張延平 李彥改 徐曉臣 王英杰 李印杰

河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（邯鄲056004）

帕金森病又稱特發(fā)性帕金森?。↖diopathic parkinson’s disease，PD），也被稱為震顫麻痹（Paralysis agitans，shaking palsy），是中老年人常見的錐體外系的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。到目前為止，PD的病因仍不清楚，目前治療只是控制其癥狀，而不能根治。綠茶多酚（Green tea polyphenols，GTPs）是一類含有多酚羥基的化學物質(zhì)，能夠明顯地清除體內(nèi)的有害自由基，抑制脂氧合酶的活性和脂質(zhì)過氧化作用，在許多神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中顯示出保護作用［1－2］。針灸具有疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)暢氣血、調(diào)和陰陽之功。本研究擬采用魚藤酮注射制備PD動物模型，探討綠茶多酚聯(lián)合針灸治療能否對多巴胺神經(jīng)元有保護和修復作用以及其作用機制。

1 材料與方法 1.1 材 料 Witstar大鼠50只，雄性，體重250～300g，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，根據(jù)隨機數(shù)字表將動物分為空白對照組（10只）、魚藤酮組（20只）和綠茶多酚＋針刺治療組（20只）。綠茶多酚、魚藤酮購自Sigma公司，酪氨酸羥化酶（TH）抗體、SP試劑盒、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）購自北京中杉金橋公司。

1.2 動物的處理 在葵花籽油中溶解魚藤酮，將混合液充分震蕩混勻后，于4℃避光保存。每日按照2.0mg／kg給魚藤酮組和綠茶多酚＋針刺治療組的大鼠背部皮下注射，進行PD模型的建立，以大鼠出現(xiàn)四肢不能站立行走，翻身困難，喪失主動進食能力為造模成功。綠茶多酚＋針刺治療組在造模成功后開始在大鼠飲水中加入GTPs，并且取筋會穴“陽陵泉”及“舞蹈震顫控制區(qū)”［3］，針刺雙側(cè)“陽陵泉”及“舞蹈震顫區(qū)”，采用提插和捻轉(zhuǎn)手法刺激，每次10min，每天治療1次?？瞻讓φ战M背部皮下注射葵花油1mL／kg，其余處置各組均一樣。連續(xù)觀察50d后處死所有大鼠。

1.3 黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元（Tyrosine hydroxylase，TH）計數(shù) 取空白對照組大鼠5只、魚藤酮組和綠茶多酚＋針刺治療組大鼠各10只。10% 的水合氯醛 （300mg／kg）腹腔麻醉動物，左心室插管快速灌注生理鹽水200mL以去除血液，再灌注含4% 多聚甲醛（0.1M，PH 7.4）400mL。取腦，置相同固定液中于4℃下后固定4h。而后浸30% 的蔗糖液 （0.1M，PH 7.4PB配制）至組織塊沉底，行冠狀冰凍切片，片厚40μm。采用免疫組化SP法，測定在40倍物鏡下1cm2面積黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目。

1.4 GSH和MDA含量的測定 取空白對照組大鼠5只、魚藤酮組和綠茶多酚＋針刺治療組大鼠各10只，斷頭處死大鼠，在低溫環(huán)境下迅速取出中腦黑質(zhì)，投入液氮中，－80℃保存?zhèn)溆?。實驗時，組織稱重、剪碎，加入冷生理鹽水，其中組織重量與冷生理鹽水體積按1∶9比例，放入勻漿器。勻漿器放在冰浴中，以2000轉(zhuǎn)／min轉(zhuǎn)速上下勻漿20次，然后吸至10mL離心管中。冰浴放置30min后，在4℃以3000轉(zhuǎn)／min，離心15min。小心吸出上清，根據(jù)實驗需要分別放入EP管中。參照試劑盒說明書分別測定GSH和MDA含量。

3 結(jié) 果 3.1各組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元計數(shù) 對照組、魚藤酮組和綠茶多酚＋針刺治療組中TH陽性細胞計數(shù)分別為（253.1±31.45）、（146.3±27.74）和（200.1±30.18）個／視野。與對照組比較，魚藤酮組TH陽性細胞數(shù)明顯低于對照組。經(jīng)過綠茶多酚＋針刺治療，TH陽性細胞數(shù)有明顯增加，見表1。

表1 各組大鼠TH陽性細胞的表達情況

2.2 各組GSH和MDA含量測定結(jié)果 與空白對照相比，GSH含量在魚組藤酮組和綠茶多酚＋針刺治療組均有降低，但是綠茶多酚＋針刺治療組的GSH含量高于魚藤酮組，而MDA含量則相反，各組GSH和MDA含量的變化具有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各組GSH和MDA含量的測定情況

4 討 論 大腦是帕金森病的主要發(fā)病部位。據(jù)中醫(yī)理論認為該病是風、虛、痰、瘀、精少、臟虛謂之本，內(nèi)臟虧虛、氣血不足，大腦髓海得不到充分的營養(yǎng)［4－5］。目前，臨床治療帕金森病常用的西藥是左旋多巴、溴隱停、麥角卡林等，但這些藥物毒副作用較大、效果不穩(wěn)定，而且遠期療效不肯定。外科手術(shù)從立體定向基底節(jié)治療，到蒼白球毀損治療，再到丘腦核團毀損術(shù)，治療費用昂貴，并且只是改善臨床癥狀，并不能延緩該病的發(fā)展?；蛑委煹倪h期療效也不確定。

綠茶是我國最常見的飲品之一，現(xiàn)代科學大量研究證實，茶葉含有與人體健康密切相關(guān)的生化成份，其中具有藥理作用的主要成份是茶多酚、咖啡堿、脂多糖、茶氨酸等。茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，包括黃烷醇（兒茶素）類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等。其中黃烷醇起重要作用，它主要由表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）等幾種單體組成［6］。近年來人們發(fā)現(xiàn)了GTPs對神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病有保護作用，但是對GTPs神經(jīng)保護作用的認識主要是通過體外細胞培養(yǎng)獲得的。人們發(fā)現(xiàn)在PC12細胞培養(yǎng)中加入GTPs可以顯著抑制神經(jīng)毒性藥物6－羥多巴（6－OHDA）誘導的凋亡［7］。另外，給小鼠注射神經(jīng)毒素1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫 吡 啶 1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine hydrochloride，MPTP）從而建立PD模型發(fā)現(xiàn)，GTPs腹腔注射或口服均可明顯減輕MPTP導致的中腦多巴胺神經(jīng)元的丟失［8］。

本研究給大鼠注射魚藤酮建立PD模型，并給一部分大鼠GTPs＋針灸干預(yù)，發(fā)現(xiàn)GTPs＋針灸組多巴胺能神經(jīng)元的缺失明顯低于魚藤酮組，并且提高了 MDA的含量和活性，降低了SOD的含量。其原因是EGCG可通過能夠通過血腦屏障滲入神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在造模前使用GTPs進行干預(yù)［9］，效果優(yōu)于造模后使用。該研究認為，GTPs不僅可以提高包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)整體內(nèi)環(huán)境的抗氧化能力和清除自由基的功能，而且還具有較強的抗氧化作用，提高其病理發(fā)生改變的閾值，降低損傷程度和范圍，最大程度地保護包括黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)，其效果遠遠優(yōu)于發(fā)生病變之后的治療性給藥以修復神經(jīng)的效果［10］。

GTPs在保護神經(jīng)細胞、抑制氧化應(yīng)激、抗興奮性毒性、抑制細胞凋亡等方面有一定作用，針灸治療PD無明顯副作用。因此，二者聯(lián)合可以作為治療PD較理想方法。

［1］ 李 瓊，李 勇.綠茶多酚防治老年神經(jīng)退行性疾病研究進展［J］.衛(wèi)生研究，2010，39（1）：123－126.

［2］ 李 軍，辛 勤，楊 雁.綠茶多酚藥理作用的研究進展［J］.中國熱帶醫(yī)學，2014，14（1）：128－130.

［3］ 陳日新.實驗針灸學［M］.北京：科學出版社，2014：134－137.

［4］ 劉寧平.中醫(yī)證型辯證治療帕金森的臨床研究［J］.中醫(yī)中藥，2012，10（19）：334－335.

［5］ 李 強，霍 青.中醫(yī)中藥治療帕金森病前景展望［J］.中醫(yī)臨床研究，2013，5（24）：117－119.

［6］ Mandel SA，Weinreb O，Amit T，et al.Molecular mechanisms of the neuroprotective／neurorescue action of multitarget green tea polyphenols［J］.Front Biosci（Schol Ed），2012，1（4）：581－598.

［7］ Zhao B.Natural antioxidants protect neurons in Alzheimer＇s disease and Parkinson＇s disease［J］.Neurochem Res，2010，34（4）：630－638.

［8］ Mandel SA，Amit T，Weinreb O，et al.Simultaneous manipulation of multiple brain targets by green tea catechins：apotential neuroprotective strategy for Alzheimer and Parkinson diseases［J］.CNS Neurosci Ther，2010，14（4）：352－365.

［9］ 陳 敏，黃雪芳，葉 俊，等.綠茶多酚對帕金森病小鼠多巴胺能神經(jīng)元保護作用研究［J］.重慶醫(yī)學，2013，42（7）：721－723.

［10］ Mandel SA，Amit T，Kalfon L，et al.Cell signaling pathways and iron chelation in the neurorestorative activity of green tea polyphenols：special reference to epigallocatechin gallate（EGCG）［J］.J Alzheimers Dis，2011，15（2）：211－222.