陳平鋒

（南華大學附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，湖南 衡陽421001）

腎細胞癌是起源于腎小管上皮細胞的一類惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，在成人泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率僅次于膀胱癌，居第2位[1]，且發(fā)病和死亡率有逐年增高的趨勢?；颊叱踉\時約45%已有腫瘤轉(zhuǎn)移，50%～60%的腎癌患者術后有腫瘤復發(fā)。腎癌具有特殊的遺傳生物學特性和異質(zhì)性，較易發(fā)生轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的放化療對晚期轉(zhuǎn)移性腎癌極不敏感。多年來應用分子免疫、基因治療以及抗腫瘤血管形成的分子靶向治療對晚期或轉(zhuǎn)移性腎癌己取得令人滿意的療效。在對腎癌的診斷、治療和預后相關性研究中，大量的腫瘤相關因子表現(xiàn)出良好的應用前景。

氨基肽酶N（aminopeptidase N，APN） 又名CD13是一種Ⅱ型膜結合鋅離子金屬蛋白酶，可以將氨基酸從寡肽N末端切除的膜結合糖蛋白[2]。CD13最早主要作為髓細胞表面標志物用于白血病分類的鑒別。近年來CD13在腫瘤方面的相關研究日益增多。研究表明其在體內(nèi)通過單一機制或多個機制協(xié)同作用參與腫瘤病理生理過程。CD13通過蛋白水解酶的作用，降解細胞外基質(zhì)，參與腫瘤間的信號傳導，參與新生血管形成，導致腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[3]。本研究采用免疫組化方法研究了腎癌組織中CD13的表達情況，并分析其與臨床病理學因素的關系，以期為腎癌的診斷、預后及靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2006年6月-2009年6月南華大學第一附屬醫(yī)院手術切除的腎癌、癌旁、遠癌新鮮組織各93例，所有標本術前均未經(jīng)放、化療，并經(jīng)術后病理學確認均為腎細胞癌。從每例患者的手術標本中分別取癌組織、癌旁組織和遠癌組織，癌組織均在原發(fā)灶取材，避開壞死、炎癥區(qū)域；癌旁組織取自相應腫塊旁0.5～2 cm的腎組織;遠癌組織均取自距腫塊邊緣5 cm以上的腎組織。標本均在術中離體后立即收集，取材均為黃豆粒大小，取材后立即凍存保存于液氮中。93例標本中，其中，男62例，女31例；年齡<60歲56例，≥60歲37例；透明細胞癌64例，乳頭狀細胞癌13例，嫌色細胞癌12例，集合管癌4例；臨床分期：Tl期32例，T2期34例，T3～T4期27例；病理組織學分級：Gl級24例，G2級37例，G3～G4 26例；有淋巴結轉(zhuǎn)移27例，無淋巴結轉(zhuǎn)移66例。

1.2 試劑

CD13單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗人VEGF多克隆抗體（貨號ZA-0509，北京中杉公司），PV-9000試劑盒（北京中杉公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉公司）。

1.3 免疫組織化學PV-9000法

將存檔的石蠟標本重新制備4μm厚切片，脫蠟，再水化。置于pH 6.0的檸檬酸緩沖液中行高壓抗原修復后，3%雙氧水（H2O2）消除切片內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加一抗（CD13單克隆抗體，工作液濃度為1∶150；兔抗人VEGF多克隆抗體，即用型，稀釋度1∶100），4℃冰箱濕盒內(nèi)孵育過夜。滴加二抗試劑1和試劑2（PV-9000試劑盒），并置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育30min。顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，脫水至透明，中性樹膠封片。用已知肝癌陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。結果判定：由2位不知曉患者臨床資料的病理醫(yī)師進行結果判定。以胞核內(nèi)有黃或棕黃色顆粒染色者為CD13陽性細胞，陽性細胞所占百分比<10%計為Spl陰性，10%～50%者計為CD13陽性表達，>50%者為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組間比較采用χ2檢驗或Fisher's精確概率法，相關分析采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD13與腎細胞癌臨床病理參數(shù)的相關性

CD13主要表達于癌細胞膜，CD13陽性表達（+）和CD13強陽性表達（++）（圖1）。CD13在93例腎癌組織中陽性表達率為73.11%（68/93），癌旁組織中陽性表達率為21.51%（20/93），正常腎組織中陽性表達率為6.45%（6/93）。三者表達差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，表1）。腎細胞癌中CD13蛋白表達與腫瘤大小、年齡、性別無相關性，而與淋巴結轉(zhuǎn)移、腫瘤分級及TNM分期有關（P<0.05，表2）。

2.2 CD13在腎細胞癌中的表達與預后的關系

腎細胞癌組織中CD13表達陽性患者1、3及5年生存率分別為50.0%（34/68）、20.43%（15/68）及2.94%（2/68）；CD13陰性表達患者1、3及5年生存率分別為88.0%（22/25）、76.0%（19/25） 及32.0%（8/25）。CD13表達陽性患者1、3及5年生存率均低于CD13表達陰性者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。K-M生存曲線分析（圖2）顯示CD13陽性表達組（+）中位生存時間為13.86個月，CD13強陽性表達組（++）中位生存時間為8.76個月，CD13陰性表達組中位生存時間為51.50個月。CD13陽性表達組患者預后明顯差于CD13陰性表達組，其中CD13強陽性表達組（++）病例預后最差。Log-rank檢驗顯示差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。多因素COX逐步回歸分析提示腎癌患者的預后與CD13表達、TNM分期相關，CD13是影響總體生存率預后的獨立危險因素，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖1 CD13在腎細胞癌中的表達

表1 CD13蛋白在腎癌、癌旁、正常組織的表達 （n=93）

表2 腎癌組織中CD13蛋白表達與臨床特征之間的關系 [例（%）]

圖2 CD13表達陽性、強陽性和陰性腎癌患者的生存曲線

3 討論

目前研究證實，CD13參與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，其可能的機制包括四個方面。①CD13能夠通過降解細胞外基質(zhì)，釋放促進腫瘤細胞增殖的生長因子，也可間接調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖信號，或作為一種特殊受體參與MMP（matrix metalloproteinase）的過表達過程，最終導致腫瘤細胞的增殖生長[4-5]。②CD13還參與腫瘤新生血管的形成，新生血管形成主要與Ras-絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）途徑和Ras-PI K途徑2條途徑有關，而CD13是Ras介導的兩個信號傳導途徑的靶分子。活化的Ras、Raf、MAPK傳遞信號到核內(nèi)，使核轉(zhuǎn)錄因子Ets-2磷酸化?；罨腅ts-2與CD13近端啟動子相結合，啟動轉(zhuǎn)錄[6]。③CD13還參與腫瘤細胞的局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移，CD13可水解靶器官或靶組織的細胞外基質(zhì)、基底膜（基膜和Ⅳ型膠原蛋白），從而使原發(fā)灶的腫瘤細胞隨血液或淋巴液循環(huán)遷移黏附形成轉(zhuǎn)移灶；④CD13可通過降解IL-8、MHCⅡ型黏附抗原決定簇而降低T細胞對腫瘤細胞的識別，從而降低機體免疫功能，導致腫瘤細胞存活[7]。

近年的研究顯示CD13在肺癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細胞表面均有異常表達而且與某些腫瘤的分化狀態(tài)、臨床分期和預后相關[8-10]。但是對于CD13在膀胱癌中的表達及其與預后的關系，相關研究不多。本研究顯示膀胱癌組織CD13的陽性表達率高于癌旁組織以及正常膀胱組織，而且淋巴結轉(zhuǎn)移及腫瘤分級分期相關。目前臨床上最為常用的膀胱癌診斷方法為尿細胞學（UC）檢查，但近年發(fā)現(xiàn)UC檢查對早期患者的敏感性不甚令人滿意，臨床亟需更加敏感或特異的生化標志物。VAN等[11]對全血、良惡性胸腹水及腫瘤內(nèi)液可溶性CD13（sCD13）水平進行研究表明：惡性腫瘤患者血漿或胸腹水中的sCD13的水平明顯高于良性疾病患者。乳腺癌、卵巢癌和骨肉瘤患者體液中sCD13顯著升高，提示sCD13水平有助于惡性腫瘤的診斷。IKEDA等[12]對50例胰腺癌患者研究顯示，CD13與腫瘤新生血管有關，可作為胰腺癌的獨立的診斷標志。因此，根據(jù)以往和本研究結果，筆者大膽推測CD13有可能作為一個新的膀胱癌診斷標志物，但具體方法有待進一步研究。CD13與淋巴結轉(zhuǎn)移、腫瘤分級及臨床分期有關，提示CD13與膀胱癌的浸潤、轉(zhuǎn)移關系密切，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。CD13陽性表達組病例的1、3及5年生存率顯著低于CD13陰性表達組，CD13陽性表達組患者預后較差。

COX分析顯示CD13是影響膀胱癌患者預后的危險因素。這些結果提示CD13的表達也可以作為判斷預后的一項指標。

研究表明CD13抑制劑可通過半胱天冬酶-3信號途徑和磷脂酰肌醇-3激酶（P13K）-糖原合酶（GSK）信號途徑誘導K562細胞和急性白血病細胞U937凋亡[13]。其代表藥物為Bestatin，是一種從橄欖網(wǎng)狀鏈霉菌培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)的小分子肽。目前，CD13抑制劑已用于動物腫瘤轉(zhuǎn)移模型的治療，已有多種藥物在人類臨床前實驗中取得良好的抗腫瘤效果。TSUKAMOTO等[14]研究表明Bestatin能提高宮頸癌化療療效，誘導宮頸癌細胞Hela凋亡。CHRIST等[15]研究發(fā)現(xiàn)Bestatin能誘導膀胱癌細胞凋亡，提高膀胱癌化療療效。NGR血管跟蹤肽即天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸（Asn-Gly-Arg）是CD13的特異性受體。以NGR為載體，將各種抑癌物質(zhì)如阿霉素、腫瘤壞死因子和抑癌基因特異結合研究腫瘤血管靶向治療新藥物，可增加療效，減少全身用藥，降低不良反應。CHEN等[16]將包裹阿霉素的脂質(zhì)體和抑癌基因與NGR結合靶向?qū)隒D13陽性表達的人纖維肉瘤細胞Ht-1080，引起CD13表達陽性的Ht-1080細胞凋亡。然而CD13在人體分布范圍廣、功能多并參與各種生理病理過程，因此，只有研制出選擇性高、組織特異性好的CD13靶點藥物才可有效抗腫瘤，否則會影響機體功能，產(chǎn)生多種并發(fā)癥。綜上所述，檢測CD13對膀胱肝癌的診斷、預后及治療具有一定的臨床應用價值。

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