). Calycosin 7-O-β-D-Glucopyranoside and Hesperidin were determined by high performance liquid chromatography(HPLC). Results:TLC chromatographic spots were clear, without the interference of negative control.Calycosin 7-O-β-D-Glucopyranoside and Hesperidin were separated well and the linearity range of them were 5.5～220μg·mL-1, 10.7～428μg·mL-1, the average recovery were 94.5%, 102.34% respectively.Conclusion:the method was simple, accurate and with good specificity, which can be used for the quality control of the Yiqi Zhike Granule.

Hesperidin; Astragaloside; Atractylodis;TLC; HPLC;Quality Control

2015-09-17

國家自然科學(xué)基金(81403121)

汪晶(1986-)，男，江蘇省中醫(yī)藥研究院實(shí)習(xí)研究員，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail：wangjing3968@gmail.com

吳曉燕(1983-)，女，南京市鼓樓醫(yī)院藥師，研究方向?yàn)樗巹W(xué)。E-mail：wxypharmacy@126.com

R284

A

1673-2197(2015)22-0017-03

10.11954/ytctyy.201522007