王 健，艾濤波，岳清洪

（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院（東區(qū)），四川成都，610100）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）具有致癌作用，如今被廣泛用于工業(yè)涂料及動(dòng)物麻醉[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，氨基甲酸乙酯也是發(fā)酵食品（如醬油、酵母、奶酪）和酒精飲料（如黃酒、白酒、葡萄酒）的副產(chǎn)物[3-6]。而白酒作為一種深受我國(guó)大眾喜愛的酒精飲料，市場(chǎng)規(guī)模龐大，有報(bào)道稱[7-8]，中國(guó)白酒到2016年將占到全球烈酒消費(fèi)量的近50%，因而針對(duì)氨基甲酸乙酯殘留量的測(cè)定對(duì)于我國(guó)食品安全和公眾健康都有著極為重要的意義。

目前關(guān)于食品氨基甲酸乙酯的檢測(cè)，我國(guó)僅有進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測(cè)方法氣相色譜-質(zhì)譜法》[9]以及吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DBS 22/011—2013《飲料酒中氨基甲酸乙酯的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法》[10]，而氨基甲酸乙酯的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚處于征求意見階段。SN/T 0285—2012先采用二氯甲烷液液萃取，然后用正己烷和PSA凈化后進(jìn)行分析，該方法操作費(fèi)時(shí)繁瑣，且回收率不穩(wěn)定。DBS 22/011—2013和食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（非正式文本）均采用固相萃取技術(shù)，方法簡(jiǎn)便易操作，但洗脫時(shí)采用的乙醚屬于易制毒試劑，購(gòu)買比較麻煩[11-12]。本實(shí)驗(yàn)采用氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱對(duì)酒中的氨基甲酸乙酯進(jìn)行提取凈化，同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量[13]，樣品處理步驟簡(jiǎn)單迅速，無(wú)需其他除雜過程（如正己烷淋洗小柱），且二氯甲烷用量較少，不使用乙醚，采用同位素內(nèi)標(biāo)法也可以避免前處理造成的誤差，方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)之外，可供各檢測(cè)機(jī)構(gòu)參考用于白酒氨基甲酸乙酯檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純）、二氯甲烷（色譜純）：美國(guó)Sigma公司；無(wú)水硫酸鈉（分析純）；D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.6%）：加拿大CDN ISOTOPES公司；氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.7%）：美國(guó)AccuStandard公司；氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱（Cleanert EC-SPE購(gòu)于Agela，4 g/25 mL）。白酒：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N/5973i氣相色譜質(zhì)譜儀：美國(guó)安捷倫公司；FA2004N分析天平（感量0.000 1 g）：上海菁華公司；Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)heidolph海道夫公司；DragonLab MX-S漩渦混合器：深圳良誼公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)（D5-氨基甲酸乙酯）溶液的配制：準(zhǔn)確稱取約10 mg（精確至0.000 1 g）D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。取上述儲(chǔ)備液1 mL用乙腈定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)使用液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取約10 mg（精確至0.000 1 g）氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再取上述儲(chǔ)備液1 mL用乙腈定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。用乙腈逐級(jí)稀釋使用液，并加入內(nèi)標(biāo)，得到質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL（其中內(nèi)標(biāo)D5-氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜操作條件

氣相色譜（gas-chromatography，GC）條件：毛細(xì)柱HP-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230 ℃；載氣：高純氦氣；流速1 mL/min；程序升溫：60 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min速率升至150 ℃，保持1 min；使用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS)條件：接口溫度為240 ℃；電離方式為電子電離源（electron ionization，EI）；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；掃描模式為單離子檢測(cè)掃描（single ion monitoring，SIM）；氨基甲酸乙酯監(jiān)測(cè)離子：62，74，89，其中定量離子為62；D5-氨基甲酸乙酯監(jiān)測(cè)離子：64，76，89，其中定量離子為64；溶劑延遲時(shí)間為13.5 min。

1.3.3 樣品處理

稱取4 g 白酒于50 mL 樣品瓶中，加入內(nèi)標(biāo)0.4 mL，渦旋混合均勻，將樣品加入氨基甲酸乙酯專用凈化柱上，靜置10 min以保證樣品和填料充分濕潤(rùn)（可用真空泵施加負(fù)壓以利于填料的吸收）。用20 mL二氯甲烷分兩次洗脫，雞心瓶收集洗脫液，將洗脫液在40 ℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2 mL乙腈洗滌雞心瓶，隨后加入少量無(wú)水硫酸鈉，靜置片刻，用有機(jī)相濾膜進(jìn)行過濾，取少量入進(jìn)樣瓶，使用上述儀器條件上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 樣品定性與定量

質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定，在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子全部出現(xiàn)，同時(shí)所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)離子的相對(duì)豐度一致，且波動(dòng)范圍在容許偏差之內(nèi)，可判定樣品中存在氨基甲酸乙酯。用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中氨基甲酸乙酯的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在上述色譜柱和色譜條件下，氨基甲酸乙酯與內(nèi)標(biāo)分離效果好，峰形對(duì)稱，靈敏度高。氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的總離子流圖如圖1所示。氨基甲酸乙酯的保留時(shí)間為14.12 min，D5-氨基甲酸乙酯的保留時(shí)間為14.03 min，兩者的保留時(shí)間較接近，定量離子無(wú)干擾。分別提取氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的定量離子62和64，其定量離子色譜圖見圖2。氨基甲酸乙酯的質(zhì)譜圖見圖3，D5-氨基甲酸乙酯的質(zhì)譜圖見圖4。

圖1 氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatorgraphy of ethyl carbamate and D5-ethyl carbamate

圖2 D5-氨基甲酸乙酯(A)和氨基甲酸乙酯(B)的定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatography of D5-ethyl carbamate (A)and ethyl carbamate (B)

圖3 氨基甲酸乙酯質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of ethyl carbamate

圖4 D5-氨基甲酸乙酯質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of D5-ethyl carbamate

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

將配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液在設(shè)置好的儀器條件下進(jìn)行檢測(cè)，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程為y=6.003x+5.692E-003（相關(guān)系數(shù)為0.999），其中x為峰面積，y為目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/g），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度色譜圖的信噪比S/N=3計(jì)算，此方法檢出限為1 μg/kg。

2.3 加標(biāo)回收率及精密度

向酒樣中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度水平下做6次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定加標(biāo)回收率，平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表1。由表1可知，本方法具有較好的精密度和回收率，可以滿足測(cè)定要求，樣品中有少量的氨基甲酸乙酯檢出，故加標(biāo)樣品本底為陽(yáng)性樣品。白酒樣品色譜圖見圖5，白酒樣品加標(biāo)色譜圖見圖6（加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL）。

表1 白酒加標(biāo)回收率及精密度Table 1 The recovery rate and precision of liquor

圖5 白酒樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of Chinese liquor sample

圖6 白酒樣品加標(biāo)色譜圖Fig.6 Chromatogram of Chinese liquor with standard substance

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用該氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱和同位素內(nèi)標(biāo)法檢定白酒中氨基甲酸乙酯能有較好的穩(wěn)定性和回收率，該方法對(duì)二氯甲烷的需求量也不高，在做好檢驗(yàn)員防護(hù)的情況下，也是較為安全的。同時(shí)，該氨基甲酸乙酯專用柱具有一定的除雜能力，對(duì)白酒中的氨基甲酸乙酯能有較高的靈敏度，快速、簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于大批量樣品的前處理。

利用該方法隨機(jī)抽取市面上銷售20種白酒產(chǎn)品，氨基甲酸乙酯檢出率為92.1%，含量約為0.01～0.2 μg/g，和國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[14-16]。

[1]陸 健，曹 鈺.葡萄酒中氨基甲酸乙酯的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1996（3）：79-80.

[2]朱志鑫，吳惠勤，黃曉蘭，等.發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的[J].食品科技，2009，34（6）：287-290.

[3]高年發(fā)，寶菊花.氨基甲酸乙酯的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2006，25（9）：1-4.

[4]宋 鋼.酒類的安全性調(diào)查-氨基甲酸乙酯的分析[J].中國(guó)釀造，2008，27（3）：99-102.

[5]單美娜，徐曉楓，蒲云霞，等.固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定白酒中氨基甲酸乙酯[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014（8）：1249-1250.

[6]吳 帥，馬佩選，張 燕.固相萃取葡萄酒中氨基甲酸乙酯的形成機(jī)理[J].中外葡萄與葡萄酒，2010（3）：66-69.

[7]錢 沖，廖永紅，張 弦，等.白酒生產(chǎn)機(jī)械自動(dòng)化技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2013，32（12）：5-8.

[8]楊國(guó)華，邱樹毅，黃永光.醬香白酒生產(chǎn)中產(chǎn)香微生物研究[J].中國(guó)釀造，2011，30（4）：24-27.

[9]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 0285—2012 出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測(cè)方法氣相色譜-質(zhì)譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[10]吉林省衛(wèi)生廳.DBS 22/011—2013 飲料酒中氨基甲酸乙酯的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[11]吳平谷，陳正冬.固相萃取結(jié)合GCMS 法測(cè)定酒中氨基甲酸乙酯[J].衛(wèi)生研究，2004，33（5）：627-628.

[12]肖 泳，鄧放明.發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2012，3（3）：216-221.

[13]梁新紅，趙瑞香，周全霞.酒精飲料中氨基甲酸乙酯檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2010，31（8）：400-403.

[14]宋利軍，楊 竹，周銀古，等.江西省產(chǎn)黃酒中氨基甲酸乙酯殘留量的GC-MS 分析[J].中國(guó)釀造，2014，33（3）：147-150.

[15]石維妮，劉曉毅，趙玉琪，等.發(fā)酵性食品中的氨基甲酸乙酯含量調(diào)研[J].中國(guó)釀造，2009，28（11）：124-126.

[16]張瑞雨，師 真，梁志堅(jiān)，等.2013 年昆明市售散裝酒中氨基甲酸乙酯殘留量的調(diào)查[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，24（21）：3151-3152.