虞鳳慧，徐澤平,2 *，謝海濤

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.濱州市環(huán)境微生物技術(shù)工程研究中心，山東 濱州 256500）

殼聚糖是由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和葡糖胺（GlcN）通過β-（1-4）-糖苷鍵相連接的多糖[1-3]，它是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物[4-6]。殼聚糖酶（chitosanase，EC3.2.1.99）是一種可專一性降解殼聚糖的糖苷水解酶[7]，可以選擇性地、特異性地切斷殼聚糖的β-（1-4）-糖苷鍵，得到特異分子量范圍的殼寡糖[8]。殼寡糖是目前僅知的唯一的堿性寡糖[9]，具有獨(dú)特的生物活性[10-12]，在醫(yī)藥、飼料、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[13-16]。隨著殼寡糖的酶法制備工藝的深入研究，殼聚糖酶的生產(chǎn)及應(yīng)用研究引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為目前的研究熱點(diǎn)之一。

殼聚糖酶主要分布于細(xì)菌[17]、真菌[18]、病毒等微生物中。目前已報(bào)道有多種來源的菌株具有產(chǎn)生殼聚糖酶的能力，但已分離出的殼聚糖酶酶活力不高，使用效率較低，進(jìn)而使其制備殼寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)成本一直居高不下。因此，開發(fā)高活力、高產(chǎn)的殼聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)菌株資源意義重大。本研究擬從黃河三角洲地區(qū)的腐敗落葉中分離出一株高產(chǎn)殼聚糖酶的芽孢桿菌菌株，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行分離、鑒定，以期為殼聚糖酶生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗落葉：取自黃河三角洲地區(qū)；水溶性殼聚糖（脫乙酰度＞90%）：浙江金殼制品有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

初篩培養(yǎng)基：水溶性殼聚糖1.5%，硫酸銨0.5%，酵母浸粉0.5%，磷酸二氫鉀0.03%，磷酸氫二鉀0.07%，七水硫酸鎂0.005%，瓊脂粉1.6%，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，葡萄糖1%，pH 7.0。

液體發(fā)酵（復(fù)篩）培養(yǎng)基：水溶性殼聚糖1.5%，硫酸銨0.5%，酵母浸粉0.5%，磷酸二氫鉀0.03%，磷酸氫二鉀0.07%，七水硫酸鎂0.005%，氯化鈉0.5%，葡萄糖0.2%，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-5型低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；VORTEX-5旋渦混和器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA2004型電子天平：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

（1）殼聚糖酶產(chǎn)生菌的初篩

稱取粉碎的腐敗落葉10 g，加入90 mL 無菌水中，振蕩30 min，使樣品與水充分混合，取混合液依次稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7等不同的稀釋度，將稀釋液涂布于初篩培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)2～5 d，觀察初篩培養(yǎng)基上菌落周圍有無透明圈出現(xiàn)。以透明圈直徑與菌落直徑比值的大小作為篩選產(chǎn)殼聚糖酶菌株的指標(biāo)，并進(jìn)行分離純化。

（2）殼聚糖酶產(chǎn)生菌的分離純化

將分離的菌株接入種子培養(yǎng)基中，33 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d后，用接種環(huán)取少量菌液接入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，采用平板劃線分離法對(duì)菌株進(jìn)行純化，33 ℃培養(yǎng)2 d后，取單菌落接入斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，備用。

（3）殼聚糖酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩

種子培養(yǎng)：無菌條件下，取新鮮的斜面保藏菌種1～3環(huán)于種子培養(yǎng)基中，在33 ℃、150 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12～18 h，即為種子液。

液體發(fā)酵培養(yǎng)：無菌條件下，按5%的接種量，將種子液轉(zhuǎn)接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，33 ℃、150 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)2 d，發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為殼聚糖酶粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）殼聚糖酶活性測(cè)定

采用DNS法[19]。

酶活定義：50 ℃條件下，1 mL液體酶每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量，即為一個(gè)酶活力單位，U/mL。

1.3.2 菌種鑒定

菌體形態(tài)觀察：將分離純化的產(chǎn)殼聚糖酶菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌體形態(tài)及菌落特征；接種于種子培養(yǎng)基中，33 ℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h，進(jìn)行革蘭氏染色[20]。

生理生化試驗(yàn)：糖類發(fā)酵試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、甲基紅（methyl red，MR）試驗(yàn)、過氧化氫酶定性試驗(yàn)、生長(zhǎng)溫度的測(cè)定、酪氨酸水解試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[21]方法進(jìn)行。

16SrDNA序列分析：提取菌種的總DNA，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，將16S rDNA測(cè)序結(jié)果在GenBank的核酸數(shù)據(jù)中進(jìn)行同源性比對(duì)、分析。由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選及酶活測(cè)定

通過菌種初篩，從黃河三角洲地區(qū)的腐敗落葉中分離出9株產(chǎn)殼聚糖酶菌株，再經(jīng)分離純化和復(fù)篩，獲得了1株產(chǎn)殼聚糖酶酶活最高的菌株，命名為XHT-0903，該菌株液體發(fā)酵酶活力達(dá)20 U/mL。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌落及形態(tài)特征

菌株XHT-0903該菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈圓形凸起，表面粗糙有蠟光，不透明，無色素，白色，似毛玻璃（如圖1所示）。菌落直徑約6 mm。

圖1 XHT-0903菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of strain XHT-0903

革蘭氏染色時(shí)菌體被均勻的染成藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌。菌體形狀為桿狀，兩端鈍圓，且呈短鏈桿狀排列，菌體大（如圖2所示）。培養(yǎng)6 h后可形成芽孢，芽孢圓形，小于菌體。參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步確定該菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖2 XHT-0903菌株的光學(xué)顯微鏡圖Fig.2 Optical micrograph of strain XHT-0903

2.2.2 生理生化特征

生理生化鑒別試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，菌株XHT-0903能利用葡萄糖和乳糖；能水解酪氨酸和淀粉，其中在含有L-酪氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)至14 d時(shí)，酪氨酸結(jié)晶已經(jīng)完全被水解而變?yōu)橥该?；V.P.試驗(yàn)、甲基紅（MR）試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均呈陽性；生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)顯示，XHT-0903生長(zhǎng)溫度范圍為15～45 ℃，最適溫度為30～45 ℃。

根據(jù)上述形態(tài)學(xué)及生理生化特性研究，將菌株XHT-0903初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

表1 XHT-0903菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characterizations of strain XHT-0903

2.2.3 16S rDNA序列分析結(jié)果

PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，測(cè)序片斷長(zhǎng)1 402 bp。將該序列登錄到GenBank，登錄號(hào)為HM358155。采用NCBI中的Blast軟件，將測(cè)得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明，該序列與數(shù)據(jù)庫中的Bacillus屬的不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性，與其中5株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）菌株有100%的同源性。采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3所示。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性，進(jìn)一步確定XHT-0903菌株為蠟樣芽孢桿菌。該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.4032。

圖3 XHT-0903菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain XHT-0903

3 結(jié)論

本研究分離出一株殼聚糖酶高產(chǎn)菌株XHT-0903，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA序列分析，確定為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。相比已報(bào)道的產(chǎn)殼聚糖酶菌株，菌株XHT-0903具有產(chǎn)酶酶活高的優(yōu)點(diǎn)，為高活力、高產(chǎn)的殼聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)菌株資源的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本研究下一步將進(jìn)行XHT-0903的固體發(fā)酵、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、殼聚糖酶解工藝等研究，以期為殼聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

[1]王艷君，卓少玲，陳 盛，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶學(xué)特性分析[J].微生物學(xué)通報(bào)，2012，39（12）：1734-1745.

[2]SHAHIDI F,ARACHCHI A K V,JEON Y J.Food applications of chitin and chitosans[J].Trends Food Sci Tech,1999,10(2):37-51.

[3]程仕偉，張 盈，倪培拙，等.產(chǎn)殼聚糖酶的腸桿菌分離鑒定及其培養(yǎng)特性研究[J].魯東大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，30（1）：43-47.

[4]涂紹勇，楊愛華，陳 燕，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶解條件的研究[J].食品科技，2010，35（6）：21-22.

[5]陳小娥，夏文水，余曉斌.微生物殼聚糖酶研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)，2004，28（3）：72-76.

[6]涂紹勇，楊愛華，梅雙喜，等.酶法降解殼聚糖工藝研究[J].化學(xué)與生物工程，2009，26（12）：63-65.

[7]季更生，陳愛春.微生物殼聚糖酶的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2010，31（3）：297-301.

[8]SOMASHEKAR D,JOSEPH R.Chitosanases-properties and applications:a review[J].Bioresource Technol,1996,55(1):35-45.

[9]黃惠莉，朱利平.殼聚糖酶的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（6）：439-443.

[10]SIMUNEK J,KOPPOVA I,FILIP L,et al.The antimicrobial action of low-molar-mass chitosan,chitosan derivatives and chitooligosaccharides on bifidobacteria[J].Folia Microbiol,2010,55(4):379-382.

[11]ZHANG J L,XIA W S,LIU P,et al.Chitosan modification and pharmaceutical/biomedical applications[J].Mar Drug,2010,8(7):1962-1987.

[12]劉 萍，劉 靖，祁興普，等.綠色木霉產(chǎn)內(nèi)切殼聚糖酶的鑒定及酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（12）：254-255.

[13]屠 潔，張榮華.殼聚糖酶的研究進(jìn)展與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：403-406.

[14]李劍峰，劉必謙，洪松柏，等.高產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2010，3（3）：127-130.

[15]YOL J J,SHANIDI F,KIM S K.Preparation of chitin and chitosan chito-oligosacchrides and their applications in physiological functional foods[J].Food Rev Int,2000,16(2):159-176.

[16]KHAN W,PRITHIVIRAJ B,SMITH D L,et al.Chitosan and chitinoligomers increase phenylalanine ammonia-lyase and tyrosine ammonialyase activities in soybean leaves[J].Plant Physiol,2003,160(8):859-863.

[17]石會(huì)會(huì)，高艷艷，王秀英，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)，2014，35（2）：54-57.

[18]賈艷萍，張?zhí)m河，韓 利.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].生物技術(shù)，2010，20（2）：62-64.

[19]王艷君，陳 盛，楊 謙，等.產(chǎn)殼聚糖酶菌株的分離、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].生物學(xué)雜志，2012，29（6）：39-43.

[20]沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，1996.

[21]R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1984.