皮鈺珍，王雨施，何建斌，岳喜慶

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110866）

梅花鹿鹿角盤多肽雙酶水解工藝及優(yōu)化研究

皮鈺珍1，王雨施1，何建斌2，岳喜慶1

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110866）

鹿角盤是一味中藥，具有溫補(bǔ)肝腎、益脾胃、強(qiáng)筋骨、活血化瘀、治療乳癰初起等功效。研究以鹿角盤粉為原料，用水解度和多肽得率作為衡量最佳提取工藝的指標(biāo)，篩選出最佳雙酶組合，水解制得鹿角盤多肽，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計和響應(yīng)面（RSM）分析法，確定了最佳酶解工藝為：溫度49℃、pH8.0、加酶量11000 U/g、酶活比（木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶）為2∶1、底物質(zhì)量濃度為6 g/100 mL、水解時間270 min。在此條件下，水解度達(dá)到15.91%。

鹿角盤，鹿角盤多肽，雙酶水解，水解度

鹿角盤是一味傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為雄性鹿科動物馬鹿或梅花鹿經(jīng)鋸茸后，于翌年春季脫落的骨化殘角，是界于鹿茸骨化和未骨化之間十分堅硬的盤狀物質(zhì)[1-2]。鹿角盤中蛋白質(zhì)含量豐富，粗蛋白含量為32.8%[3]，其他主要成分有多糖、多肽以及鈣、鎂、鋅、銅一些無機(jī)元素[4-6]等。根據(jù)臨床應(yīng)用證明：鹿角盤具有溫補(bǔ)肝腎、鎮(zhèn)痛散癖、活血消腫、治陰癥瘡瘍等功效[7-8]，有著廣泛的藥理活性和醫(yī)療保健功能，在我國民間用鹿角盤治療乳腺增生效果尤為顯著[9]。

王麗虹等[7]采用分子篩方法制備鹿角脫盤水溶性成分，具有抗大鼠乳腺增生的作用；王志兵等[10]采用超微粉碎、浸提、鹽析、酶解、透析等方法提純鹿角脫盤蛋白多肽對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能有顯著影響。目前制備鹿角盤肽的方法主要包括分子篩層析、有機(jī)提取配合柱層析分離、鹽析、熱變性處理及凝膠過濾和酶解[11-16]。近年來，采用單酶水解制備鹿角盤肽的研究日益增多，原因是酶法水解反應(yīng)條件溫和、步驟簡潔、高利用率的優(yōu)點[17]，但僅采用單酶水解度較低，改采用雙酶水解，利用不同酶的專一性，則可以擴(kuò)大反應(yīng)酶的作用范圍，提高酶解效率[18]。

蛋白質(zhì)作為人體必不可少的營養(yǎng)素，在人體的生長代謝過程中很難被直接消化吸收，將蛋白質(zhì)水解成小肽和游離氨基酸，獲得具有較強(qiáng)生物活性的蛋白質(zhì)水解物，可提高在人體中的消化吸收利用率[19-20]。本研究利用雙酶水解法制備鹿角盤粉中的生物活性肽，應(yīng)用響應(yīng)面法對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定酶解最佳工藝條件，為鹿角盤多肽的制備以及其他骨化類組織的綜合利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹿角盤粉 由遼寧西豐養(yǎng)鹿場提供（80目）；堿性蛋白酶Alcalase 2.4L（9.14×104U/g）、胰蛋白酶（2.5×105U/g）、木瓜蛋白酶（4.0×105U/g）、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（3.0×104U/g）、復(fù)合蛋白酶（1.2×105U/g），BCA蛋白定量試劑盒 以上均購買于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

S-25型pH精密酸度計 上海理達(dá)儀器廠；TMTD-8222電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；CT14RD冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；UV-2100型分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿角盤粉水解工藝流程 鹿角盤粉→磁力攪拌器混勻處理→調(diào)pH→調(diào)溫度→酶解→滅酶（95℃水浴10 min）→離心（4500 r/min，15 min）→收集上清液→對沉淀物離心2次→合并上清液→鹿角盤多肽酶解液。

稱取3 g超微粉碎的鹿角盤粉末，加入50 mL磷酸鹽緩沖液，攪拌均勻，使用磁力攪拌器進(jìn)行混勻處理，調(diào)至最適酶解溫度，恒溫保持，用0.5 mol/L的NaOH或0.5 mol/L的HCl溶液調(diào)pH至相應(yīng)蛋白酶的最適pH，加入相應(yīng)蛋白酶開始酶解，不斷攪拌。同時維持溶液的pH恒定，并記錄水解時間和酶解過程中消耗的NaOH或HCl體積，以此來計算水解度。酶解反應(yīng)結(jié)束后，迅速升溫至95℃，水浴保持10 min，滅酶活，冷卻至室溫后，4500 r/min離心15 min，取上清液，用適量蒸餾水洗滌沉淀物再次離心，上述操作重復(fù)2次，合并兩次上清液，記錄上清液總體積[21]。

1.2.2 單因素實驗 以水解度（DH）為指標(biāo)并結(jié)合感官評價，對酶解得到多肽液的顏色、氣味、味道和溶液性狀進(jìn)行比較，分別選擇堿性蛋白酶Alcalase 2.4L、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解鹿角盤粉，篩選出兩種最適作用酶。

1.2.2.1 酶活比對水解的影響 取3 g鹿角盤粉末，在總加酶量為10000 U/g、溫度為47℃、pH為7.9、底物質(zhì)量濃度為6 g/100 mL、酶解時間為270 min時，考察酶活比（木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶）（1∶3、1∶1、1∶2、2∶1、3∶1）對水解度的影響。

1.2.2.2 酶解時間對水解的影響 取3 g鹿角盤粉末，在總加酶量為10000 U/g、溫度為47℃、酶活比為2∶1、pH為7.9、底物質(zhì)量濃度為6 g/100 mL時，考察酶解時間（0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5 h）對水解度的影響。

1.2.2.3 底物濃度對水解的影響 取3 g鹿角盤粉末，在加酶量為10000 U/g、酶活比為2∶1、溫度為47℃、pH為7.9、酶解時間為270 min時，考察底物質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10 g/100 mL）對水解度的影響。

1.2.2.4 加酶量對水解的影響 取3 g鹿角盤粉末，在酶活比為2∶1、底物質(zhì)量濃度為6 g/100 mL、溫度為47℃、pH為7.9、酶解時間為270 min時，考察加酶量（6000、8000、10000、12000、14000 U/g）對水解度的影響。

1.2.2.5 酶解溫度對水解的影響 取3 g鹿角盤粉末，在酶活比為2∶1、底物質(zhì)量濃度為6 g/100 mL、pH為7.9、加酶量10000 U/g、酶解時間為270 min時，考察酶解溫度（40、43、47、50、54℃）對水解度的影響。

1.2.2.6 pH對水解的影響 取3 g鹿角盤粉末，在酶活比為2∶1、底物質(zhì)量濃度為6 g/100 mL、加酶量10000 U/g、酶解溫度為47℃、酶解時間為270 min時，考察pH（7.0、7.3、7.7、8.1、8.5）對水解度的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、pH、加酶量、酶活比為考察因素，以水解度為考察指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的中心組合設(shè)計實驗，因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 指標(biāo)測定

1.2.4.1 水解度的計算 pH-state法主要是基于蛋白質(zhì)水解過程中，總是要伴隨質(zhì)子的釋放或吸收，質(zhì)子化的多少依賴于溶液的pH，通過加入的用于維持體系pH的堿或酸的量直接計算出水解度[22]。

式中：C、V：NaOH或HCl溶液的濃度（mol/L）和體積（mL）；Mp為原料中凈蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；htot為1 g原料蛋白質(zhì)中所含肽鍵的毫摩爾數(shù)（mmol/g），對鹿角盤蛋白質(zhì)該值取8.2[23-24]；α為氨基的平均解離度（α=1+ 10（pK-pH），pK為α氨基的解離常數(shù)，計算時取7.0，pH為實驗時采用的pH）。

1.2.4.2 多肽含量測定 采用微量BCA法[25]來測定組分中的多肽含量。

多肽得率的計算

式中：M0為水解液中蛋白質(zhì)總量；M1為原料蛋白質(zhì)總量；M2為酶蛋白質(zhì)的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶的篩選

由表2可知，復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶Alcalase 2.4L的水解度較大，但水解液呈現(xiàn)黃色并渾濁狀態(tài)，且腥苦味重、明顯，其感官性質(zhì)差，產(chǎn)物不易被接受利用；由于胰蛋白酶具有較強(qiáng)特異性，對精氨酸和賴氨酸的羧基端酶切位點有明顯專一性，因此水解度較低，對多肽得率進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的多肽得率可達(dá)到59.12%和57.86%，均高于其他三個酶系的多肽得率，且胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液澄清度較高，腥味最淡。因此，最終確定，以胰蛋白酶和木瓜蛋白酶作為水解鹿角盤粉的工具酶。

表2 各種蛋白酶對鹿角盤蛋白水解效果比較Table 2 Effect of different proteases on protein hydrolysis

2.2 雙酶水解鹿角盤粉的單因素實驗

2.2.1 酶活比的確定 結(jié)果如圖1所示，酶活比（木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶）為1∶1的酶系組合水解度最小，酶活比為2∶1的組合水解度最大，可達(dá)到15.68%，且觀察可知水解液澄清、無腥苦味。因為雙酶水解優(yōu)于單酶水解的關(guān)鍵就在于不同的酶系在酶切位點之間的協(xié)同互補(bǔ)作用，所以可在保持水解液最優(yōu)狀態(tài)的條件下，提高水解度。由此可知酶活比為2∶1左右時水解效果較好。

圖1 酶活比對鹿角盤多肽水解度的影響Fig.1 Effect of different ratios of enzyme activity protein hydrolysis

2.2.2 酶解反應(yīng)時間的確定 結(jié)果如圖2所示，隨著反應(yīng)時間延長水解度逐漸增大，較為明顯的是在前90 min，水解速度較快，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到240 min時，水解度變化減小，到300 min時已趨于平穩(wěn)，原因可能是在最初水解時，底物濃度大，酶濃度相對較高，酶作用的肽鍵數(shù)目較多，所以這一階段的水解速度較快，水解速率增加也快。隨著水解的進(jìn)行，水解底物中肽鍵的數(shù)目減少，從而使得水解速度減緩。除此之外，水解底物對酶解過程起到抑制作用的物質(zhì)也逐漸增加，很可能對酶的活性產(chǎn)生不良影響，水解速度更加緩慢。綜合考慮底物利用率和生產(chǎn)效率，最終確定水解時間為270 min。

圖2 酶解時間對鹿角盤多肽水解度的影響Fig.2 Effect of reaction time on protein hydrolysis peptide

2.2.3 底物濃度的確定 由圖3表明，在底物濃度為6 g/100 mL時，水解度達(dá)到最大值，在低底物濃度時，酶與底物不能充分結(jié)合；隨著底物濃度的增加，越來越多的酶分子能夠與底物中的肽鍵相結(jié)合，使酶解反應(yīng)充分進(jìn)行，一旦底物濃度過大，達(dá)到8 g/100 mL時，出現(xiàn)飽和，原料利用率低。綜合考慮，雙酶水解反應(yīng)底物濃度定為6 g/100 mL。

圖3 底物濃度對鹿角盤多肽水解度的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on protein hydrolysis

2.2.4 加酶量的確定 由圖4可知，隨著加酶量的增加，水解度逐漸增加，尤其是在8000～10000 U/g區(qū)間，水解度增加幅度較大，當(dāng)加酶量大于10000 U/g時，水解度增幅減少。原因是當(dāng)加酶量增加到一定程度后，酶分子出現(xiàn)一定剩余，此時底物已經(jīng)達(dá)到飽和，底物與酶不能進(jìn)行進(jìn)一步的有效反應(yīng)，限制了反應(yīng)的進(jìn)行。綜合考慮，雙酶水解反應(yīng)加酶量為10000 U/g左右。

2.2.5 酶解溫度的確定 由圖5可知，當(dāng)溫度穩(wěn)定在47℃左右時，水解度最高，達(dá)到15.89%，原因可能是隨著溫度的上升，分子活躍能力強(qiáng)，分子間有效碰撞頻率大，反應(yīng)速度快，從而增加水解度，當(dāng)溫度再升高時，酶活性下降，因此水解度曲線呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。

2.2.6 pH的確定 由圖6可知，隨著反應(yīng)液pH的增加，蛋白質(zhì)水解度逐漸上升，當(dāng)pH繼續(xù)增大，水解度出現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)pH處于過高或過低都會直接影響酶蛋白分子上氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而降低酶的催化活性，由圖可看出當(dāng)pH為8.1時，水解度較高。

圖4 加酶量對鹿角盤水解度和多肽得率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on protein hydrolysis

圖5 溫度對鹿角盤多肽水解度的影響Fig.5 Effect of temperature on protein hydrolysis

圖6 pH對鹿角盤多肽水解度的影響Fig.6 Effect of pH value on protein hydrolysis

表3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗方案及結(jié)果Table 3 Results of response surface experiments

2.3 雙酶水解條件的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

以水解過程中酶活比、加酶量、pH和酶解溫度為因素，以水解度為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平共29次實驗點的響應(yīng)面分析實驗[26]，響應(yīng)面優(yōu)化實驗方案及結(jié)果見表3、方差分析和酶解各因素顯著性比較結(jié)果見表4。

利用SPSS軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到回歸方程為：Y=14.08＋0.81X1＋0.92X2＋0.18X3＋0.72X4-0.052X1X2＋0.29X1X3-0.015X1X4-0.1X2X3＋0.08X2X4-0.06X3X4-0.14X12＋0.055X22-0.11X32＋0.031X42。

為了檢驗方程的有效性，對鹿角盤多肽雙酶水解建立的模型進(jìn)行方差分析。由表4可知，該模型顯著性達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05），說明該模型有較好的擬合度?；貧w系數(shù)顯著性檢驗顯示，一次項X1、X2、X3、X4，交互項X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4，二次項X12、X22、X32、的影響均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），二次項X42的影響達(dá)到顯著水平（p＞0.05）。由各因素的F值能夠反映出各因素對實驗指標(biāo)的影響程度，F(xiàn)值越大，表明對實驗指標(biāo)的影響越大，即越重要[27]。根據(jù)方差分析表，由p值可知，在整個實驗范圍對水解度影響的大小依次為：酶解溫度＞pH＞酶活比＞加酶量。

回歸方程的特征值存在異號，因此在回歸方程所對應(yīng)的拋物線不存在最大值，需進(jìn)行嶺分析，將酶解溫度、pH、加酶量和酶活比分別固定，水解度隨其余參數(shù)變化的趨勢如圖7～圖10所示，響應(yīng)面圖表現(xiàn)有扭曲，說明各兩因素之間存在交互作用，交互顯著性可見表4，圖像曲面沒有呈碗狀，原因可能是由于研究的目的為讓所有考察的單因素都發(fā)揮出最佳效果，而單因素之間，對實驗指標(biāo)的影響效果也存在強(qiáng)弱，可能各因素之間的影響能力差距并不大，所以，當(dāng)混合在一起時，有可能效應(yīng)疊加或效應(yīng)減弱。由圖7、圖9、圖10可知，pH和溫度對鹿角盤水解度的影響優(yōu)于加酶量和酶活比，在各交互圖的全值變化范圍內(nèi)，在分別固定pH和溫度水平時，水解度隨著酶活比和加酶量的改變呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢；由圖8可知，酶解溫度對水解效果的影響略優(yōu)于pH[21]。

表4 水解度回歸模型方差分析表Table 4 Variance analysis of regression equation

圖7 pH和酶活比對水解度的響應(yīng)面分析Fig.7 RSM analysis of the combined effect of pH and ratio of protease on DH

圖8 pH和溫度對水解度的響應(yīng)面分析Fig.8 RSM analysis of the combined effect of pH and temperature on DH

圖9 pH和加酶量對水解度的響應(yīng)面分析Fig.9 RSM analysis of the combined effect of pH and enzyme dosages on DH

圖10 溫度和酶活比對水解度的響應(yīng)面分析Fig.10 RSM analysis of the combined effect of temperature and ratio of protease on DH

通過Desigh-Expert 8.0 Trial軟件分析可知，雙酶水解鹿角盤多肽的最佳酶解工藝為溫度49.00℃、pH8.00、加酶量10999.97 U/g、酶活比（木瓜∶胰）為2.02∶1，在此優(yōu)化條件下，鹿角盤多肽的水解度的模型理論值為15.67%，為實際操作方便，將理論值校正為溫度49℃、pH8.0、加酶量11000 U/g、酶活比（木瓜∶胰）為2∶1，此時，驗證實驗水解度指標(biāo)可達(dá)到15.91%，與理論預(yù)測值的相對誤差在1.5%左右，因此響應(yīng)面法所得的酶解條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。

3 結(jié)論

研究通過單因素實驗及響應(yīng)面優(yōu)化實驗，選擇胰蛋白酶和木瓜蛋白酶雙酶組合水解，實驗結(jié)果表明雙酶水解效果優(yōu)于單酶水解，最佳的酶解工藝條件為：酶解時間270 min、溫度49℃、pH8.0、底物質(zhì)量濃度6 g/100 mL、酶活比為2∶1、加酶量11000 U/g時，水解度達(dá)到15.91%。按此工藝制備的水解液感官性狀良好，呈透明淡黃色，易接受，無腥苦味，易吸收，可作為功能性食品的添加原料。

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Bienzymatic hydrolysis process of sika deer antler base

PI Yu-zhen1，WANG Yu-shi1，HE Jian-bin2，YUE Xi-qing1
（1.College of Food，Shenyang Agriculture University，Shenyang 110866，China；2.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Shenyang Agriculture University，Shenyang 110866，China）

Antler base as a traditional Chinese medicine，is believed to nourish liver，tonify，kidney，invigorate spleen and stomach，strengthen bones and muscles，promote blood flow and treat mastitis early.In this paper，antlers base powder as raw material，the degree of hydrolysis was as a measure of the optimal indicators of the extraction process.And the best combination of dual enzymatic hydrolysis of peptides was selected and obtained.Based on one-factor-at-a-time method，the response surface（RSM）analysis method based on Box-Behnken design was applied.The result of determining the optimal level of enzyme hydrolysis process is：temperature of 49℃，pH of 8.0，270 min with enzyme dosage of 11000 U/g，enzyme activity ratio of（papain∶trypsin）2∶1 and a substrate concentration of 6 g/100 mL.Under this condition，the hydrolysis degree could be reached 15.91%，respectively.

antlers base；antlers base peptide；bienzymatic hydrolysis；hydrolysis degree

TS201.2

A

1002-0306（2015）22-0203-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.034

2015－03－31

皮鈺珍（1974-），女，博士，副教授，研究方向：動物性食品加工，E-mail：1204872597@qq.com。

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目（201331004-2）；遼寧省優(yōu)秀人才培育項目（2015020771）。