馬丁艾遙 馬丁艾路 王慧君 周文浩

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·綜述·

全外顯子組測(cè)序：兒童疾病診斷新思路

馬丁艾遙1,4馬丁艾路3,4王慧君2周文浩2

縱觀人類遺傳學(xué)的發(fā)展，不斷有新興技術(shù)被運(yùn)用于疾病病因的研究中。從各種流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)到如今廣泛采用的以假說(shuō)為導(dǎo)向的候選基因法[1]，從以家庭為基礎(chǔ)的遺傳連鎖研究[2～4]到全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)[5～8]，雖然這些方法均能在不同程度上反映疾病的遺傳易感性，但仍不可避免地存在許多限制[9～13]。而人類基因組圖譜的完成和新一代高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，為疾病病因的研究提供了全新的思路[14]。外顯子組序列僅占全基因組序列的1%，但大多數(shù)與疾病相關(guān)的變異位于外顯子區(qū)[15～17]，基因組定向捕獲工具的出現(xiàn)使外顯子組測(cè)序成為可能。近5年在PubMed上發(fā)表的外顯子組研究相關(guān)文章已達(dá)2 000余篇，對(duì)數(shù)百種疾病展開了深入研究，臨床診斷的文章也開始報(bào)道，可見(jiàn)利用全基因組外顯子測(cè)序(WES)尋找人類疾病的致病基因，是近年發(fā)展起來(lái)的研究疾病致病機(jī)制的重要方法之一。

1 WES應(yīng)用于臨床診斷的基本策略

WES是利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。大致分為3個(gè)步驟：①將人類基因組中所有已知的編碼蛋白質(zhì)的基因序列進(jìn)行富集，即對(duì)全基因組外顯子進(jìn)行捕獲、擴(kuò)增;富集后，待測(cè)序序列總量大幅降低，但基因信息總量卻下降不多。②應(yīng)用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)富集保留的DNA序列進(jìn)行高覆蓋深度的測(cè)序，高質(zhì)量、高通量地獲取所有基因的編碼蛋白質(zhì)區(qū)域的堿基突變信息。③通過(guò)生物信息學(xué)分析及驗(yàn)證，找到致病基因[18]。WES相對(duì)于基因組重測(cè)序成本較低，對(duì)研究已知基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)、剪接插入缺失(Indel) 等具有較大的優(yōu)勢(shì)。

以單基因疾病研究方案為例，首先需要按照疾病表型對(duì)家系成員進(jìn)行嚴(yán)格篩查，明確其患病情況。再找出該疾病已有的研究背景和相關(guān)致病基因報(bào)道，通過(guò)傳統(tǒng)PCR測(cè)序方法對(duì)已知的疾病基因相關(guān)變異進(jìn)行驗(yàn)證和初篩；確認(rèn)所研究的樣本中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的基因變異，挑選一個(gè)或數(shù)個(gè)相同疾病家系的核心成員進(jìn)行WES。每個(gè)家系中的患病個(gè)體選取3～5個(gè)樣本，正常個(gè)體選取1～2名作為對(duì)照進(jìn)行研究。按照疾病模型(常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳等)及樣品的家系信息對(duì)測(cè)序得到的結(jié)果進(jìn)行分析，縮小候選變異的范圍，經(jīng)過(guò)多種注釋、篩選后過(guò)濾對(duì)功能無(wú)影響的變異及公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的常見(jiàn)變異，再使用傳統(tǒng)PCR測(cè)序進(jìn)行樣本擴(kuò)大化驗(yàn)證及相關(guān)的功能研究，最終確定疾病相關(guān)變異。

若為散發(fā)樣本，由于樣本間沒(méi)有血緣關(guān)系，遺傳背景相差較大，測(cè)序得到的結(jié)果也較難分析。使用散發(fā)樣本進(jìn)行WES時(shí)需要更大的樣本量(>30例)，方能得到更為準(zhǔn)確和有價(jià)值的結(jié)果。對(duì)大量患病個(gè)體的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣本分析，從而確定候選疾病相關(guān)變異，再用傳統(tǒng)PCR測(cè)序在其他的相同疾病患病個(gè)體和正常人群中做進(jìn)一步驗(yàn)證。

2 WES是疾病診斷的利器

2009 年8 月，Ng等[19]通過(guò)WES從4 例Freeman-Sheldon綜合征(FSS)患者的DNA 中準(zhǔn)確找出了致病基因MYH3，首次證明了WES在確定罕見(jiàn)疾病致病基因上的應(yīng)用價(jià)值。僅1個(gè)月后，Choi等[20]運(yùn)用WES在先天性氯丟失腹瀉患者中發(fā)現(xiàn)了新的致病基因突變位點(diǎn)SLC26A3，其研究更重要的意義在于糾正了先前臨床的錯(cuò)誤診斷，凸顯出WES在發(fā)現(xiàn)新的致病基因和臨床診斷上的準(zhǔn)確性。WES正式進(jìn)入臨床則是在2011年，Worthey等[21]對(duì)1例難治性炎癥性腸病的15月齡男性患兒行WES，在X連鎖凋亡抑制基因中鑒定出一個(gè)錯(cuò)義突變，并提示臍帶血移植治療策略的可能性。這項(xiàng)研究開創(chuàng)了WES臨床診斷的先河，也為個(gè)體化醫(yī)學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者將目光投向WES的臨床實(shí)踐。尤其在罕見(jiàn)性遺傳病的研究中顯露頭角，罕見(jiàn)病多系單基因病。根據(jù)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(更新至2014年12月31日)，目前世界上報(bào)道的已知和懷疑的孟德爾遺傳病22 724種，其中確認(rèn)為孟德爾遺傳病且致病分子基礎(chǔ)已知的有4 310種，確認(rèn)為孟德爾遺傳病但分子基礎(chǔ)未知的1 678種，不確定是否為孟德爾遺傳病1 849種。單基因病的早期診斷、預(yù)防和治療，依賴于致病基因的發(fā)現(xiàn)、突變譜的鑒定及其功能研究。傳統(tǒng)的單基因病致病基因定位方法有候選基因法、定位克隆、全基因組掃描連鎖分析、物理圖譜、關(guān)聯(lián)分析和全基因組測(cè)序(WGS)等技術(shù)。然而，這些技術(shù)仍然存在難以克服的“瓶頸”，例如疾病遺傳異質(zhì)性和遺傳模式的限制，患病親屬人數(shù)有限或家系資料不完整，患者為散發(fā)性(從頭突變)等。因此，至今依然不能完全確定疾病的易感基因。

近年來(lái)，越來(lái)越多的臨床大樣本研究表明，WES開始在單基因疾病診斷中顯現(xiàn)其獨(dú)特的價(jià)值。Yang等[22]對(duì)3 386例患者行WES，830例可明確診斷，診斷率約為25%，進(jìn)一步驗(yàn)證了該研究團(tuán)隊(duì)1年前發(fā)表的250例初步報(bào)告[23]的診斷率。受試對(duì)象大多是兒童，臨床表現(xiàn)以神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主，如發(fā)育遲緩和智力障礙。其中92例(4.6%)患者可采取有效臨床干預(yù)措施。Yang等[22]認(rèn)為，由于WES對(duì)外顯子區(qū)覆蓋不完全和對(duì)變異的解釋不足等局限性，25%的分子診斷率可能是低歸因的結(jié)果。Lee等[24]對(duì)814例患者行3人家系WES(雙親與患兒)和先證者測(cè)序，其中520例(64%)是兒童，其診斷率為26%(213/814)，而在3人家系測(cè)序組診斷率高達(dá)31%(127/410)，明顯高于先證者測(cè)序組22%(74/338)的分子診斷率。3人家系WES診斷率高主要是由于對(duì)從頭突變和雜合子突變的檢測(cè)能力提高所致。

文獻(xiàn)[22,24]為WES臨床分子診斷提供了有力證據(jù)。但其結(jié)果與以12名健康成年人為受試對(duì)象探究WGS應(yīng)用價(jià)值的研究不同[25]。原因可能是：①WGS不僅能檢測(cè)蛋白編碼區(qū)的基因突變，而且還能檢測(cè)到非編碼區(qū)的突變。②文獻(xiàn)[22，24，25]驗(yàn)前概率不同：在人群中一個(gè)健康個(gè)體罹患一種罕見(jiàn)遺傳疾病的可能性非常低，而臨床試驗(yàn)研究本底人群是患者，每例患者所表現(xiàn)的臨床癥狀很可能就符合一種罕見(jiàn)遺傳疾病[26]。總體而言，已報(bào)道的WES有害突變檢出率在25%[27]～50%[28]。Atwal等[29]向北美47個(gè)臨床遺傳學(xué)檢測(cè)中心發(fā)起含8個(gè)問(wèn)題條目的電子問(wèn)卷調(diào)查，得到35份有效WES結(jié)果報(bào)告，歸納出實(shí)際只有22.8%的WES診斷成功率；如果排除可用其他替代方法明確診斷的結(jié)果，診斷成功率僅為17.1%；其中，1例還錯(cuò)誤地將良性突變?cè)\斷為致病性突變。因此，WES實(shí)際診斷成功率并不像某些臨床實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中報(bào)道的那樣高，受試人群的病種分布對(duì)其有很大影響。Atwal等[29]估計(jì)，目前WES有害突變?cè)\斷率為15%～25%。

2.1 神經(jīng)發(fā)育異常表型者診斷陽(yáng)性率高 WES對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)異常表型的診斷率普遍高于非神經(jīng)系統(tǒng)表型，顯示出其在智力障礙和發(fā)育遲緩等兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷中的不俗表現(xiàn)。以往研究顯示[30, 31]，31%(16/51)的非綜合征性智力障礙散發(fā)病例和13%(13/100)的嚴(yán)重智力障礙患者可通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)獲得特異性分子診斷。Yang等[23]得到25%的WES分子診斷率可能是建立在本底人群臨床表型分類不同的基礎(chǔ)上，因?yàn)?50例受試對(duì)象中有200例是以智力障礙為臨床特征之一。WES對(duì)于具有性神經(jīng)表型的患者(如智力障礙和發(fā)育遲緩)，分子診斷率高達(dá)33%；對(duì)于具有特殊神經(jīng)表型的患者(如運(yùn)動(dòng)障礙)，WES分子診斷率也達(dá)31%。此外，Yang等[22]在更大患者人群中也發(fā)現(xiàn)，有特殊的神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)組的診斷率高達(dá)36.1%，神經(jīng)系統(tǒng)異常組的診斷率是27.2%，神經(jīng)系統(tǒng)及其他系統(tǒng)異常組診斷率是24.6%，而非神經(jīng)系統(tǒng)異常組的診斷率僅為20.1%。在Lee等[24]的表型亞組分析中，發(fā)育遲緩的兒童3人家系WES診斷率甚至高達(dá)41%，相對(duì)于先證者測(cè)序9%的診斷率有顯著提高。但在心肌病、腫瘤傾向和性發(fā)育障礙的表型人群中，3人家系WES診斷率并沒(méi)有升高。原因可能是醫(yī)生更愿意將三人WES診斷留給具有復(fù)雜綜合征的患者，而給非綜合征患者選擇先證者測(cè)序。

WES對(duì)于急性和非急性神經(jīng)發(fā)育障礙均有較高敏感度，并且可以縮短患兒診斷時(shí)間，指導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。Soden等[32]對(duì)100個(gè)家庭的119例患有神經(jīng)發(fā)育障礙[智力障礙、全面發(fā)育遲緩和孤獨(dú)癥譜系障礙(ASD)]的兒童及其父母進(jìn)行WES或WGS，非急性發(fā)作表型神經(jīng)發(fā)育障礙患兒WES診斷率40%(34/85)，急性發(fā)作表型神經(jīng)發(fā)育障礙患兒WGS診斷率 73%(11/15)。Sarah等[32]推測(cè)采用WES可使診斷提前77個(gè)月，而采用WGS則能再提前10個(gè)月。測(cè)序分析完成后，近一半家庭的臨床診療決策發(fā)生變化，而有些患者甚至需要改變治療方式。總體花費(fèi)也低于以往的個(gè)體單個(gè)基因測(cè)序?？梢灶A(yù)見(jiàn)，以基因組為基礎(chǔ)的診斷將直接影響患有神經(jīng)發(fā)育障礙兒童的醫(yī)療服務(wù)模式。

值得注意的是，鑒于目前對(duì)通過(guò)顯性抑制或激活機(jī)制起作用的致病突變的檢測(cè)能力有限，文獻(xiàn)[33]顯示在無(wú)關(guān)的3人家系測(cè)序組之間觀察到4個(gè)新基因(COL4A3BP，PPP2R1A，PPP2R5D和PCGF2)具有相同的從頭突變。如下2種假說(shuō)可以解釋這一現(xiàn)象：①文獻(xiàn)[33]只是在成千上萬(wàn)的不同功能獲得性突變中偶然得到了結(jié)果，僅觸及事實(shí)的表面; ②由于這些特殊變異賦予了種系積極的選擇優(yōu)勢(shì)，因此存在富集現(xiàn)象[37]。評(píng)估這些假設(shè)將需要更多數(shù)據(jù)的分析。

由此可見(jiàn)，神經(jīng)發(fā)育障礙表型的患者尤其適合進(jìn)行WES臨床分子診斷，WES是發(fā)現(xiàn)及證實(shí)許多神經(jīng)發(fā)育疾病致病基因的一種高效方法。WES或WGS將有助于準(zhǔn)確描述新發(fā)疾病，顯示已知疾病不典型或未完全表現(xiàn)出來(lái)的表型，并幫助識(shí)別共患病。

2.2 能夠發(fā)現(xiàn)單基因病的復(fù)雜表現(xiàn) 文獻(xiàn)[23]發(fā)現(xiàn)，有4例患者存在一種突變基因?qū)?yīng)≥2種疾病狀態(tài)的現(xiàn)象。純合子突變引起常染色體隱性遺傳的分子機(jī)制也多有涉及：59例突變基因分別遺傳自父系和母系，5例源自單親二體，4例則是由雜合子點(diǎn)突變和大范圍拷貝數(shù)變異(CNVs)的缺失引起。值得注意的是，常染色體隱性遺傳模式在獲得診斷的患者中所占比例較大(34.3%)，這與文獻(xiàn)[30]報(bào)道不符，100例智力障礙患者WES分子診斷16例，僅有1例是常染色隱性遺傳(6.3%)。文獻(xiàn)[22]遺傳模式分析表明，23例患者(4.6%)是由2個(gè)基因缺陷引起的混合表型。文獻(xiàn)[33]在17例患兒中鑒定出2個(gè)不同基因，均與致病突變有關(guān)，從而導(dǎo)致復(fù)合臨床表型。由此可見(jiàn)，WES能夠發(fā)現(xiàn)單基因病的復(fù)雜表現(xiàn)，隨著其在臨床上的廣泛應(yīng)用，具有疊加癥狀和混雜表型的患者的診斷將不再困難。

2.3 對(duì)嵌合體的診斷優(yōu)勢(shì)明顯 如果測(cè)序深度高且尋找變異的工具足夠敏感，單核苷酸鏈的單獨(dú)序列分析能夠準(zhǔn)確檢測(cè)嵌合體[39～41]。嵌合體即患者體內(nèi)僅有一小部分細(xì)胞攜帶突變基因，常是嚴(yán)重早發(fā)性疾病的潛在原因，如Cornelia de Lange綜合征(CDLS)[42]。CDLS是一種以特殊面容、智力障礙和發(fā)育遲緩為特點(diǎn)的多系統(tǒng)疾病。大多數(shù)典型CDLS患者在NIPBL有功能喪失性新生雜合突變且嵌合體比例較高。而聯(lián)合SMC1A、SMC3、HDAC8和RAD21的突變則引起不典型CDLS。Ansari等[43]分別對(duì)163、90和19例患者行已知基因編碼區(qū)的突變、基因重排和NIPBL上深度內(nèi)含子變異檢測(cè)，另外對(duì)5例行WES，發(fā)現(xiàn)致病突變被確定在：NIPBL46(嵌合體3，28.2%)；SMC1A5(嵌合體1，3.1%)；SMC35(嵌合體1，3.1%)；HDAC86(嵌合體0，3.6%)；RAD211(嵌合體0，0.6%)。在ANKRD11上鑒定出3個(gè)從頭突變且與KBG綜合征表型重疊。為估計(jì)未發(fā)現(xiàn)的嵌合體例數(shù)，文獻(xiàn)[43]使用遞歸分區(qū)來(lái)識(shí)別NIPBL陽(yáng)性亞組的不同特點(diǎn)。依據(jù)這些特點(diǎn)對(duì)突變陰性組過(guò)濾，至少有18%被劃為“NIPBL樣”變異。

Fitzgerald等[33]對(duì)1 009例患兒和1 013例對(duì)照做外顯子組為重點(diǎn)的陣列比較基因組雜交(外顯子組-aCGH)，1 006例行全基因組基因分型，識(shí)別缺失、重復(fù)、單親二體和嵌合體。從WES和外顯子組-aCGH的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，每例患兒平均有19 811個(gè)編碼或拼接的單核苷酸變異(SNVs)、491個(gè)編碼或indels和148個(gè)CNVs。從基因分型陣列的數(shù)據(jù)[44]分析，文獻(xiàn)[33]確定了5例患兒是嵌合的大型染色體重排。文獻(xiàn)[22]2 000例患者的遺傳模式分析表明，280例是常染色體顯性遺傳(53.1%)，在顯性突變中，有208個(gè)(87%)是從頭突變，其中有5個(gè)已證明是嵌合體。由此可見(jiàn)，WES可以檢測(cè)到低水平的嵌合體，并能更好地估計(jì)突變細(xì)胞的比例[45～48]。

Petersen等[49]為了明確體細(xì)胞突變是否在Crohn病(CD)的發(fā)病中起重要作用，對(duì)兩組同卵雙胞胎的腸和血液樣本進(jìn)行WES和WGS，目的是在患病雙胞胎中鑒定出候選的新CD易感基因位點(diǎn)。研究表明，體細(xì)胞嵌合體似乎并沒(méi)有在CD同卵雙胞胎患者的不一致性中發(fā)揮重要作用。但這是首次對(duì)CD雙胞胎行WGS，因此為今后的研究提供了一個(gè)有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)集和嵌合體檢測(cè)的框架。

2.4 可以發(fā)現(xiàn)新的致病基因 WES是一個(gè)及時(shí)更新疾病基因的合適平臺(tái)。3 386例大樣本研究中近30%的診斷基于過(guò)去3年內(nèi)所確定的致病基因。在504例樣本中發(fā)現(xiàn)了708個(gè)候選致病突變，58%的變異未報(bào)道過(guò)，且除WES外，尚無(wú)其他可用的基因檢測(cè)技術(shù)來(lái)發(fā)現(xiàn)這些未知基因突變[22]。值得注意的是，大部分未診斷病例很可能是由于新致病基因未被發(fā)現(xiàn)所致，對(duì)疾病相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)的定期監(jiān)測(cè)將有助于提高診斷率[50]。de Ligt等[30]研究發(fā)現(xiàn)了24個(gè)有關(guān)智力障礙的從頭突變候選基因，其中3個(gè)基因的致病作用已被證實(shí); 每1個(gè)病例中，攜帶有同一基因突變的患者間觀察到顯著的表型重疊現(xiàn)象，所發(fā)現(xiàn)的DYNC1H1、GATAD2B和CTNNB1是引起智力障礙的新基因，WES可以作為診斷原因不明的嚴(yán)重智力障礙患者的有效方法; 針對(duì)他們所研究的病例，WES診斷率達(dá)到16%。隨著方法技術(shù)的改進(jìn)以及更多智力障礙相關(guān)基因的鑒定，WES診斷率可能還會(huì)提高。此外，針對(duì)覆蓋率低的外顯子區(qū)，新的靶向捕獲試劑正在研發(fā)中，以彌補(bǔ)目前對(duì)已知疾病基因測(cè)序的不足。

WES對(duì)新致病基因的發(fā)現(xiàn)，為罕見(jiàn)復(fù)雜疾病和難診斷疾病的臨床處理提供了解決之道。由于多變的外顯率、非特異性臨床表型或病理學(xué)特征，阻礙了Ⅳ型膠原相關(guān)腎病的診斷。Lin等[58]對(duì)3個(gè)伴有原因不明的遺傳性腎病家庭行WES，分別鑒定出2個(gè)新的和已知的COL4A3/COL4A4/COL4A5致病突變[59～61]。WES為非典型腎病的診斷困境提供了解決之道，同時(shí)也使恰當(dāng)?shù)募膊∽稍兒椭委熃ㄗh成為可能。FOXP3突變被認(rèn)為是IPEX樣綜合征(immune，dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome)的主要病因，但大型隊(duì)列研究表明，有>50%的患者未檢測(cè)到FOXP3突變[62]，這為臨床提高IPEX樣綜合征的診斷準(zhǔn)確性帶來(lái)了難題。Charbonnier等[63]試圖確定特發(fā)性IPEX樣綜合征患者除FOXP3突變以外的遺傳異常，對(duì)3個(gè)家系進(jìn)行了WES，并行有針對(duì)性的靶基因測(cè)序和表型功能分析，結(jié)果顯示：LRBA基因缺陷是IPEX樣綜合征和Treg細(xì)胞缺乏癥的新的致病原因[64～66]。此外，在Yang等[23]的研究中，4例經(jīng)WES診斷為Noonan綜合征，其中3例臨床表現(xiàn)不典型；1例表現(xiàn)典型，但基因panel序列分析未發(fā)現(xiàn)致病基因，經(jīng)WES后發(fā)現(xiàn)基因CBL上存在有害突變，而此基因未被囊括入panel的新基因。WES不僅可鑒別出新的有害突變，擴(kuò)充致病基因備選庫(kù)，而且還能診斷出更多臨床表現(xiàn)不典型的常見(jiàn)遺傳病，完善疾病表型譜。

基于WES技術(shù)的研究設(shè)計(jì)為鑒定遺傳性缺失(missing heritability)提供了新的研究策略[67～69]， WES的數(shù)據(jù)分析可能是一種具有高成本效益的方式，在探索罕見(jiàn)復(fù)雜疾病的功能變異和病因?qū)W研究中發(fā)揮重要作用[70]。

值得注意的是，WES發(fā)現(xiàn)的新致病突變有助于進(jìn)一步劃分疾病分子亞型，指導(dǎo)臨床靶向治療。前列腺癌中常見(jiàn)的基因變異包括NKX3.1和PTEN的缺失，雄激素受體基因(AR)的重復(fù)，ETS家族轉(zhuǎn)錄因子基因和雄激素敏感的啟動(dòng)子序列融合等。以往觀點(diǎn)認(rèn)為頻發(fā)體細(xì)胞堿基對(duì)替換較小影響前列腺的腫瘤發(fā)生過(guò)程[71, 72]，但這種觀點(diǎn)尚未經(jīng)大型隊(duì)列研究證實(shí)。Barbieri等[73]對(duì)112對(duì)前列腺腫瘤/正常組織進(jìn)行WES，在多個(gè)基因中鑒定出新的頻發(fā)突變，包括MED12和FOXA1。SPOP是突變最頻繁的基因[74, 75]，有6%～15%的腫瘤組織基因突變涉及SPOP底物結(jié)合部位的保守殘端[76]。SPOP突變的前列腺癌缺乏ETS重排，并表現(xiàn)出一種獨(dú)特的基因組改變模式。WES測(cè)序結(jié)果的SPOP突變可能定義一種新的前列腺癌分子亞型。今后，這一不斷擴(kuò)充的遺傳構(gòu)架會(huì)使腫瘤的致癌機(jī)制更加明確，有助于疾病建模和患者分層治療。對(duì)前列腺癌的基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組的系統(tǒng)性綜合分析，能夠進(jìn)一步闡明疾病生物學(xué)背后的遺傳變化，并針對(duì)異質(zhì)性惡性腫瘤的遺傳傾向予靶向治療。

由此可見(jiàn)，WES對(duì)新致病基因的發(fā)現(xiàn)可能提供病因?qū)W研究的新思路。許多研究為不同人類疾病之間的相關(guān)性提供了證據(jù)，包括孟德爾遺傳病和復(fù)雜疾病[77～79]、復(fù)雜疾病之間的相關(guān)性[80]。因此，是否可以提出這樣的假設(shè)：引起類似臨床表型的基因，是能夠解釋疾病易感性的、有參考價(jià)值的候選基因。此外，對(duì)涉及這些已知基因的特定細(xì)胞通路或網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行綜合分析[81, 82]，判斷其在患者體內(nèi)中是否發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能突變，可以為選擇候選基因中的優(yōu)先考慮基因提供線索。這種方法已在ASD[83]的研究中得到證實(shí)，相信在基于WES的研究中也會(huì)發(fā)揮作用。另外，組合多種預(yù)測(cè)工具并產(chǎn)生一致性評(píng)估得分的方法，已證實(shí)有更突出的結(jié)果[84, 85]。然而，這些不同的工具或評(píng)估得分常常來(lái)源或應(yīng)用于評(píng)價(jià)特定的數(shù)據(jù)集，建立一個(gè)全面評(píng)估敏感度和特異度的無(wú)偏倚“金標(biāo)準(zhǔn)”數(shù)據(jù)集是必要的[57]。

如果WES研究設(shè)計(jì)能以適當(dāng)?shù)姆绞奖粦?yīng)用，將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多復(fù)雜疾病的新易感基因罕見(jiàn)突變。高質(zhì)量和高可信度的大型參考數(shù)據(jù)集將會(huì)提高WES研究設(shè)計(jì)的可行性。包括外顯子組芯片在內(nèi)的其他技術(shù)的發(fā)展，也在努力為罕見(jiàn)突變的功能注釋提供更好的參考數(shù)據(jù)庫(kù)。隨著進(jìn)一步的大規(guī)模合作，基于病例對(duì)照設(shè)計(jì)的WES研究可能會(huì)更加具有可行性。此外，檢測(cè)新易感基因罕見(jiàn)突變也需要統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)工具的進(jìn)步。在闡明復(fù)雜性狀中罕見(jiàn)編碼突變的病因?qū)W作用后，將有必要使用WGS技術(shù)對(duì)非編碼突變的作用做進(jìn)一步探討。合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)分析工具正在積極研發(fā)中[86, 87]，這對(duì)于復(fù)雜疾病遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)至關(guān)重要。而其他探索突變基因功能性和改進(jìn)功能分析策略的研究，也會(huì)使對(duì)易感性突變的生物學(xué)意義有更深刻的了解[88]。其他數(shù)據(jù)類型，包括表觀遺傳變異、mRNA表達(dá)水平和體細(xì)胞遺傳變異等，對(duì)考慮優(yōu)先候選基因是有幫助的，可以為種系遺傳變異的疾病轉(zhuǎn)化發(fā)生過(guò)程提供進(jìn)一步的深層次理解，為易感基因相關(guān)生物學(xué)意義提供合理性解釋[57]。

3 WES在兒科復(fù)雜疾病中的研究應(yīng)用

復(fù)雜疾病是在眾多因素共同作用下發(fā)生的，如多個(gè)基因、一個(gè)基因的多個(gè)突變、環(huán)境作用及未知的隨機(jī)因素。自2005 年以來(lái)，對(duì)于復(fù)雜疾病的研究，主要采用基于基因芯片的GWAS，通過(guò)比較病例與對(duì)照間SNP 的頻率差異來(lái)尋找風(fēng)險(xiǎn)變異因素。然而，目前的GWAS 只涉及復(fù)雜疾病和性狀易感基因的很少一部分，解釋的遺傳度極大地低于預(yù)期值，并且極少數(shù)SNPs被明確具有與疾病機(jī)制相關(guān)聯(lián)的功能性作用?；贏SD或精神分裂癥的測(cè)序研究，證明了對(duì)人基因組功能區(qū)域進(jìn)行深度重測(cè)序是尋找復(fù)雜疾病的潛在罕見(jiàn)致病突變的關(guān)鍵方法[89]?，F(xiàn)從兒科疾病的角度出發(fā)，主要介紹WES在ASD和先天性心臟病(CHD)中的臨床研究現(xiàn)況。

3.1 ASD ASD是一種高度遺傳的神經(jīng)發(fā)育紊亂，臨床表現(xiàn)以受損的社會(huì)互動(dòng)和交流缺陷，受限制的重復(fù)行為為特征[90]。對(duì)有ASD患者的家族進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，兒童ASD同胞患病率為2%～8%，是一般人群發(fā)病率的50～200倍。雙生子研究則顯示，同卵雙生的同病一致率為60%，異卵雙生的同病一致率為0。這些證據(jù)證明遺傳因素是兒童ASD發(fā)病的重要原因。目前的研究對(duì)于候選基因的數(shù)目和界定仍不清楚，對(duì)存在1例以上ASD患者的家族進(jìn)行的全基因組分析，估計(jì)該病至少是10個(gè)以上致病基因相互作用的結(jié)果。

隨著基因組學(xué)研究和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)已經(jīng)成為ASD近幾年主流的研究方向，每年均有新的ASD相關(guān)候選基因被報(bào)道。但由于ASD相關(guān)突變非常多樣，很難建立清晰的遺傳模式。大規(guī)模平行DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)了許多與ASD相關(guān)的罕見(jiàn)SNVs和微小indels變異。已證實(shí)WES對(duì)于檢測(cè)ASD中的從頭變異(DNVs)具有獨(dú)特價(jià)值[85,91～93]。WES相關(guān)研究已經(jīng)闡明了罕見(jiàn)遺傳性變異(IVs)的作用，如罕見(jiàn)基因缺失(遺傳性功能喪失的純合子，男性復(fù)合雜合子或X染色體變異)[94]、隱性純合子[95]、雙等位基因變異[96]和多家系變異共遺傳[97]。Chahrour等[95]對(duì)163個(gè)中東地區(qū)的ASD家庭進(jìn)行WES，發(fā)現(xiàn)在基因AMT、PEX7、SYNE1、VPS13B、PAH和POMGNT1上都存在雙等位基因突變，此后他們又分析了612個(gè)美國(guó)ASD家庭的WES數(shù)據(jù)，得到了相同的發(fā)現(xiàn)[96]。這些基因大多與一些代謝或遺傳學(xué)綜合征有關(guān)，相關(guān)隱性突變影響比較輕微，使蛋白部分喪失功能。Lim等[94]對(duì)933例ASD患者的基因組和869例對(duì)照進(jìn)行了WES，以檢測(cè)使基因功能完全喪失的隱性突變。文獻(xiàn)[94，95]研究相互補(bǔ)充，共同說(shuō)明了隱性突變對(duì)ASD的重要性。最近，WGS也已鑒定出與非編碼DNA相關(guān)的罕見(jiàn)遺傳變異和影響基因剪接的變異[98,99]。由此可見(jiàn)，成百上千的罕見(jiàn)遺傳變異可以影響與ASD相關(guān)的多種生物學(xué)功能[100]，而以WES為代表的新一代測(cè)序技術(shù)或許可以成為解開ASD遺傳迷霧的突破口。

WES不僅在識(shí)別ASD相關(guān)致病突變方面作用突顯，而且以此為基礎(chǔ)推動(dòng)了ASD發(fā)生機(jī)制的研究。Willsey等[101]指出了9個(gè)高可信度ASD風(fēng)險(xiǎn)基因的功能作用，然后發(fā)現(xiàn)所有基因都在胎兒發(fā)育的特定時(shí)間集中在大腦一個(gè)特定場(chǎng)所的一個(gè)單細(xì)胞類型。De Rubies等[102]和Iossifov等[103]共同合作的2項(xiàng)研究通過(guò)WES發(fā)現(xiàn)了100多個(gè)ASD相關(guān)基因突變，大多數(shù)都是從頭突變，其中60個(gè)基因突變有超過(guò)90%的概率引發(fā)ASD風(fēng)險(xiǎn)。上述研究表明，這些基因中的罕見(jiàn)突變可影響中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。An等[104]利用“AXAS”基因網(wǎng)絡(luò)模型分析從澳大利亞ASD隊(duì)列中得到的WES數(shù)據(jù)，該模型描述了在ASD、X-連鎖智力障礙、注意缺陷多動(dòng)障礙和精神分裂癥中所占比例過(guò)高的異質(zhì)性DNA變異的功能模式。一種優(yōu)化的DNA變異篩選流程被用來(lái)確定功能缺失的DNA變異。該研究還發(fā)現(xiàn)，來(lái)自于父母表型更廣泛的可遺傳變異和從頭變異與ASD有顯著聯(lián)系。分析表明，假定罕見(jiàn)致病變異集中位于關(guān)鍵神經(jīng)生物學(xué)過(guò)程中的集群和比例大，并且在涉及神經(jīng)元發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和突觸發(fā)育等功能環(huán)節(jié)占比過(guò)高。這些研究結(jié)果同時(shí)證實(shí)，增加ASD風(fēng)險(xiǎn)的不是突變基因的規(guī)模，而是突變基因的位置。這些基因突變或許會(huì)導(dǎo)致ASD的風(fēng)險(xiǎn)增加5～20倍。Chang等[105]對(duì)數(shù)百名患者和近1 000個(gè)基因進(jìn)行大型分析發(fā)現(xiàn)，ASD癥狀的多樣性可以追溯到患者基因突變的差異，包括特定基因突變和突變的嚴(yán)重程度，提示可以根據(jù)基因型與表型的關(guān)系利用患者的遺傳圖譜，開發(fā)精確的診斷和預(yù)后工具，甚至引導(dǎo)個(gè)性化治療。

3.2 CHD 是人類最常見(jiàn)的出生缺陷,在所有活產(chǎn)兒中發(fā)病率約為1%[106, 107]。大多數(shù)CHD是遺傳因素與環(huán)境相互作用的結(jié)果[108]。約30%的心臟畸形是綜合征性的疾病，如唐氏綜合征、22q11.2缺失綜合征和Holt-Oram綜合征[109, 110]；然而大多數(shù)CHD并不遵循孟德爾遺傳[111]。

過(guò)去10年常采用經(jīng)典連鎖分析或候選基因法探究CHD等家族性疾病的遺傳背景，而這些研究數(shù)據(jù)大多建立在模式生物(如基因敲除小鼠)的基礎(chǔ)上[112, 113]；染色體畸變(包括CNVs)則通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)分析(如熒光原位雜交FISH等)鑒定[114, 115]；比較基因組雜交(aCGH)為篩選亞顯微水平染色體不平衡提供了更高的分辨率。利用aCGH的首次在CHD的研究表明，約17%的CHD患者具有潛在致病的罕見(jiàn)染色體畸變[116, 117]。全基因組SNP陣列已被用來(lái)確定散發(fā)CHD病例中的拷貝數(shù)變化[118～120]。為了找到與復(fù)雜疾病相關(guān)的SNPs，GWAS已在數(shù)百到數(shù)千人的大型隊(duì)列研究中展開[121]。相關(guān)技術(shù)方法也在其他研究中得到證實(shí)[122, 123]?？傊鲜黾夹g(shù)方法為探索CHD的遺傳學(xué)基礎(chǔ)展現(xiàn)了很好的前景。但仍然有很大比例的心臟畸形不能確定遺傳病因。

二代測(cè)序技術(shù)則是目前進(jìn)一步闡明CHD遺傳背景的有效新方法。例如，Dorn等[124]針對(duì)CHD提出了一個(gè)高通量測(cè)序設(shè)計(jì)和分析路線圖，也適用于其他復(fù)雜疾病。WES、高分辨率熔煉分析和直接DNA測(cè)序的聯(lián)合應(yīng)用確定了一個(gè)家族異質(zhì)性CHD可能的致病突變基因[125]。應(yīng)用WES可以識(shí)別出患有先天性心臟病的內(nèi)臟異位患者SHROOM3上存在錯(cuò)義突變[126]。NGS使大型隊(duì)列中的成千上萬(wàn)個(gè)基因甚至整個(gè)基因組實(shí)現(xiàn)了同時(shí)分析。與微陣列不同，NGS不依賴于DNA雜交預(yù)選探針，這有利于在單堿基分辨率上鑒定新變異，這也預(yù)示著新疾病基因網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)。不過(guò)，由于大量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，要鑒定真正的疾病相關(guān)基因是非常復(fù)雜的。大規(guī)模人口研究表明，可以在任何健康個(gè)體中觀察到大量潛在的致病變異[127～129]。NGS的運(yùn)用還發(fā)現(xiàn)，一些致病突變?cè)诮】祩€(gè)體和個(gè)別情況下可以被耐受，盡管發(fā)生頻率極低。因此，新測(cè)序方法應(yīng)用到類似CHD的復(fù)雜疾病分析時(shí)仍然具有挑戰(zhàn)性。

WES與其他技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可彌補(bǔ)其在檢測(cè)罕見(jiàn)CNVs上的不足，提高對(duì)CHD等復(fù)雜疾病的應(yīng)用價(jià)值。Glessner等[125]對(duì)538例CHD患者和1 301名健康對(duì)照采用全基因組SNP微陣列和WES，研究新發(fā)CNVs在散發(fā)CHD發(fā)病中的致病作用；這2種互補(bǔ)的高分辨率技術(shù)從51 例CHD患者中鑒定出63個(gè)新發(fā)CNV，證明CHD患者罕見(jiàn)新發(fā)CNV出現(xiàn)頻率顯著增高：SNP陣列[P=7×10(-5)；比值比4.6]或WES[P=6×10(-4)；比值比3.5]；而除去16%曾被報(bào)告為致病性新發(fā)CNV位點(diǎn)后，CNV出現(xiàn)頻率仍保持較高水平(P=0.02后，比值比為2.7)；在15q11.2上的CYFIP1、NIPA1和NIPA2上還檢測(cè)到頻發(fā)新發(fā)CNV，在DUSP1、JUN、JUP、MED15、MED9、PTPRE、SREBF1、TOP2A和ZEB2上檢測(cè)到單個(gè)新發(fā)CNV，均與已知的CHD蛋白NKX2- 5和GATA4存在相互作用；還發(fā)現(xiàn)ETS1的11q24.2-25缺失引發(fā)Jacobsen綜合征，CTBP2是10q端粒缺失的致病基因。

房間隔缺損是CHD最常見(jiàn)的缺陷之一。過(guò)去研究表明，轉(zhuǎn)錄因子T-box 20突變(TBX20)是先天性房間隔缺損的病因之一。Liu等[126]采用WES聯(lián)合CHD相關(guān)基因過(guò)濾檢測(cè)1家3代的房間隔缺損患者，發(fā)現(xiàn)1種新型TBX20突變，c.526G> A(p.D176N)。生物信息學(xué)程序(SIFT，Polyphen2和MutationTaster)預(yù)測(cè)這種突變是有害的。此突變以前并沒(méi)有包括在SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP)或國(guó)家心臟、肺和血液研究所(NHLBI)WES計(jì)劃(ESP)的數(shù)據(jù)中。Liu等發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了TBX20突變譜，證明了TBX20在心臟發(fā)育中起著重要作用，也為小家系CHD的遺傳研究提供了一個(gè)性價(jià)比較高的新分析策略。Greenway等[130]對(duì)1個(gè)常染色體顯性遺傳隔離繼發(fā)孔型房間隔缺損高發(fā)的家系進(jìn)行WES，此前候選基因測(cè)序和連鎖分析均無(wú)結(jié)果。2例患者鑒定出44個(gè)罕見(jiàn)共同變異，包括在α-心肌肌動(dòng)蛋白(ACTC1)中的非同義突變(c.532A> T，p.M178L，NM_005159.4)；而1 834名對(duì)照、千人基因組和ESP的均無(wú)此突變，p.M178L也是唯一1個(gè)從家系中分離得到的罕見(jiàn)基因突變。Greenway等[130]的研究為ACTC1突變?cè)诜块g隔缺損中的致病作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)支持，而大規(guī)模平行WES也使檢測(cè)CHD新罕見(jiàn)變異成為可能，不再受到候選基因法的局限。當(dāng)突變預(yù)測(cè)算法無(wú)效時(shí)，家族性疾病的研究可有助于從良性變異中區(qū)分罕見(jiàn)的致病突變，重視家族史研究也使對(duì)CHD的遺傳見(jiàn)解更加深入。

研究證明，SCN5A突變是遺傳性心律失常的潛在病因，但其與復(fù)雜重疊表型，特別是與CHD的聯(lián)系則很少報(bào)道。Tan等[131]聯(lián)合運(yùn)用WES和生物信息學(xué)的策略，在1個(gè)多代家系中鑒定出常染色體顯性心臟傳導(dǎo)疾病(CCD)的致病基因，發(fā)現(xiàn)SCN5A上存在一種新的無(wú)義突變(Y1495X)，推測(cè)該突變產(chǎn)生截短的SCN5A蛋白從而導(dǎo)致鈉電流損失，明確了SCN5A相關(guān)性心律失常的機(jī)制。由此可見(jiàn)，WES是一種對(duì)罕見(jiàn)臨床表型做遺傳分析的非常有效的方法，為臨床表現(xiàn)陰性的家屬提供了準(zhǔn)確的基因檢測(cè)信息。

利用高通量測(cè)序的大型CHD隊(duì)列研究有望更好地了解疾病潛在的復(fù)雜遺傳學(xué)基礎(chǔ)。兒童心臟基因組協(xié)會(huì)建立的CHD遺傳網(wǎng)絡(luò)，納入3 700例各種類型的CHD，旨在探討CHD患者遺傳因素、臨床特點(diǎn)和結(jié)局之間的關(guān)系。正在進(jìn)行的研究包括對(duì)心臟組織樣品分別運(yùn)用WGS和RNA測(cè)序以實(shí)現(xiàn)CNV的識(shí)別，候選基因的重排及體細(xì)胞突變和等位基因錯(cuò)誤表達(dá)的檢索[131]。Zaidi等[132]對(duì)362例患者及其父母WES從頭突變?cè)贑HD患者組蛋白修飾基因中呈明顯富集現(xiàn)象，說(shuō)明表觀遺傳調(diào)控在心臟發(fā)育中具有重要作用。威康信托基金會(huì)桑格研究所發(fā)起的解密發(fā)育障礙(DDD)研究(http://www.ddduk.org/)，從12 000例未確診的發(fā)育障礙兒童及其父母處收集臨床數(shù)據(jù)和DNA樣本，其中也包括CHD患者，使用高分辨率aCGH、SNP基因分型和WES來(lái)辨別不同疾病潛在的遺傳原因。UK10K項(xiàng)目(http://www.uk10k.org/)對(duì)125例CHD患者在其罕見(jiàn)疾病樣本組內(nèi)進(jìn)行WES。后2項(xiàng)研究仍在進(jìn)行中，尚未公布CHD的相關(guān)研究結(jié)果。

WES能更好地理解各種綜合征和非綜合征性CHD的遺傳基礎(chǔ)[133]，但是這些研究能闡明機(jī)制的病例比例仍然很小。例如，罕見(jiàn)CNVs能解釋5%～20%篩選過(guò)的CHD，WES僅能解讀10%散發(fā)重癥CHD病例的從頭突變[132,134]。

Blue等[135]研究利用16個(gè)有明確CHD病史的家系所組成的隊(duì)列篩選出57個(gè)候選基因的靶向panel，將測(cè)序結(jié)果分別與15個(gè)健康對(duì)照、1000WGS計(jì)劃和全外顯子組測(cè)序計(jì)劃中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，31%(5/16)的家系鑒定出致病變異，又在這些致病突變的基礎(chǔ)上根據(jù)3個(gè)家系確定了一個(gè)可能的綜合征病因；此外，還在25%的家系中發(fā)現(xiàn)了意義不明的變異。有人認(rèn)為，此研究獲得基因診斷的疾病，可能僅需臨床檢查就能明確，例如TFABP2突變(Char綜合征)，TBX5突變(Holt-Oram綜合征)和ELN突變(主動(dòng)脈瓣上狹窄)。然而現(xiàn)實(shí)中，許多患者的臨床表型不明顯，呈現(xiàn)出外顯率下降、多變表型增多的趨勢(shì)，阻礙了快速便捷的表型識(shí)別[136]。而Blue等[135]的研究證明了使用分子診斷能更容易地解決這一臨床現(xiàn)實(shí)，當(dāng)然還要考慮到NGS產(chǎn)生了前所未有的海量難題，而表型分型仍然是一個(gè)更費(fèi)時(shí)的過(guò)程。

從其他對(duì)復(fù)雜疾病的研究中可以推斷，僅靠WES將不能完全確定單一表型特征的CHD的遺傳基礎(chǔ)，至少與目前WES普遍能檢測(cè)出致病變異的分析范例不符。例如，Martin等[137]應(yīng)用WES到二葉主動(dòng)脈瓣(BAV)及其他心血管畸形高發(fā)的17人家系中，評(píng)估了3種常用于WES和家系連鎖分析的變異選擇策略，仍未能確定BAV的遺傳變異基礎(chǔ)，說(shuō)明假定致病變異改變編碼意義的WGS，可能不足以揭示BAV和其他復(fù)雜性狀。非編碼變異和寡基因遺傳可能是這些現(xiàn)象的原因，目前面臨的主要挑戰(zhàn)將是如何鑒別良性變異和致病突變，并研制出真正個(gè)性化的基因檢測(cè)工具。

從技術(shù)角度來(lái)看，WES已經(jīng)取代靶向基因panel，為編碼變異提供了一個(gè)無(wú)偏倚、全基因組范圍篩查的平臺(tái)。然而，其明顯優(yōu)勢(shì)依賴于耗費(fèi)巨大的數(shù)據(jù)分析。另外，WES在覆蓋深度方面遜于靶向基因panel，因?yàn)镹GS需要多個(gè)測(cè)序讀數(shù)重疊以提高可信度。因此，WES目前只建議作為當(dāng)靶向基因panel等未能取得成果時(shí)的后續(xù)篩查。隨著這些技術(shù)的日益成熟，類似Blue等[122]研究的意義在于，在不同臨床場(chǎng)景下，為不同類型CHD的基因診斷奠定基礎(chǔ)。更多的研究者開始轉(zhuǎn)變立場(chǎng)，提出應(yīng)加強(qiáng)兒科心臟病專家的職業(yè)培訓(xùn)和繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，以適應(yīng)新技術(shù)要求的知識(shí)基礎(chǔ)和操作能力。核心課程也必須迅速改變，以配合在基因組學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展步伐。

4 WES在兒童腫瘤中的研究應(yīng)用

4.1 揭示腫瘤發(fā)生機(jī)制 越來(lái)越多的研究者已認(rèn)識(shí)到WES在兒童實(shí)體腫瘤發(fā)生機(jī)制研究中的潛在價(jià)值。神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的實(shí)體腫瘤。為揭示神經(jīng)母細(xì)胞瘤的遺傳基礎(chǔ)，Sausen等[138]采用大規(guī)模并行測(cè)序的設(shè)計(jì)，分別進(jìn)行了WGS(6例)、WES(16例)、全基因組重排分析(32例)和特定基因位點(diǎn)的靶向分析(40例)，鑒定出染色質(zhì)重塑基因ARID1A和ARID1B突變(8/71，11%)，且這些變異均與早期治療失敗和存活率降低有關(guān)。根據(jù)腫瘤特異性的結(jié)構(gòu)變異，Sausen等[138]設(shè)計(jì)了鑒定血清中重排DNA片段的新方法，為微小殘留病灶的檢測(cè)和監(jiān)控提供了個(gè)性化的生物學(xué)標(biāo)志物。結(jié)果強(qiáng)調(diào)了染色質(zhì)重塑失調(diào)在兒童腫瘤發(fā)生過(guò)程中的重要影響，并為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療方案提供了新思路。

腎母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的兒童腎癌。Rakheja等[139]對(duì)44例腎母細(xì)胞瘤患兒進(jìn)行WES，發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞microRNA(miRNA)加工酶DROSHA和DICER1存在錯(cuò)義突變，并在MYCN、SMARCA4和ARID1A三個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)新突變。DICER1 RNase IIIB突變優(yōu)先干擾pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)5′-端的miRNA的加工過(guò)程，同時(shí)DROSHARNase IIIB突變從整體上通過(guò)顯性失活機(jī)制抑制miRNA的生物合成。而DROSHA和DICER1突變又共同干擾抑癌基因(TSG)miRNA的表達(dá)，包括let-7家族、MYCN、LIN28等重要調(diào)節(jié)因子和其他腎母細(xì)胞瘤的原癌基因。由此可見(jiàn)，體細(xì)胞miRNA生物合成元件的突變促使miRNA表達(dá)重編程，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。WES加快了這些新遺傳突變的發(fā)現(xiàn)速度，為腎母細(xì)胞瘤新亞型的劃分提供了病因?qū)W方面的遺傳依據(jù)，同時(shí)也為機(jī)制研究和臨床治療提供了新視角。

膠質(zhì)瘤是兒童最常見(jiàn)的腦腫瘤。為了確定高級(jí)別膠質(zhì)瘤(HGGs)其他的致病突變，F(xiàn)ontebasso等[140]對(duì)543例HGGs患者行WES，在15%的兒童HGGs中，H3K36 三甲基轉(zhuǎn)移酶(trimethyltransferase)SETD2存在突變，且該突變?cè)谌蚪M范圍均顯著(FDR=0.029)。其他的隊(duì)列研究證實(shí)，在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中未檢測(cè)到SETD2突變。SETD2是人類唯一的H3K36 三甲基轉(zhuǎn)移酶，而SETD2突變腫瘤顯示出H3K36me3水平顯著降低(P<0.001)，表明該突變是功能損害性的。此外，喪失功能的SETD2突變多發(fā)生在年齡較大的兒童和青年人，且特定出現(xiàn)在大腦皮質(zhì)的HGGs中，與H3.3 G34R/V和IDH突變的情況類似。Fontebasso等[140]研究提示，SETD2突變破壞了組蛋白H3K36位的編碼從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生，WES又從表觀遺傳學(xué)的角度為腫瘤發(fā)生機(jī)制提供了新思路。

4.2 作為分型依據(jù) 腫瘤的分型與其惡性程度有關(guān)，不同分型的腫瘤其治療方式又截然不同，預(yù)后也相差甚遠(yuǎn)。

以往基于活檢結(jié)果將髓母細(xì)胞瘤患者分為標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)兩類。Pugh等[141]根據(jù)基因表達(dá)譜和罕見(jiàn)CNVs將髓母細(xì)胞瘤分為4種分子亞型，每種亞型具有不同的生存率。他們同時(shí)對(duì)突變基因進(jìn)行功能分析，結(jié)果表明是由于少數(shù)常見(jiàn)基因調(diào)控機(jī)制受到干擾而引起髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生，這些干擾的形式在各個(gè)腫瘤中有所不同，從而進(jìn)一步揭示了腫瘤異質(zhì)性的原因。由此可見(jiàn)，不僅需要在基因組水平上對(duì)兒童腫瘤進(jìn)行分層分型，更需要明確哪些基因突變會(huì)驅(qū)動(dòng)哪種分子亞型，其機(jī)制又如何，從而實(shí)現(xiàn)基于分子分型的預(yù)后及靶向治療，提高診斷率和療效。

4.3 提示腫瘤預(yù)后 以兒童常見(jiàn)的室管膜瘤為例，目前的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)和放射，但化療效果不佳。Mack等[142]對(duì)47例后腦室管膜瘤患兒行WGS和WES，發(fā)現(xiàn)基因組突變率極低以及無(wú)顯著頻發(fā)體細(xì)胞SNVs。雖然缺乏頻發(fā)的SNVs和集中的罕見(jiàn)CNVs，但預(yù)后不良的后腦室管膜瘤表現(xiàn)出CpG島甲基化表型。CpG甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默區(qū)僅僅集中在PRC2復(fù)合體的靶基因上，而已知PRC2通過(guò)H3K27的三甲基化(H3K27me3)抑制分化基因的表達(dá)。CpG島甲基化陽(yáng)性表型的后腦室管膜瘤對(duì)靶向DNA或H3K27甲基化的體外和體內(nèi)臨床藥物有敏感性。表觀遺傳修飾位點(diǎn)也許可以作為臨床化療的首要候選靶點(diǎn)。同時(shí)，這項(xiàng)研究也提示，某些惡性腫瘤可能呈現(xiàn)遺傳學(xué)改變不顯著，而表觀遺傳學(xué)變化明顯的特點(diǎn)，而腫瘤預(yù)后可能正是與表觀遺傳學(xué)的變化息息相關(guān)。

4.4 提供治療靶點(diǎn) 越來(lái)越多的研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)，WES對(duì)新致病突變的發(fā)現(xiàn)可以為基于全基因組分析技術(shù)的治療干預(yù)措施提供潛在的新靶點(diǎn)。

盡管目前轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性兒童橫紋肌肉瘤的生存率有所提高，但患者預(yù)后情況仍然不容樂(lè)觀。橫紋肌肉瘤有2種基因表型：PAX3或PAX7融合基因型、缺乏融合基因型。Shern等[143]對(duì)147例患者進(jìn)行了WGS、WES和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，橫紋肌肉瘤的體細(xì)胞突變率總體比較低，尤其是在含有PAX3/7融合基因的腫瘤中。盡管突變率相對(duì)較低，但除了先前報(bào)道過(guò)的NRAS、KRAS、HRAS、FGFR4、PIK3CA和CTNNB1頻發(fā)突變外，還發(fā)現(xiàn)了新的FBXW7和BCOR頻發(fā)突變。此外，93%的病例檢測(cè)到受體酪氨酸激酶/RAS/PIK3CA軸突變，提示基因組學(xué)定向療法可能改善橫紋肌肉瘤患者的預(yù)后。

顱咽管瘤患者的臨床后遺癥主要來(lái)源于腫瘤浸潤(rùn)或治療干預(yù)使視交叉、垂體柄和下丘腦區(qū)域損傷，目前仍缺乏有效的診斷和治療措施。Brastianos等[144]WES研究發(fā)現(xiàn)，CTNNB1突變幾乎存在于所有的成釉質(zhì)細(xì)胞型顱咽管瘤中(11/12，92%)，而BRAF頻發(fā)突變存在于所有的乳頭狀顱咽管瘤(3/3，100%)。靶向基因分型結(jié)果與WES測(cè)序結(jié)果相吻合。CTNNB1和BRAF突變的鑒定為顱咽管瘤的分子治療提供了重要的靶向位點(diǎn)。

嬰兒肌纖維瘤病(IM)是兒童軟組織最常見(jiàn)的良性纖維瘤。Martignetti等[145]對(duì)9個(gè)不同家庭的32個(gè)全血樣本進(jìn)行WES發(fā)現(xiàn)，PDGFRB[146]和NOTCH3是導(dǎo)致IM的2個(gè)關(guān)鍵突變基因?，F(xiàn)已有藥物(如伊馬替尼和舒尼替尼)可抑制PDGFRB和NOTCH3的表達(dá)。對(duì)PDGFRB和NOTCH3通路之間聯(lián)系的進(jìn)一步研究可能會(huì)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致IM的其他突變，同時(shí)對(duì)理解腫瘤生長(zhǎng)消退機(jī)制和尋找靶向治療位點(diǎn)具有重要意義。

兒童HGGs是一種破壞性極強(qiáng)的惡性腫瘤，診斷后2年存活率<20%，由于其發(fā)生機(jī)制仍不清楚，故缺乏有效的治療措施。Wu等[147]分析了127例HGGs患兒，包括彌漫性橋腦內(nèi)膠質(zhì)瘤(DIPGs)和非腦干HGGs(NBS-HGGs)。通過(guò)WGS、WES和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)只有DIPGs(32%)的ACVR1基因檢測(cè)到頻發(fā)體細(xì)胞突變。此外，在47%的DIPGs和NBS-HGGs中，因結(jié)構(gòu)變異而產(chǎn)生的融合基因也被檢測(cè)到，40%的嬰兒NBS-HGGs病例中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體基因NTRK1、NTRK2和NTRK3頻發(fā)融合。值得注意的是，在68%、73%和59%的兒童HGGs中(包括DIPGs和NBS-HGGs)，分別發(fā)現(xiàn)受體酪氨酸激酶-RAS-PI3K信號(hào)通路、組蛋白修飾或染色質(zhì)重塑過(guò)程、以及細(xì)胞周期調(diào)控通路上都存在靶向突變。某些特定或共同的細(xì)胞信號(hào)通路內(nèi)基因位點(diǎn)的突變與兒童HGG有關(guān)，提示基于這些位點(diǎn)的靶向治療具有研究的價(jià)值。

骨肉瘤是兒童最常見(jiàn)的原發(fā)性骨腫瘤，但30年間其治療或生存率均無(wú)實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。Perry等[148]對(duì)59例患兒進(jìn)行WES、WGS和RNA測(cè)序，只有TP53基因在所有樣品中有顯著突變頻率。鑒于腫瘤異質(zhì)性、基因組不穩(wěn)定性及大樣本獲取難度，該研究利用通路分析、shRNA篩選等方法發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞系對(duì)PI3K/mTOR通路的抑制劑敏感。僅僅找到基因突變位點(diǎn)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還需要了解突變基因引起細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤信號(hào)傳達(dá)的機(jī)制，并利用藥物測(cè)試和建立模式動(dòng)物研究模型[149]，才能夠?yàn)閮和[瘤的靶向治療提供更充分的遺傳研究基礎(chǔ)。

5 WES的應(yīng)用局限性

Lee等[24]對(duì)WES在實(shí)際臨床研究中的局限性作了總結(jié)。①鑒于3人家系WES診斷的高額費(fèi)用和在無(wú)癥狀父母中檢出陽(yáng)性的可能性，臨床醫(yī)生可能不會(huì)選擇此種方法。②非隨機(jī)化分組使未觀察到的混雜因素可能影響診斷率。③WES并不能發(fā)現(xiàn)所有具有潛在因果關(guān)系的基因突變型，可能出現(xiàn)嚴(yán)重遺漏，如病理性重復(fù)擴(kuò)增(見(jiàn)于脊髓小腦共濟(jì)失調(diào))和大多數(shù)罕見(jiàn)CNVs。④WES也不能取樣所有的蛋白編碼堿基，平均序列覆蓋率有限。⑤3人家系WES診斷對(duì)表型數(shù)據(jù)和變異型兩者之間聯(lián)系的解釋分析能力上還有待進(jìn)一步提高。

自美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)(ACMG)公布偶然發(fā)現(xiàn)的相關(guān)指南后，如何報(bào)告WES中預(yù)期外發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題便引起人們的極大關(guān)注[27, 150～153]。ACMG建議，當(dāng)基于臨床目的對(duì)兒童或成人開展WGS或WES時(shí)，應(yīng)當(dāng)評(píng)估與24種遺傳疾病相關(guān)的56個(gè)基因[154]。然而WES往往不能產(chǎn)生高質(zhì)量的結(jié)果而錯(cuò)過(guò)特定基因中的變異。為此，研究人員調(diào)查了56個(gè)ACMG基因中突變的假陰性率[153]。對(duì)44個(gè)外顯子組數(shù)據(jù)集進(jìn)行了回顧性分析，這些數(shù)據(jù)來(lái)自4個(gè)不同的外顯子組捕獲試劑盒和2個(gè)測(cè)序平臺(tái)。研究人員還研究了WES檢測(cè)56個(gè)ACMG基因中相關(guān)突變的能力。總體而言，這4種外顯子組方法的覆蓋度都不足。在每種外顯子組方法中，至少有1個(gè)基因錯(cuò)過(guò)了40%以上的致病基因變異；最差的有4個(gè)基因錯(cuò)過(guò)了>90%的變異。現(xiàn)有的測(cè)序試劑盒有較高的假陰性率。必須強(qiáng)調(diào)的是，當(dāng)臨床外顯子組分析沒(méi)有報(bào)告致病的基因變異，可能是因?yàn)樽儺愃诘膮^(qū)域沒(méi)有被分析，而不是患者的DNA中沒(méi)有致病變異。因此，如果外顯子組無(wú)法獲得預(yù)期的表現(xiàn)，則應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步使用疾病特異的靶向基因panel。產(chǎn)生足夠大量的序列數(shù)據(jù)，以實(shí)現(xiàn)最佳的覆蓋度。

綜上所述,由于WES是將全基因組外顯子區(qū)域DNA富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法，其對(duì)基因組信息的解讀可能出現(xiàn)以下重要遺漏：①在染色體末端重復(fù)區(qū)域內(nèi)的外顯子不能被檢測(cè)到；②無(wú)法發(fā)現(xiàn)線粒體基因中的突變；③忽略染色體結(jié)構(gòu)變異，如易位或倒位；④無(wú)法有效診斷三堿基突變疾病，如Huntington's病和脆性X綜合征；⑤無(wú)法發(fā)現(xiàn)其他罕見(jiàn)CNVs；⑥內(nèi)含子中的致病突變會(huì)被WES忽略；⑦無(wú)法發(fā)現(xiàn)單親二倍體；⑧無(wú)法發(fā)現(xiàn)調(diào)控序列的DNA變異；⑨無(wú)法檢測(cè)基因之間是否有相互作用；⑩無(wú)法解讀表觀遺傳學(xué)改變。

6 WES的相關(guān)倫理問(wèn)題

目前在遺傳學(xué)者中已達(dá)成這樣一種共識(shí)：WGS和WES的廣泛應(yīng)用不僅是大勢(shì)所趨，而且將大有益處[155]。但是，由于其較以前的基因檢測(cè)相比定位精確度有所下降，對(duì)于在測(cè)序過(guò)程中可能出現(xiàn)的重要臨床發(fā)現(xiàn)應(yīng)如何處理，引發(fā)了道德辯論。測(cè)序的結(jié)果可能被指定為有科學(xué)意義，也可能恰恰相反。科學(xué)意義的結(jié)果是指那些有統(tǒng)計(jì)證據(jù)證明的基因型(遺傳變異)與一個(gè)特定表型(例如，疾病的癥狀或危險(xiǎn)因素)之間有相互關(guān)系的變異。如果沒(méi)有足夠的證據(jù)來(lái)支持這種關(guān)系，那么這種變異叫做“不確定意義變異”(VUS)。VUS并不一定意味著基因型-表型之間的關(guān)系不存在，而是表示當(dāng)前沒(méi)有該人群足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)來(lái)證實(shí)這個(gè)結(jié)果。WGS產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，許多觀察到的變異都只有不確定的意義，需要進(jìn)一步的臨床研究來(lái)確定其意義，這也使反饋研究參與者更多個(gè)人信息的行為成為收集更多數(shù)據(jù)的必要(例如，從其他家庭成員采集更多的生物樣本和表型數(shù)據(jù))。Hallowell等[156]認(rèn)為，拋開這些發(fā)現(xiàn)是有意為之或是偶然出現(xiàn)，如何處理WES和WGS研究的倫理問(wèn)題也受到臨床或科學(xué)研究背景的影響。Hallowell等[156]還呼吁，增加樣品采集目的的透明度，更加明確科學(xué)研究與臨床背景轉(zhuǎn)換的議程，落實(shí)患者和研究參與者對(duì)于偶發(fā)問(wèn)題及其影響的知情權(quán)，并曉之以必要的應(yīng)對(duì)措施。

2014年1月，Illumina公司宣布可在不超過(guò)1 d的時(shí)間內(nèi)，以1 000美元的夢(mèng)幻價(jià)格完成對(duì)1個(gè)人的WGS，測(cè)序價(jià)格的急劇下降無(wú)疑極大提高了新一代測(cè)序的可行性。雖然從技術(shù)上來(lái)說(shuō)測(cè)序一個(gè)基因組和獲得原始數(shù)據(jù)的成本急劇下降，WGS的總體成本，包括數(shù)據(jù)的安全儲(chǔ)存、解讀和處理，目前還不清楚。文獻(xiàn)[155]對(duì)WGS的成本計(jì)算進(jìn)行了回顧分析，發(fā)現(xiàn)如果考慮到分析數(shù)據(jù)和結(jié)果處理時(shí)需要的專家團(tuán)隊(duì)，就必須認(rèn)真考慮“1 000美元的基因組”和“100 000美元的分析”。此外，為讓臨床醫(yī)生正確解讀WGS結(jié)果而必需的一般背景知識(shí)培訓(xùn)目前還很缺乏[1]。遺傳咨詢面臨的困境在于，向患者解釋技術(shù)的本質(zhì)和結(jié)果需要大量的時(shí)間，而且實(shí)際上如何傳達(dá)信息以讓他們更好地理解也是難題所在。目前大多數(shù)已構(gòu)建的引導(dǎo)生物醫(yī)學(xué)研究和診斷實(shí)踐的倫理框架并非專為NGS的應(yīng)用而設(shè)計(jì)[157, 158]，因此這些框架可能需要重新闡釋和修正。

6.1 知情同意 知情同意實(shí)施過(guò)程中常存在以下問(wèn)題：①需告知的信息量超載或信息內(nèi)容過(guò)于復(fù)雜；②患者及家屬對(duì)信息的理解和記憶能力有限；③醫(yī)患雙方間存在信息理解偏差和虛假希望。這些都有可能使WGS實(shí)施時(shí)知情同意過(guò)程變得更加復(fù)雜[157, 159, 160]。以下問(wèn)題尤其需要關(guān)注：知情同意過(guò)程中哪些信息需要收錄、知情同意應(yīng)如何實(shí)現(xiàn)以及是否可以保留在遺傳學(xué)研究中習(xí)慣使用的觀念等[161]。主要關(guān)注理由之一是最終分析結(jié)果的高度不確定性。首先，這種不確定性一方面會(huì)造成期望結(jié)果的益處和風(fēng)險(xiǎn)因素的不平衡，例如得到不希望得到的信息、丟失隱私權(quán)和虛假期望；另一方面，對(duì)突變意義的錯(cuò)誤理解也間接影響治療方案[162]。因此，應(yīng)客觀表述WES和WGS在臨床應(yīng)用上的益處[163]。第二，結(jié)果的多樣性也引出了如下問(wèn)題：需要決定哪些結(jié)果將反饋給研究對(duì)象和患者，以及不同的利益相關(guān)者在決定反饋給研究對(duì)象的結(jié)果時(shí)有多大的自主權(quán)。第三，結(jié)果信息可能與家屬相關(guān)或有暗示作用，而家屬并沒(méi)有參與知情同意過(guò)程。第四，考慮到數(shù)據(jù)的未來(lái)利用度和分享度，必須再三斟酌知情同意的適用范圍。最后，必須強(qiáng)調(diào)知情同意在研究過(guò)程和臨床場(chǎng)景中的差別，避免治療性誤解的發(fā)生。為了在臨床中進(jìn)行WES和WGS時(shí)實(shí)施恰當(dāng)?shù)闹橥猓瑧?yīng)在測(cè)序前花費(fèi)大量時(shí)間做充分輔導(dǎo)咨詢[164]。具體注意事項(xiàng)可參考Ayuso等[165]總結(jié)的WGS知情同意參考標(biāo)準(zhǔn)。

6.2 數(shù)據(jù)解讀 為決定哪些結(jié)果需要反饋，Berg等[166]提出了臨床WGS中間儲(chǔ)倉(cāng)式系統(tǒng)的構(gòu)想，根據(jù)分類標(biāo)準(zhǔn)決定反饋計(jì)劃。例如，具有臨床可行性的結(jié)果一定要上報(bào)，無(wú)臨床意義或不明的結(jié)果不需反饋，臨床上有效但可行性欠佳的結(jié)果根據(jù)研究對(duì)象的意愿反饋等。McGuire等總結(jié)了目前已有的共識(shí)：與臨床確實(shí)相關(guān)且具有直接可行性的結(jié)果應(yīng)該反饋給受試對(duì)象[167],而不必公開意義不明的研究結(jié)果[168]。而對(duì)于預(yù)期沒(méi)有估計(jì)到的意外結(jié)果，或稱“脫靶結(jié)果”[154],是否應(yīng)反饋給受試對(duì)象至今還沒(méi)有能被廣泛認(rèn)可的解決方案[154,169～173]。

6.3 數(shù)據(jù)知情和處理意見(jiàn) NGS的應(yīng)用產(chǎn)生了大量的原始序列數(shù)據(jù)和遺傳變異結(jié)果：WGS有望揭示300萬(wàn)至400萬(wàn)的基因變異，WES也有望顯示大約2萬(wàn)的突變型[164]。Pinxten等[174]分別從數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、分析和分享3個(gè)方面討論數(shù)據(jù)處理的倫理和實(shí)用性問(wèn)題。①是否有及在何種情況下有義務(wù)必須做到記錄保存，②未成年人達(dá)到法定成年年齡時(shí)能否訪問(wèn)曾經(jīng)的測(cè)序數(shù)據(jù)，③尋求新的診斷和治療方案的患者是否應(yīng)重新聯(lián)系[175]，④電子病歷還不能很好地儲(chǔ)存大量WES和WGS原始數(shù)據(jù)的問(wèn)題[164]，⑤存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)可能會(huì)產(chǎn)生實(shí)際鑒定和破壞隱私保密的風(fēng)險(xiǎn)等[176]。生物信息學(xué)分析也并非完全是自動(dòng)化處理，許多醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)都缺乏必要的資源投資昂貴的設(shè)備，聘請(qǐng)包括生物信息學(xué)等方面的有關(guān)專家。仍然需要包含更多醫(yī)療相關(guān)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)[177]。由此所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)成本的增加可能已超過(guò)技術(shù)上的花費(fèi)[178]。此外，決定不同遺傳變異對(duì)研究對(duì)象個(gè)人健康的意義[166]和將不同變異恰當(dāng)分類[176, 179]是很困難的。而要使所得數(shù)據(jù)價(jià)值最大化就必須分享數(shù)據(jù)，越是更多地分享在表型相似患者身上發(fā)現(xiàn)的變異，就越能實(shí)現(xiàn)對(duì)變異的正確分類。對(duì)研究人員和專家們，應(yīng)提倡并保證數(shù)據(jù)分享的合理實(shí)現(xiàn)[180]；對(duì)患者和研究對(duì)象，應(yīng)保證他們對(duì)數(shù)據(jù)分享計(jì)劃的知情，否則缺少透明度會(huì)損害公眾對(duì)WES和WGS的信任[176]。

7 展望

WES的臨床價(jià)值在于，可對(duì)單獨(dú)依據(jù)臨床或?qū)嶒?yàn)室難以確診的不典型疾病、檢查項(xiàng)目昂貴疾病和基因突變型未知的疾病做出診斷[181]，從而更全面地了解疾病的病因和發(fā)展史，指導(dǎo)特異性治療[182]。WES的應(yīng)用給兒童疾病診斷帶來(lái)了全新的思路，進(jìn)一步擴(kuò)展了人們對(duì)疾病譜的認(rèn)知度。依據(jù)目前WES在兒童單基因遺傳病和一些復(fù)雜疾病研究中的突出表現(xiàn)，不難推測(cè)其在腫瘤學(xué)、慢性疾病、產(chǎn)前診斷、新生兒疾病篩查和健康人群普查中也將發(fā)揮重要作用，因此明確WES的有效應(yīng)用領(lǐng)域和范圍十分必要。

臨床醫(yī)師應(yīng)該明智地判斷在何種情況下需使用WES診斷，向患者及其家屬詳細(xì)解釋W(xué)ES的結(jié)果含義、風(fēng)險(xiǎn)和限制，并避免為追求診斷給患者增加不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。WES推動(dòng)了對(duì)疾病遺傳致病機(jī)制的深入探究，隨著致病基因的不斷發(fā)現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制的逐漸揭示，臨床個(gè)體化用藥和個(gè)性化治療也將真正成為現(xiàn)實(shí)，從而顯著改善生命質(zhì)量[183, 184]。

對(duì)兒科學(xué)領(lǐng)域而言，WES在產(chǎn)前診斷中的意義尤為重要。WES能識(shí)別家族中的致病基因攜帶者和疾病易感者，預(yù)測(cè)后代患病風(fēng)險(xiǎn)，為早期診斷和排除診斷提供信息基礎(chǔ)[185]?；颊呒覍倏衫眠@些信息作為產(chǎn)前診斷、植入前遺傳學(xué)診斷和是否繼續(xù)生育的參考，避免嚴(yán)重缺陷患兒的出生或及早采取有效的針對(duì)措施。但是，分子診斷的建立能否對(duì)患者及其家庭的醫(yī)療情況產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響還存在爭(zhēng)論。目前的數(shù)據(jù)依然很難準(zhǔn)確識(shí)別WES的整體性能[26]，由于對(duì)突變體致病性的錯(cuò)誤解釋，以及醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中對(duì)基因與相關(guān)表型的張冠李戴，仍不可避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生。同時(shí)，基因病因的未知性和不可測(cè)性也增加了假陰性的可能。關(guān)于WES性價(jià)比、精確度、收益率和與臨床基因診斷的有效整合程度還需通過(guò)前瞻性研究進(jìn)一步分析。

如今，WES已成為WGS的經(jīng)濟(jì)替代[14]，但其在測(cè)序覆蓋度、檢測(cè)變異類型、操作復(fù)雜度和有效數(shù)據(jù)的覆蓋均一性等許多方面與WGS相比依然存在明顯不足。隨著WGS的成本不斷下降，WES的吸引力將會(huì)消退?？梢灶A(yù)測(cè)，WGS會(huì)大范圍地替代WES，WES今后可能僅在科研和臨床診斷中還有所運(yùn)用，直至完全退出測(cè)序市場(chǎng)。

隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，其不足之處也日益凸顯。例如，讀長(zhǎng)較短對(duì)后續(xù)生物信息學(xué)分析帶來(lái)困難[186]，擴(kuò)增后和擴(kuò)增前DNA 分子片段的數(shù)目偏差對(duì)基因表達(dá)分析有很大影響[187]等。而日漸興起的第三代單分子測(cè)序技術(shù)，因其采用單分子讀取技術(shù)，數(shù)據(jù)讀取速度更快且不需要PCR 擴(kuò)增，進(jìn)一步降低了測(cè)序成本，比第二代測(cè)序技術(shù)有著更廣闊的應(yīng)用空間。單分子測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)將促進(jìn)個(gè)體醫(yī)學(xué)研究的飛速發(fā)展。測(cè)序通量的增加可以在短時(shí)間內(nèi)就完成人體染色體將近300 億個(gè)堿基對(duì)的測(cè)序。而費(fèi)用的降低則使WGS接近甚至達(dá)到1 000美元基因組的目標(biāo)。這預(yù)示著建立個(gè)人基因組信息檔案將不再遙遠(yuǎn)，個(gè)人的基因組基本信息將作為診斷、治療和預(yù)防的手段。

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(本文編輯：張崇凡)

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院2015年國(guó)家級(jí)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育項(xiàng)目(二)

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.01.002

上海市衛(wèi)生局重要疾病攻關(guān)項(xiàng)目:2013ZYJB0015；上海市科委/醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)項(xiàng)目子課題：14411950402,14DJ1400103；上海市衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目：滬衛(wèi)計(jì)科教〔2013〕018號(hào)

1 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 上海，201102；2 上海市出生缺陷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，復(fù)旦大學(xué)兒童發(fā)育與疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，衛(wèi)生部新生兒疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院上海，201102；3 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院上海，200032；4 共同第一作者

周文浩，E-mail：zwhchfu@126.com

2014-12-17

2015-01-20)