趙 雪 孔維軍 麻馨月 常桂英 董長穎 楊世海

(1 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林,132101; 2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所,北京,100193; 3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),長春,130118)

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黃花敗醬發(fā)狀根培養(yǎng)體系的建立及其抑菌作用研究

趙 雪1,2,3孔維軍1麻馨月1常桂英1董長穎1楊世海2

(1 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林,132101; 2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所,北京,100193; 3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),長春,130118)

目的:初步建立黃花敗醬發(fā)狀根培養(yǎng)體系,并考察其抑菌效果。方法:采用發(fā)根農(nóng)桿菌1601、15834、A4、1000等4種G-土壤桿菌誘導(dǎo)黃花敗醬外植體產(chǎn)生發(fā)狀根,考察不同外植體、菌株、侵染時間、預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間對黃花敗醬毛狀根誘導(dǎo)率的影響,并對發(fā)狀根進(jìn)行PCR檢測;同時采用紙片擴(kuò)散法測定其抑菌效果。結(jié)果:黃花敗醬莖段作為外植體,預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)48 h,發(fā)根農(nóng)桿菌A4侵染8 min,MS液體培養(yǎng)基pH為6時添加蔗糖濃度為40 g/L時轉(zhuǎn)化率和增殖量最高,提取毛狀根中總黃酮的含量為9.12%。應(yīng)用PCR證實(shí)A4質(zhì)粒上的rolB基因片段成功轉(zhuǎn)入被感染的黃花敗醬發(fā)狀根中。結(jié)論:建立了黃花敗醬毛狀根培養(yǎng)體系,其發(fā)狀根提取液對金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用。

黃花敗醬;發(fā)根農(nóng)桿菌;發(fā)狀根;抑菌作用

黃花敗醬(PatriniascabioscaefoliaFisch)別名黃花龍芽、野共花、鶴立雞群,為敗醬科(Valerianaceae)敗醬屬(Patrinia)植物,根或全草入藥,是我國傳統(tǒng)常用中藥之一,主產(chǎn)于黑龍江、河北、湖南等省[1-2]。黃花敗醬草的全面研究始于20世紀(jì)60、70年代,其草內(nèi)含有皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類等多種藥用成分,其中以三萜皂苷和黃酮類為主要活性成分[3],具有清熱解毒、利濕排膿,祛瘀止痛的功效[4]。臨床研究表明在治療流行性鼻腔炎、腮腺炎、慢性盆腔炎及闌尾膿腫癥狀等方面有很好的療效[5]。除此之外,該草藥還有解毒排膿、治療子宮炎及產(chǎn)后脫宮蓄膿的功效。黃花敗醬種子中的Sulfapatrinosides有效成分可用于控制艾滋病(HIV),黃花敗醬提取液在延長戊巴比妥鈉對小鼠的睡眠時間上也有很明顯的作用[6]。隨著研究的不斷深入,黃花敗醬草的藥用價值逐漸提高,臨床應(yīng)用和市場需求逐漸加大。利用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)侵染植物誘導(dǎo)毛狀根培養(yǎng)技術(shù)是繼離體培養(yǎng)技術(shù)之后的新型懸浮培養(yǎng)技術(shù),可用于建立產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)系統(tǒng),具有遺傳穩(wěn)定性、生長迅速、合成次生代謝物能力強(qiáng)、易于操作控制等優(yōu)點(diǎn),較傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有更廣闊的應(yīng)用前景[7-9]。本研究利用4種發(fā)根農(nóng)桿菌1601、15834、A4、1000誘導(dǎo)黃花敗醬組織產(chǎn)生毛狀根,初步建立黃花敗醬草發(fā)狀根離體擴(kuò)增生長的培養(yǎng)體系,為下一步擴(kuò)大培養(yǎng)黃花敗醬發(fā)狀根的研究提供可行性數(shù)據(jù)支撐,同時也為黃花敗醬發(fā)狀根培養(yǎng)體系的抑菌作用研究提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 無菌苗培養(yǎng) 黃花敗醬(PatriniascabioscaefoliaFisch)種子由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥植園提供，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院楊世海教授鑒定。利用當(dāng)年成熟干燥的黃花敗醬種子,加溫水浸泡12 h,在超凈操作臺內(nèi)用無菌水清洗4次,75%乙醇浸泡30～40 s,無菌水清洗3次;后用4%次氯酸浸泡8～9 min,無菌水清洗5～6次。處理完后用滅菌濾紙將種子表面的水分吸干,用鑷子輕輕放置在MS固體培養(yǎng)基(100 mL錐形瓶)中,置于光照強(qiáng)度2 000 lx(光照12 h/d黑暗12 h/d交替培養(yǎng))、設(shè)置溫度24～25 ℃進(jìn)行培養(yǎng),等待萌發(fā)無菌幼苗即為侵染用的外植體。

1.2 發(fā)根農(nóng)桿菌的活化 發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacteriumrhizogenes1601、15834、1000和A4菌株由中國農(nóng)業(yè)微生物研究所菌種保藏中心提供,并于-70 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時,在超凈操作臺內(nèi)分別挑出A4、15834、1601和1000菌株,接種于固體YEB平皿上劃線,封口膜密封后置于28 ℃恒溫暗培養(yǎng),1～2 d待長出單克隆菌斑后挑取單菌落,接種于加有30 mL卡那霉素(Kan+50 mg/mL)液體的YEB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后觀察YEB由透明的紅棕色漸漸變淡且呈現(xiàn)出云霧狀渾濁即可。取1 mL復(fù)蘇成功的菌液加入裝有50 mL YEB液體培養(yǎng)基中,于相同的條件下再次培養(yǎng)12 h,取對數(shù)生長期時的菌液對黃花敗醬外植體進(jìn)行侵染。

1.3 黃花敗醬發(fā)狀根的誘導(dǎo) 在超凈操作臺內(nèi),將黃花敗醬無菌苗的葉片剪成0.3 cm×0.3 cm片段,莖段長度約0.3 cm左右。葉片和莖段分別置于MS固體平皿上,不添加外源激素置于24 ℃、黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)48 h。在超凈操作臺中,將預(yù)培養(yǎng)的外植體(莖段、葉片)轉(zhuǎn)移至錐形瓶中,加入活化后的菌液進(jìn)行侵染,輕搖錐形瓶,待外植體與菌液充分接觸侵染8 min后,取出外植體,用滅菌濾紙吸干表面菌液,接種到MS固體培養(yǎng)基上,24 ℃、黑暗條件下共培養(yǎng)48 h,然后轉(zhuǎn)接到含頭孢噻肟鈉(50 mg/L)的MS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)暗培養(yǎng),同時設(shè)立未被菌液感染的外植體作對照。每5 d轉(zhuǎn)板1次,直至完全除去農(nóng)桿菌。25 d后觀察,統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出的毛狀根數(shù),計(jì)算黃花敗醬發(fā)狀根誘導(dǎo)率。最后,將生長迅速、根系發(fā)達(dá)、分支較多、除菌完全的黃花敗醬發(fā)狀根轉(zhuǎn)移到MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng),建立黃花敗醬毛狀根離體培養(yǎng)體系。

發(fā)狀根誘導(dǎo)率(%)=(長出發(fā)狀根的外植體數(shù)/接種外植體的總塊數(shù))×100%

1.4 發(fā)狀根的PCR檢測 根據(jù)已誘導(dǎo)出發(fā)狀根的形態(tài)及其生長無向地性等特點(diǎn),可初步判定發(fā)狀根。為確定發(fā)根農(nóng)桿菌中T-DNA片段是否整合進(jìn)入黃花敗醬的核基因組中,對誘導(dǎo)出的毛狀根進(jìn)行PCR分子鑒定[10]。在PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中,陽性對照為菌株A4的質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物,陰性對照為未轉(zhuǎn)化植株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物,設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增rolB的PCR引物,正向引物:5'-CTCCTGACAT-CAAACTCGTC-3',反向引物:5'-TGCTTCGAGTTAT-GGGTA-3'。正向引物反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性1 min,94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35個循環(huán)后,72 ℃總延伸7 min,于4 ℃保存。

1.5 毛狀根增殖液體培養(yǎng)基的篩選 在無菌條件下取0.8 g分枝多且長、除菌完全的黃花敗醬毛狀根分別放入到MS、1/2MS、R2和B5 4種不添加激素的液體培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮震蕩培養(yǎng),26 ℃,轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng),每5 d測1次鮮重,25 d后觀察統(tǒng)計(jì)這4種培養(yǎng)基對黃花敗醬毛狀根增殖倍數(shù)的影響。

1.6 不同濃度的蔗糖對毛狀根增殖的影響 無菌條件下,取0.8 g分枝多且長、除菌完全的黃花敗醬毛狀根,分別放入含有濃度為5、10、20、30、40和50 g/L的蔗糖MS液體培養(yǎng)基中,25 d后稱取發(fā)狀根鮮重,考察培養(yǎng)基中加入的不同濃度蔗糖對發(fā)狀根增殖的影響。

1.7 不同pH值對毛狀根增殖的影響 取0.8 g分枝多且長、除菌完全的黃花敗醬毛狀根分別接種于pH為2,4,6,7,8,9的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮震蕩培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min,26 ℃恒溫培養(yǎng),25 d后觀察統(tǒng)計(jì)這4種培養(yǎng)基對黃花敗醬毛狀根增殖倍數(shù)的影響。

1.8 總黃酮的含量測定

1.8.1 黃花敗醬發(fā)狀根提取液的制備 精密稱取烘干后的黃花敗醬發(fā)狀根和自然根各3 g,磨成粉末后用濾紙包好,放入加有石油醚(60～90 ℃)的索氏提取器中回流10 h脫脂。將脫脂后的粉末放置冷卻,待石油醚揮干后加入50 mL 70%乙醇,超聲提取3次,每次30 min,過濾后合并濾液,濃縮至干后稱重,以70%乙醇定容至100 mL,即得黃花敗醬發(fā)狀根提取液,備用[11]。

1.8.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品5 mg,70%乙醇溶液精確定容置至50 mL。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0 mL,0.5 mL,1 mL,2 mL,3 mL,4 mL,分別置于10 mL的容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，然后加入10% Al (NO3)3溶液0.3 mL搖勻，靜置5 min后加入4%NaOH溶液4 mL,純凈水稀釋至刻度,搖勻靜置15 min，乙醇溶劑做為空白試劑在510 nm波長處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取一定體積樣品以同一方法測吸光度，得回歸方程計(jì)算黃酮含量。

結(jié)果如圖1所示,計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程y=0.065 6x+0.000 6,相關(guān)系數(shù)r為0.999 6。

圖1 測定黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.9 黃花敗醬發(fā)狀根提取液的抑菌作用研究

1.9.1 細(xì)菌菌株培養(yǎng)及陽性藥的制備 實(shí)驗(yàn)菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonellaenterica)和大腸桿菌(Escherichiacoli)由吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院惠贈。細(xì)菌培養(yǎng):無菌條件下,將3種供試菌株分別接種于PDA培養(yǎng)皿中,密封后,28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96 h。在超凈操作臺內(nèi)精確吸取硫酸慶大霉素注射液1.0 mL加入磷酸鹽緩沖液中,調(diào)pH 7.8，200 mL容量瓶中溶解并定容。密封冷藏保存。氯霉素(1.0 mg/mL):在超凈操作臺內(nèi),精確吸取氯霉素注射液0.8 mL置于pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液中,定容到100 mL無菌容量瓶中。密封,冷藏保存。頭孢曲松鈉(1.0 mg/mL):在超凈操作臺內(nèi),精確稱取1.0 g注射用頭孢曲松鈉干粉,以100 mL pH 6.0的磷酸鹽緩沖液溶解,密封,冷藏保存。

1.9.2 抑菌試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法[12]考察黃花敗醬發(fā)狀根提取液額抑菌作用。無菌條件下,將直徑5.0 mm的無菌濾紙片浸泡于供試溶液中2 h,將濾紙片均勻擺放于細(xì)菌培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)皿中3片,分別加入頭孢曲松鈉(陽性對照)、供試液和陰性對照液,重復(fù)3次。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～17 h后,采用十字交叉法測定抑菌圈的直徑,按如下公式計(jì)算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子滅菌方法 將采用4%次氯酸和0.1%升汞滅菌后的黃花敗醬種子接種到MS固體培養(yǎng)基,25 d后考察不同處理方法對黃花敗醬種子出苗率的影響。結(jié)果見表1。

表1 不同處理方法對種子污染率的影響

從上表可以看出,2種消毒劑對黃花敗醬出苗率的影響不同,其中4%次氯酸效果優(yōu)于0.1%升汞,且在8 min時消毒效果最佳。

2.2 不同菌株和外植體對發(fā)狀根誘導(dǎo)率的影響 侵染的外植體不同,發(fā)狀根的誘導(dǎo)率也會存在差異。采用發(fā)根農(nóng)桿菌1000、A4、15834、1601等4種G-土壤桿菌浸染黃花敗醬葉片和莖段,25 d后觀察4種菌株的誘導(dǎo)效果,從表2和圖2可以看出,不同農(nóng)桿菌和外植體對黃花敗醬發(fā)狀根的誘導(dǎo)有不同的影響,且顯著性差異(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)。A4菌株感染的外植體于18 d左右即能侵染出發(fā)狀根,而其余三種菌株較A4菌株誘導(dǎo)出的發(fā)狀根數(shù)目少很多;A4菌株對莖段的平均誘導(dǎo)率達(dá)到79.17%,而1000、15834和1601菌株的平均誘導(dǎo)率分別為30.56%、11.11%和22.22%。A4、1000、15834和1601菌株對葉片的平均誘導(dǎo)率分別為34.70%、18.05%、5.56%和15.28%。由此可見,發(fā)根農(nóng)桿菌A4是誘導(dǎo)黃花敗醬莖段的最佳菌種。

圖2 黃花敗醬發(fā)狀根的誘導(dǎo)

注：a.A4侵染葉片;b.A4侵染莖段;c.莖段褐化

2.3 侵染時間不同對黃花敗醬發(fā)狀根誘導(dǎo)率的影響 農(nóng)桿菌菌株對外植體侵染時間的長短與誘導(dǎo)發(fā)狀根的數(shù)量密切相關(guān),菌株與外植體接觸時間長,則在外植體傷口處侵害細(xì)胞,最終導(dǎo)致外植體死亡;接觸時間短,則菌株無法完全感染細(xì)胞。本研究采用共培養(yǎng)法,利用農(nóng)桿菌株A4分別侵染黃花敗醬的外植體0、2、4、6、8、10 min后放置,25 d后觀察發(fā)狀根的誘導(dǎo)情況,計(jì)算誘導(dǎo)率。由圖3可以看出,黃花敗醬的發(fā)狀根隨著侵染時間的增加誘導(dǎo)率也逐漸升高,最佳的誘導(dǎo)時間為8 min,平均誘導(dǎo)率達(dá)到最高77.79%。侵染10 min后誘導(dǎo)率逐漸下降,侵染的外植體有蔫腐變黃現(xiàn)象出現(xiàn)。所以，8～10 min為黃花敗醬的最佳侵染時間。

表2 不同發(fā)根農(nóng)桿菌對不同外植體上黃花敗醬毛狀根的誘導(dǎo)效果

圖3 不同侵染時間對黃花敗醬毛狀根誘導(dǎo)率的影響

2.4 預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)對黃花敗醬發(fā)狀根誘導(dǎo)率的影響

2.4.1 預(yù)培養(yǎng)對黃花敗醬發(fā)狀根誘導(dǎo)率的影響 在農(nóng)桿菌侵染前對植體外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)處理,可使植物受體形成并釋放酚類信號分子,從而提高轉(zhuǎn)化率,同時能較好地解決褐化問題。本研究中,對黃花敗醬分別進(jìn)行0、12、24、48、60 h的預(yù)培養(yǎng)后用農(nóng)桿菌A4菌株侵染外植體,25 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出的發(fā)狀根數(shù),計(jì)算誘導(dǎo)率。從圖4我們可以看出,預(yù)培養(yǎng)時間不同對外植體毛狀根的誘導(dǎo)率也顯著不同。本實(shí)驗(yàn)中預(yù)培養(yǎng)時間在48 h時誘導(dǎo)率最高為79.17%,預(yù)培養(yǎng)60 h后誘導(dǎo)率開始明顯下降。

2.4.2 共培養(yǎng)對黃花敗醬發(fā)狀根誘導(dǎo)率的影響 共培養(yǎng)時間在植物毛狀根的誘導(dǎo)過程具有重要影響。共培養(yǎng)時間過長,外植體的轉(zhuǎn)化越難以實(shí)現(xiàn);共培養(yǎng)時間過短,發(fā)根農(nóng)桿菌中的基因片段不能及時的被整合到植物DNA上[12]。本研究中,對黃花敗醬的莖段分別進(jìn)行0、12、24、48、60 h共培養(yǎng),然后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出的發(fā)狀根總數(shù),計(jì)算誘導(dǎo)率。從圖4可以看出,不同的共培養(yǎng)時間對黃花敗醬毛狀根的誘導(dǎo)率存在顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳的共培養(yǎng)時間為48 h,誘導(dǎo)率高達(dá)84.33%,而預(yù)培養(yǎng)60 h后其誘導(dǎo)率開始下降。

圖4 預(yù)培養(yǎng)與共培養(yǎng)時間對黃花敗醬發(fā)狀根的影響

2.5 發(fā)狀根的PCR分子檢測結(jié)果 A4、15834、1601、1000發(fā)根農(nóng)桿菌所誘導(dǎo)的黃花敗醬毛狀根中,A4菌株的誘導(dǎo)率最高,且生長期短,能進(jìn)行液體擴(kuò)增培養(yǎng)。本研究中,將根系發(fā)達(dá)、分支較多、生長狀況好的發(fā)狀根、植物根和A4菌株中的DNA進(jìn)行PCR分子檢測并拍照(125V電壓,25 min)。由圖5可以看出,在外植體發(fā)狀根條帶(485 bp)處出現(xiàn)了與基因引物相同的條帶,自然狀態(tài)生長的根(未轉(zhuǎn)化)則未出現(xiàn)此條帶,表明發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株中質(zhì)粒DNA片段已整合進(jìn)入轉(zhuǎn)化根的基因組中。

圖5 黃花敗醬發(fā)狀根PCR檢測結(jié)果

注：M.Marker 2000;1.正常根;2.質(zhì)粒DNA;3.誘導(dǎo)根

2.6 黃花敗醬液體培養(yǎng)基篩選 使用不同種類的液體培養(yǎng)基對毛狀根的生長增殖狀態(tài)影響也不相同。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過25 d后觀察統(tǒng)計(jì),毛狀根在MS液體培養(yǎng)基中生長迅速,轉(zhuǎn)化根系發(fā)達(dá)并具許多細(xì)小的分枝,而且增殖倍數(shù)最高為21.8倍,其他培養(yǎng)基中增殖倍數(shù)依次為B5(18.7倍)、1/2MS(16.5倍)、R2(10.4倍)。由此可見MS液體培養(yǎng)基更適合用于黃花敗醬毛狀根增殖的培養(yǎng)。如圖6所示。

表3 不同pH對黃花敗醬毛狀根的影響

圖6 培養(yǎng)基種類對黃花敗醬毛狀根生長的影響

2.7 不同pH對毛狀根的影響 毛狀根增殖培養(yǎng)的液體培養(yǎng)液,因培養(yǎng)液的pH值不同,毛狀根的增殖量也不同,一般認(rèn)為酸性pH值對某些農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因有激活的作用,pH值一般在5.0～6.0時,有利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化,由表3可知,黃花敗醬毛狀根在液體培養(yǎng)基中,當(dāng)pH為6.0時增殖量達(dá)到最大,生長較旺盛;當(dāng)pH值大于6.0時,毛狀根增殖量開始逐漸減少,當(dāng)pH達(dá)到8時,毛狀根開始出現(xiàn)老化,停止生長。

圖7 蔗糖濃度不同對黃花敗醬發(fā)狀根生長增殖的影響

2.8 不同濃度的蔗糖對發(fā)狀根增殖的影響 植物外植體在固體MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出發(fā)狀根后,為了使其能進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),一般將其剪切放置液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng),本實(shí)驗(yàn)選用MS液體培養(yǎng)基,為了研究不同濃度的碳源對發(fā)狀根的增殖和和次生代謝產(chǎn)物的含量有什么不同的影響,試驗(yàn)操作過程中在MS液體培養(yǎng)基中分別加入濃度為5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L的蔗糖,25 d后稱取發(fā)狀根鮮重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7,圖8所示,蔗糖濃度在40 g/L時,毛狀根的增殖量平均最多達(dá)到20.93倍。而在50 g/L濃度時增殖倍數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢,其增殖倍數(shù)為15.09,由此在MS液體培養(yǎng)基中加入40 g/L蔗糖濃度為最佳。

圖8 黃花敗醬發(fā)狀根的增殖

注：a.發(fā)狀根;b.發(fā)狀根增殖;c.干燥的發(fā)狀根

2.9 黃花敗醬毛狀根總黃酮含量測定 根據(jù)總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.065 6x+0.000 6,相關(guān)系數(shù)r為0.999 6,按照總黃酮含量公式計(jì)算出黃花敗醬毛狀根、自然根中總黃酮的含量分別為9.12%、7.89%。黃花敗醬毛狀根中總黃酮的含量是自然根的1.16倍。

2.9.1 陽性藥的篩選 經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)得知,抑菌圈的直徑要適度,直徑過小,增大實(shí)驗(yàn)誤差;直徑過大,抑菌圈會覆蓋到相鄰紙片處,影響測量的準(zhǔn)確度[13]。結(jié)果見表4。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的最佳陽性藥為頭孢曲松鈉注射液(1.00 mg/mL)。

表4 不同陽性藥的抑菌圈直徑

2.9.2 黃花敗醬發(fā)狀根提液的抑菌作用考察 經(jīng)過抑菌培養(yǎng),與陽性藥抑菌圈直徑大小的對比結(jié)果,最終發(fā)現(xiàn)黃花敗醬發(fā)狀根總黃酮粗提取液在金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基中,其抑菌圈較圓且抑菌直徑較大,有明顯的抑菌作用,而在沙門氏菌的培養(yǎng)基中抑菌圈直徑很小且抑菌圈模糊不清,說明作用一般,對大腸桿菌幾乎沒有抑制作用。其中總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌率為40.6%,對沙門氏菌抑菌率為7.2%。結(jié)果見表5,圖9。對金黃色葡萄球菌的抑菌率比沙門氏菌高出5.63倍。

表5 黃花敗醬發(fā)狀根總黃酮粗提液對幾種微生物的抑菌圈直徑

圖9 總黃酮粗提液抑菌效果

注：a.對金黃色葡萄球菌的抑制;b.對沙門氏菌的抑制。1.陽性藥抑菌圈;2.黃酮抑菌圈;3.對照組抑菌圈

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在選用種子消毒劑為4%次氯酸和0.1%升汞,兩種消毒劑均能對其起到消毒作用,但對比來看4%次氯酸的作用效果能佳,故在之后的實(shí)驗(yàn)過程中,均采取此方法。發(fā)根農(nóng)桿菌1601，15834，1000，A4,均能誘導(dǎo)黃花敗醬外植體產(chǎn)生發(fā)狀根，但是A4誘導(dǎo)出的發(fā)狀根粗壯且長勢較好,發(fā)狀根誘導(dǎo)率最高為79.17%。在預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)均為48 h,侵染8 min,發(fā)狀根誘導(dǎo)率為83.33%本研究通過PCR檢測A4中Ri質(zhì)粒T-DNA的生根基因已整合進(jìn)入黃花敗醬發(fā)根基因組中,在發(fā)根擴(kuò)大培養(yǎng)中,在液體MS培養(yǎng)基pH值為6時中加入40 g/L蔗糖時最適合發(fā)根的擴(kuò)大培養(yǎng)。最終測得黃花敗醬毛狀根中總黃酮的含量是自然根中黃酮含量的1.16倍,且總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌率比沙門氏菌高出5.63倍。

[1]李玉基,張淑娜,李潔,等.黃花敗醬草對小鼠肝癌細(xì)胞血道轉(zhuǎn)移的影響[J].食品與藥品,2013,15(4):248-250.

[2]楊柳,姜海.黃花敗醬草化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(4):169-172.

[3]高亮,張琳,劉江云,等.黃花敗醬的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2011,42(8):1477-1480.

[4]張舒娜,邵財(cái),張浩,等.黃花敗醬不同居群的形態(tài)多樣性分析[J].吉林中醫(yī)藥,2014,34(7):710-712.

[5]王盈.黃花敗醬的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].齊魯藥事,2009,28(4):222-225.

[6]譚超,孫志良,周可炎,等.黃花敗醬化學(xué)成分及鎮(zhèn)靜抑菌作用研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2003(4):3-5.

[7]HuangY,SuCY,KuoHJ,et al.A comparison of strategies for multiple-gene co-transformation via hairy root induction[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(19):8637-8647.

[8]張來,羅正偉,張顯強(qiáng),等.發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的特征及其應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(15):8183-8185.

[9]陳偉莉,牟旭鵬,劉冬影.毛狀根在植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)方面應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].黑河學(xué)院學(xué)報(bào),2010,1(4):122-126.

[10]張淑麗,張?zhí)熘?楊世海.水飛薊發(fā)狀根培養(yǎng)體系的建立及其水飛薊賓含量的測定[J].中國中藥雜志,2014,39(11):2005-2010.

[11]唐浩國,單方方,魏曉霞,等.牡丹葉總黃酮抑菌活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(6):1355-1357.

[12]張海弢,包京姍,楊世海,等.王不留行毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(6):141.

[13]佟春蘭,包海鷹,圖力古爾.蒙古口蘑子實(shí)體石油醚提取物的化學(xué)成分及抑菌活性[J].菌物學(xué)報(bào),2010,29(4):619-624.

(2015-08-12收稿 責(zé)任編輯：王明)

熱烈慶?！妒澜缰嗅t(yī)藥》雜志第二屆編輯委員會編委黃璐琦教授被評為中國工程院院士

2015年12月7日，中國工程院公布了2015年院士增選名單，《世界中醫(yī)藥》雜志編委黃璐琦教授當(dāng)選醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)部院士，同時也是今年年齡最小的院士。黃院士是中藥資源與鑒定專家，中國中醫(yī)科學(xué)院常務(wù)副院長，首席研究員，中藥資源中心主任，全國中藥資源普查試點(diǎn)工作專家指導(dǎo)組組長，科技部重點(diǎn)領(lǐng)域中藥資源創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人，部局共建道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育基地)負(fù)責(zé)人，曾任國家973計(jì)劃項(xiàng)目首席科學(xué)家。黃院士以第一作者或通訊作者發(fā)表論文371篇，包括PNAS，JACS等SCI文章86篇，獲國家發(fā)明專利11項(xiàng)。黃院士為中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展做出了突出貢獻(xiàn)，影響巨大，院士稱號實(shí)至名歸。

喜訊傳來，《世界中醫(yī)藥》雜志社倍感驕傲和自豪，黃院士作為雜志社的編委，必將擴(kuò)大《世界中醫(yī)藥》雜志的影響力，提升雜志的整體形象，對雜志創(chuàng)品牌期刊具有十分重要的意義。

Establishment of Culturing System for Patrinia scabioscaefolia Fisch Hairy Roots and the Evaluation of Antibacterial Effect

Zhao Xue1,2,3, Kong Weijun2, Ma Xinyue1, Chang Guiying1, Dong Changying1, Yang Shihai3

(1JilinAgriculturalScienceandTechnologyCollege,Jilin132101,China; 2InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicinalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China; 3JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Objective:To establish the hairy roots culture system of Patrinia scabioscaefolia Fisch and analyze the flavone content in hairy roots culturing system and its antibacterial role of basic research.Methods:Hairy root of Patrinia scabioscaefolia Fisch were induced by the infection of four Agrobacterium rhizogenes strains: R15834, R1601, R1000, and A4. The infecting time, pre-culture and co-culture time on growth of hairy root were studied, and the hairy roots were detected by PCR. The purity of flavone was determined by UV, and determination of inhibition was tested by disk diffusion method.Results:The highest induction frequency was obtained from stem segment with 48 h pre-culture and co-culture which were induced by A4 for 8 min. The transformation frequency and proliferation rate could be raised by culture media with sucrose concentration of 40 g/L. The PCR examination result showed that rolB genes were successfully inserted into the hairy roots of Patrinia scabioscaefolia Fisch.Conclusion:Hairy root of flavonoids content is higher than that of the natural content and that the aqueous extrats had obvious antibacterial effect against Staphylococcus aureus.

Patrinia scabioscaefolia Fisch; Agrobacterium rhizogenes; Hairy root; Antibacterial effect

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項(xiàng)目(編號:吉教科合字[2015]第376號);長白山重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育項(xiàng)目(編號:吉農(nóng)院合字[2013]第S001號)

趙雪(1982.1—),男,醫(yī)學(xué)碩士,講師,研究方向:中藥學(xué),E-mail:yingxiongxiaoxue@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.032