劉 宗，宋 莉，2* ，趙德剛，2*

(1.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;2.山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

雞 γ －干擾素(Chicken interferon gamma，ChIFN－γ)具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)疫苗免疫及抗球蟲等作用［1］。γ－干擾素(interferon gamma，IFN－γ)通過促進(jìn)NK細(xì)胞的殺傷活性［2］，以及誘導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞表達(dá)病毒抗原，增加免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺傷感染細(xì)胞的能力等途徑實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能［3］。酵母營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)和必需氨基酸含量高，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中5，6］。利用酵母菌作為宿主表達(dá)生產(chǎn)干擾素具有培養(yǎng)控制容易，生長(zhǎng)繁殖迅速，生產(chǎn)成本低廉，安全性高，表達(dá)產(chǎn)物具有活性和穩(wěn)定性［4］等優(yōu)勢(shì)。飼用酵母污染化學(xué)物質(zhì)和致病微生物后，會(huì)導(dǎo)致品質(zhì)變劣和畜禽中毒甚至死亡［7，8］。飼料霉菌污染每年給全球造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)千億美金［9］。感官性狀以及重金屬和微生物等衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，可以有效反映飼料酵母的質(zhì)量，關(guān)系到飼料安全、動(dòng)物養(yǎng)殖、食品安全和人類健康。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的ChIFN－γ釀酒酵母工程菌進(jìn)行干粉制備并對(duì)其安全性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，為進(jìn)一步開發(fā)利用ChIFN－γ微生態(tài)飼料添加劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型釀酒酵母菌株INVSC1購(gòu)自Invitrogen公司，攜帶ChIFN－γ基因的INVSC1/pYE－IFNG重組酵母工程菌株由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制。

1.2 方法

1.2.1 酵母工程菌粉制備 INVSC1/pYE－IFNG釀酒酵母工程菌的培養(yǎng)和目標(biāo)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)操作參見相關(guān)文獻(xiàn)［10］。誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌液按1500×g、4℃離心5 min，細(xì)胞沉淀用500μL滅菌水重懸后再用10000 r/min離心30 s，得到的細(xì)胞按建立的低溫冷凍干燥體系(另文發(fā)表)加入保護(hù)劑進(jìn)行重組工程菌干粉制備。

1.2.2 菌種形態(tài)鑒別 將重組工程菌干粉進(jìn)行復(fù)性和活化，接種到麥芽汁液體培養(yǎng)基和麥芽汁固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3 d后，觀察其生長(zhǎng)情況和顯微形態(tài)。

1.2.3 感官指標(biāo)分析 取100 g樣品置于干凈白色紙片上，觀察其色澤、形態(tài)、有無(wú)雜質(zhì)和異味。

1.2.4 酵母活細(xì)胞數(shù)測(cè)定 采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定酵母活細(xì)胞數(shù)，具體操作參照GB/T 22547－2008進(jìn)行。

1.2.5 毒性指標(biāo)測(cè)定 分別按GB/T 13091－2002、GB/T 13093 －2006、GB/T 13092 －2006、GB/T 13080－2004、GB/T 13079－2006方法，對(duì)重組釀酒酵母工程菌粉中的沙門氏菌、細(xì)菌總數(shù)、霉菌、鉛、總砷等衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 分別參照飼料的粗蛋白質(zhì)(GB/T 6432－1994)、粗脂肪(GB/T 6433－2006)、粗纖維(GB/T 6434－2006)、水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)含量(GB/T 6435－2006)、粗灰分(GB/T 6438－2007)、淀粉(GB/T 20194－2006旋光法)、總糖(GB/T 15672－2009)、總磷(GB/T 6437－2002分光光度法)、鈣(GB/T 6436－2002)氨基酸(GB/T 16631－2008)等方法，對(duì)工程菌粉的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)分析 采用FAO/WHO模式和全蛋模式［11］，通過氨基酸評(píng)分(Amino Acid Score，AAS)［12］、化學(xué)評(píng)分(Chemical Score，CS)、必需氨基 酸 指 數(shù) (Essential Amino Acid Index，EAAI)［13，14］、氨基酸比值系數(shù)分(Score of RCAA，SRCAA)［11，15］、必需氨基酸相對(duì)比值(Essential A-mino Acid Relative Ratio，EAARR)16－18］等多個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)工程菌粉的蛋白質(zhì)品質(zhì)。相關(guān)計(jì)算公式如下:

AAS=(樣品蛋白質(zhì)中某一種必需氨基酸的含量/參考蛋白質(zhì)模式中相應(yīng)必需氨基酸含量)×100(比值較低者為限制性氨基酸，其AAS值就是該氨基酸分)

CS=(樣品蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸的相對(duì)含量/參考蛋白模式中相應(yīng)必需氨基酸的相對(duì)含量)×100(比值較低者為限制性氨基酸，其CS值就是該化學(xué)分)

EAAI=［(ThrP/ThrS)×(ValP/ValS)×……×(LaysP/LysS)］∧(1/n)×100(p為樣品蛋白;s為參考蛋白;n為比較的必需氨基酸個(gè)數(shù))

RC=待測(cè)蛋白質(zhì)中某一種必需氨基酸的含量(g/100 g pro)/參考蛋白質(zhì)模式中相應(yīng)必需氨基酸含量(g/100 g pro)

RCAA=氨基酸比值/氨基酸比值之均數(shù)

SRCAA=100(1－CV)(其中CV為RCAA的變異系數(shù)，CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均數(shù))

EAARR=［1－∑|R－1|/n］×100(R為待測(cè)蛋白質(zhì)中某種氨基酸含量與參考蛋白模式中相對(duì)應(yīng)的必需氨基酸含量的比值，n為待測(cè)蛋白質(zhì)中必需氨基酸的個(gè)數(shù))

2 結(jié)果

2.1 酵母工程菌粉的感官和理化性狀

凍干制備的ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉色澤呈現(xiàn)淡黃色，具有酵母特殊氣味、無(wú)腐敗和異臭味，無(wú)異物，外觀為粉狀或者片狀(圖1A)，含水量為5.4%，復(fù)水后具有正常酵母細(xì)胞形態(tài)和高活細(xì)胞率，復(fù)水后活細(xì)胞數(shù)為267.854億個(gè)/g，符合GB/T 22547－2008標(biāo)準(zhǔn)中飼用活性干酵母粉的感官要求和酵母活細(xì)胞數(shù)≥150億個(gè)/g及水分含量≤6.0%的理化要求。

2.2 酵母的生長(zhǎng)及形態(tài)特性

菌體在液體培養(yǎng)基中緊密沉淀于底部，培養(yǎng)液清亮，無(wú)浮膜形成(圖1B);在麥芽固體培養(yǎng)基上，菌落大而濕潤(rùn)、隆起、乳白色、表面光滑無(wú)褶皺、邊緣清晰(圖1C);顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈卵圓形或者圓形，單個(gè)或者成雙，偶爾成簇狀，多邊芽殖(圖1D)。工程菌符合GB/T 22547－2008標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于飼用釀酒酵母菌的形態(tài)描述。

圖1 ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉及其復(fù)水生長(zhǎng)情況Fig.1 The recombinant yeastpowder with ChIFN－γgene and reactivation growth

2.3 工程菌粉中的有毒有害物質(zhì)含量

ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉中，細(xì)菌、霉菌、鉛和總砷含量分別為1.01×104CFU/g、7.1×103個(gè)/g、0.41mg/kg 和0.81mg/kg，無(wú)沙門氏菌，以上指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均顯著低于GB/T 22547－2008標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)有毒有害物質(zhì)要求的最低水平(表1)，制備的酵母工程菌粉符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的衛(wèi)生學(xué)要求。

表1 Ch IFN－γ釀酒酵母工程菌粉的衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)Tab.1 The hygienic evaluation of recombinant S.cerevisiae w ith Ch IFN－γgene

2.3 工程菌粉的營(yíng)養(yǎng)成分

ChIFN－γ重組工程菌粉的灰分、總糖、總磷和總鈣含量分別為 4.88%、16.60%、1.41% 和0.41%，均高于野生型菌粉，其粗脂肪(0.02%)與野生型菌粉接近，但粗蛋白質(zhì)(30.84%)和粗纖維(0.03%)含量卻顯著低于野生型菌粉(表2)。

工程菌粉中，總必需氨基酸和總非必需氨基酸的含量分別為27.72 mg/g和45.38 mg/g，均高于野生型菌粉。檢測(cè)的7種必需氨基酸中，甲硫氨酸、賴氨酸和亮氨酸的含量顯著高于野生型菌粉，但其蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和纈氨酸4種必需氨基酸的含量則低于野生型菌粉;檢測(cè)的9種非必需氨基酸中，組氨酸、精氨酸、尤其是甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和絲氨酸的含量均高于野生型菌粉，而其天門冬氨酸、半胱氨酸和脯氨酸含量則比野生型菌粉低(表3)。

AAS和CS分析表明(表4)，酵母工程菌粉的第一限制性氨基酸為苯丙氨酸+酪氨酸，第二限制性氨基酸為纈氨酸。根據(jù)FAO模式和全蛋白模式中 EAAI實(shí)用評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［14］和其它評(píng)定依據(jù)［11，17，18］，蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)表明(表4)，ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉的 EAAI(22.22)、SRCAA(22.77)和EAARR(77.41)均較低，表明該菌粉中的必需氨基酸與參考蛋白模式差異性較大，不符合理想蛋白模式要求，不宜直接用作蛋白質(zhì)飼料。

表2 Ch IFN－γ釀酒酵母工程菌粉的主要營(yíng)養(yǎng)成分Tab.2 Nutrient content of w ild－type yeast and recombinantS.cerevisiae w ith Ch IFN－γgene

表3 酵母工程菌粉的氨基酸檢測(cè)Tab.3 Am ino acid content of w ild－type yeast and recombinant S.cerevisiae w ith Ch IFN－γgene

表4 酵母工程菌粉的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析Tab.4 The protein nutrition and quality analysis of w ild －type yeast and recombinant S.cerevisiae based on the AAS，CS，EAAI，EAARR and SRCAA

3 討論

飼料中的重金屬、病原微生物等有毒有害物質(zhì)不但影響禽體代謝活動(dòng)和健康，還會(huì)在畜產(chǎn)品中殘留［19］，影響人體健康［20］;如沉積在動(dòng)物肝、腎、肌肉、乳汁及禽蛋等動(dòng)物產(chǎn)品中的霉菌毒素可通過食物鏈危害人類健康［21］。本研究中的ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉未檢測(cè)到沙門氏菌，其細(xì)菌和霉菌數(shù)、鉛和總砷含量均符合國(guó)家飼料添加劑標(biāo)準(zhǔn)中的衛(wèi)生規(guī)定，若嚴(yán)格控制制備工藝和過程，還可進(jìn)一步提高其安全性。

能量和蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)對(duì)家禽生產(chǎn)具有重要作用［22，23，24］，適量的飼糧代謝能和粗蛋白質(zhì)水平有利于提高產(chǎn)蛋性能［25］和獲得最佳繁殖性能［26］。ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉的總糖、總磷和總鈣含量較高，可極好的補(bǔ)充日糧能量濃度和礦物質(zhì)元素，尤其對(duì)禽蛋形成極為有利。氨基酸種類和數(shù)量決定蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［27］，尤其是必需氨基酸的含量和構(gòu)成比例常常作為評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的根本依據(jù)和主要指標(biāo)。日糧賴氨酸水平與動(dòng)物生長(zhǎng)［28］，［32］、胴體品質(zhì)［29］、飼料轉(zhuǎn)化率［30］和提高免疫功能［31］密切相關(guān)。工程菌粉的總必需氨基酸和總非必需氨基酸含量較高，尤其是賴氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸3種必需氨基酸的含量顯著高于野生型菌粉，但其必需氨基酸之間的差異性較大，粗蛋白質(zhì)含量較低，這可能和ChIFN－γ工程菌中重組蛋白的表達(dá)影響有關(guān)。有研究表明，目標(biāo)產(chǎn)物的誘導(dǎo)表達(dá)可嚴(yán)重抑制宿主菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其對(duì)外界環(huán)境變化的應(yīng)激力下降［33］。外源蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)常常會(huì)耗用宿主細(xì)胞的大量資源，對(duì)宿主造成代謝負(fù)荷，引起宿體內(nèi)的生理生化變化，甚至損害宿主正常的代謝功能［34］。雖然ChIFN－γ釀酒酵母工程菌粉的蛋白模式不屬于理想蛋白，不適合直接作為蛋白質(zhì)飼料使用，但其含有抗病免疫調(diào)節(jié)功能的重組ChIFN－γ，可以保護(hù)受病毒感染的雛雞和促進(jìn)生長(zhǎng)(未發(fā)表數(shù)據(jù))，并且該菌粉具有較好的安全性，復(fù)水活性高，可作為具有作為抗病免疫調(diào)節(jié)功能的飼料添加劑進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。

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