高夢月 秦香香 蘇玲玲 成大榮

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇 揚(yáng)州225009)

鴨疫里默氏桿菌是危害鴨、鵝、火雞的一種重要病原，當(dāng)有其他微生物混合或繼發(fā)感染時能造成更嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，其中禽致病性大腸桿菌是RA最常見的混合或繼發(fā)感染菌。二者在臨床癥狀、病理變化及流行病學(xué)等方面均有諸多相似之處。因此常規(guī)的診斷方法很難快速、準(zhǔn)確地作出診斷，故建立二者鑒別診斷的分子生物學(xué)方法十分必要。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料

Taq 酶、dNTPs、10×Buffer、DNA Marker DL1000、DNA MarkerDL2000、6×LoadingBuffer、大腸桿菌F菌毛、P菌毛、HPI的上下引物、鴨疫里默氏桿菌的上下引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)；參考菌株（來自家禽研究所）；革蘭氏陰性菌藥敏試劑盒（杭州天和微生物試劑有限公司）；冷凍離心機(jī)；PCR儀(美國PE公司)；電泳儀；凝膠成像儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 病料的采集與處理

2013年9 月至2014年5月，從揚(yáng)州大學(xué)動物醫(yī)院采集病料，采集其病變組織。在超凈工作臺中，用接種環(huán)蘸取病料分別接種于TSB瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板。TSB瓊脂平板置于含5%～10%CO2的蠟燭罐中37℃培養(yǎng)24h[1]；麥康凱瓊脂平板置于37℃溫箱中培養(yǎng)12h。挑取可疑菌落接種于肉湯培養(yǎng)基，增菌培養(yǎng)12h后，增菌液可用于制備模板。

1.2.2 參考菌株的肉湯培養(yǎng)

1.2.3 模板的制備

先在1.5mL的離心管中加入50μLddw，然后挑取長出的典型單菌落于離心管中，沸水浴10min后，置于-20℃冰箱中凍存5-10min，取出12000r離心10min,收集上清液作為模板備用。

1.2.4 引物的設(shè)計

表1 大腸桿菌F 菌毛、P 菌毛和HPI 的引物序列

表2 鴨疫里默氏桿菌的引物序列

1.2.5 PCR方法的建立

1.2.5.1多重PCR條件的優(yōu)化

采用25μL反應(yīng)體系，其中10×buffer2.5μL，dNTPs 2μL，Taq酶0.25μL，RA和APEC上、下引物各0.25μL，RA和APEC模板各1μL，補(bǔ)加17.25μLddw至25μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，72℃延伸55s，30個循環(huán)后，72℃延伸10min,通過改變退火溫度而其他參數(shù)保持不變來優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，退火溫度從50℃按梯度變化到60℃。

1.2.5.2多重PCR的特異性

鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌的參考菌株被用來確認(rèn)多重PCR的特異性。從參考菌株提取的DNA作為多重PCR的模板，在優(yōu)化條件下，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.5.3多重PCR對臨床病例的檢測對采集的臨床病料，用PCR方法進(jìn)行檢測，以驗證所建立的多重PCR方法能否直接對病料進(jìn)行檢測。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的電泳和鑒定

將經(jīng)PCR擴(kuò)增后的模板取出，分別加入10μL6×Loading Buffer，以DNA Marker DL1000作為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量，取10μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，染色后于凝膠成像儀中觀察擴(kuò)增片段大小。

1.2.7 藥敏試驗吸取檢測為陽性的20株RA和20株APEC的快速增菌培養(yǎng)物，均勻涂布于培養(yǎng)平板，貼上藥敏紙片，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

2 實驗結(jié)果

2.1 PCR方法的建立（圖1）

圖1 PCR 電泳結(jié)果

2.2 特異性檢測

分別以已知血清型的鴨疫里默氏桿菌和禽致病性大腸桿菌作為參考菌株，并以鴨源巴氏桿菌菌株、鴨源沙門氏菌分離株為對照，結(jié)果鴨疫里默氏桿菌菌株出現(xiàn)大小為592bp的產(chǎn)物條帶，禽致病性大腸桿菌菌株出現(xiàn)大小為420bp、700bp、287bp的產(chǎn)物條帶，而對照株未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。（圖2）

2.3 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示所有被檢鴨疫里默氏桿菌菌株對卡那霉素、哌拉西啉、妥布霉素、氨芐西林的耐藥率均達(dá)到了100%；對頭孢他啶的敏感率達(dá)到了100%。禽致病性大腸桿菌對卡那霉素、哌拉西林、頭孢唑啉、妥布霉素、頭孢噻吩、氨芐西林、氧氟沙星和鏈霉素的耐藥率均為100%；對頭孢他啶的敏感率為100%?？梢?，禽致病性大腸桿菌的耐藥性比鴨疫里默氏桿菌更強(qiáng)。

3 討論

3.1 常規(guī)的PCR檢測方法[2,3]只能進(jìn)行單一細(xì)菌的檢測。為了同時檢測出兩種菌且避免出現(xiàn)假陽性[4]，本研究在兩者的高度保守區(qū)設(shè)計了四對特異性引物，通過菌落和菌液PCR均能獲得特異性結(jié)果，增強(qiáng)了實際應(yīng)用性。

3.2 來源不同的鴨疫里默氏桿菌和禽致病性大腸桿菌對藥物敏感性各不一致[5]。因此,在治療兩種菌混合感染時要進(jìn)行敏感藥物篩選,以免造成藥物和生產(chǎn)上的損失。

圖2 特異性檢測結(jié)果

[1]季權(quán)安，劉燕，等.鴨疫里默氏桿菌PCR快速檢測方法的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012,24(3):388-391.

[2]張蓉蓉,羅青平,等.4株鴨疫里默氏桿菌的PCR快速鑒定及藥敏試驗[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,51(22):5193-5196.

[3]胡清海,劉曉文,等.應(yīng)用PCR技術(shù)檢測鴨疫里默氏桿菌的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2002,24(6):471-473.

[4]Gussow D,Glackson T.Direct clone characterization fromp-laques and colonies by the polymerase chain reaction[J].NucleicAcidsRes,1989,17:4.

[5]黃瑜,李文楊.番鴨大腸桿菌病的診治[J].中國獸醫(yī)雜志,2000,26(12):34-35.