李書光，張 娜，王玉茂，李 峰，林初文，沈志強，李金林*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2.山東綠都生物科技有限公司 山東 濱州 256600)

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一株血清型O101多重耐藥牛致病性大腸桿菌菌株的分離鑒定

李書光1,2Δ，張 娜2Δ，王玉茂1,2，李 峰1,2，林初文2，沈志強1，李金林1,2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2.山東綠都生物科技有限公司 山東 濱州 256600)

試驗對病料進(jìn)行病原檢測，并對分離到的病原菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定、血清學(xué)鑒定、藥物敏感性試驗、小鼠致病性試驗研究，依據(jù)研究結(jié)果進(jìn)行針對性治療。試驗結(jié)果:成功分離到一株牛致病性大腸桿菌，該株菌多重耐藥，對小鼠具有高度致病性，其血清型為O101，使用該菌株的敏感藥物對后續(xù)腹瀉犢牛進(jìn)行了及時治療，成功控制了該養(yǎng)殖場犢牛腹瀉的問題。

犢牛腹瀉；大腸桿菌；多重耐藥；臨床治療

牛腹瀉性大腸桿菌病是危害養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)的主要疾病之一，主要侵害犢牛，青年牛在應(yīng)激環(huán)境下也可發(fā)病，臨床上以腸毒血癥、敗血癥和腸炎為主要特征。在有傳染源的農(nóng)場，犢牛一年四季均可發(fā)生，在冬末春初和氣溫多變季節(jié)發(fā)病更為嚴(yán)重，且由于耐藥性的產(chǎn)生，養(yǎng)殖場使用藥物治療效果不明顯，常導(dǎo)致犢牛因腹瀉脫水死亡[1]。

2013年12月，山東某規(guī)模肉牛養(yǎng)殖場發(fā)生多例犢牛腹瀉病，死亡率達(dá)50%，為表明病周本實驗以患病犢牛為試驗對象，采集其血樣和腹瀉物，開展相應(yīng)的病原分離鑒定，為有效防治牛大腸桿菌病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇患病10～30日齡犢牛 頭，送山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院進(jìn)行診治，無菌采集病牛腹瀉物和血樣。

1.2 試劑及實驗動物

革蘭氏染液、TSA血平板由山東省濱州預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點實驗室制備、保存；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，血清包括：O1、O2、O6、O15、O20、O21、O22、O25、O29、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O39、O45、O53、O78、O80、O83、O86、O88、O91、O101、O107、O123、O141、O138、O154。體重18～22 g昆明系小白鼠購自山東大學(xué)實驗動物中心。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將無菌采集的病牛腹瀉物在TSA血平板接種進(jìn)行病原菌的分離，置37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取平板上各形態(tài)的單菌落，涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌落形態(tài)。

1.4 分離菌株的PCR鑒定

鑒定引物參照趙戰(zhàn)勤[2]等常見革蘭氏陰性桿菌多重PCR引物，由上海生工生物有限公司合成，擴增大腸桿菌保守基因uidA基因，擴增長度為264 bp。

PCR擴增反應(yīng)體系為25 μL，25 μM上下游引物各1 μL，2.5 mM dNTP Mixture 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，rT aqDNA 酶( 5 U/μL) 0.25 μL，挑取單菌落作為模板，ddH2O補足體系。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，同時以ddH2O做空白對照。取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

注：S 表示高度敏感(Φ>15mm)，I 表示中度敏感(10mm≤Φ≤15mm)，R 表示低度敏感或不敏感(Φ<10mm)。

Notes：S stood for high sensitivity(Φ>15mm)；I for moderate sensitivity(10 mm≤Φ≤15 mm)，R for low or no sensitivity(Φ<10 mm).

1.5 分離菌株的血清型鑒定

大腸桿菌普通肉湯培養(yǎng)液37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)基呈均勻渾濁生長，生理鹽水洗滌3遍后，121 ℃高壓2 h，制成高壓抗原，使用比濁管調(diào)整至100億/ml。參照李書光等[3]微量凝集試驗方案，對分離株進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

1.6 致病性試驗

挑取鑒定純培養(yǎng)的犢牛大腸桿菌分離株，接種于成品營養(yǎng)肉湯中37 ℃培養(yǎng)18 h后，活菌計數(shù)，調(diào)整濃度至1×108CFU/mL。20只18～22 g體重的昆明系小白鼠，隨機分成2組，每組10只，1號組每只小白鼠皮下注射0.2 mL菌液，2號組腹腔注射等量生理鹽水做對照組，隔離飼養(yǎng)觀察7 d。

1.7 藥敏試驗

將鑒定完畢的病原菌密集劃線接種于新的TSA培養(yǎng)皿，無菌放置干燥抗菌藥物紙片緊貼于密集劃線接種了菌種的培養(yǎng)基表面，每個直徑90 mm的平皿貼7個藥敏紙片、蓋上平皿，倒置平皿置37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，取出測量觀察結(jié)果，判斷標(biāo)準(zhǔn)按2010版CLSI M100—S20執(zhí)行。

1.8 臨床治療

使用敏感藥物靜脈注射進(jìn)行臨床治療。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

分離菌在TSA血平板上呈單一形態(tài)菌落，無其他雜生或弱勢菌株。分離菌在TSA血平板上可見中等大小、圓形隆起、表面光滑、呈淺灰色半透明菌落。革蘭氏染色鏡檢顯示其為革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓，多數(shù)呈單個散在、個別成雙排列、無芽孢的桿菌，如圖1所示。

圖1 分離菌的革蘭氏染色鏡檢(1 000)

2.2 PCR鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分析，結(jié)果顯示在260bp左右有一條特異性條帶，空白對照無條帶，說明分離菌為大腸桿菌。

圖2 大腸桿菌PCR鑒定結(jié)果

2.3 分離菌株的血清型鑒定(本部分有無圖或表支持現(xiàn)結(jié)論)

血清型試管凝集試驗結(jié)果表明，該菌株與O35、O78、O101發(fā)生凝集反應(yīng)，但僅與O101大腸桿菌陽性血清發(fā)生強凝集反應(yīng)，因此該菌株的血清型為O101。

2.4 分離菌株的致病性

實驗組小鼠腹腔注射分離菌培養(yǎng)物，24 h內(nèi)全部死亡，對照組小鼠未見任何癥狀。剖檢死亡小鼠，未見明顯病變。從死亡小鼠肝臟中分離細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行PCR和血清學(xué)鑒定，結(jié)果顯示，該菌與接種菌為同種細(xì)菌。

2.5 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示：該分離菌對阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素高度敏感；對新霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星中毒敏感；而該菌株對紅霉素、青霉素、氨芐西林、頭孢噻呋等產(chǎn)生耐藥性。

2.6 臨床治療

使用靜脈滴注阿米卡星，連用2天，發(fā)病犢牛在5天內(nèi)均康復(fù)。

3 討 論

經(jīng)過試驗，證實該牛場的犢牛腹瀉主要病原是血清型為O101的致病性大腸桿菌。藥敏試驗實驗中選用的11種藥物，分離菌對阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素高度敏感，在生產(chǎn)中可優(yōu)先考慮。血清型O101的大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的主要血清型，其他的還有O3、O8、O9、O14、O15、O20、O26、O43、O60、O78、O93、O101、O105、O109等血清型[4]。此次臨床診斷、病原菌的分離鑒定及藥物治療，弄明白了困擾該場犢牛成活率的原因是多重耐藥致病性大腸桿菌，由于抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致多重耐藥菌株的出現(xiàn)[5-6]，使用藥物治療控制效果不明顯，犢牛體質(zhì)較差，腹瀉導(dǎo)致嚴(yán)重脫水，嚴(yán)重影響了初生犢牛的存活率[7]。試驗過程中，篩選到的敏感藥物取得了較好的防治效果，但是伴隨著耐藥性的產(chǎn)生，要從根本上來凈化養(yǎng)殖場，還要采取多重的凈化措施[8]，包括種牛引進(jìn)、產(chǎn)房的隔離、藥物配合疫苗的使用等綜合方案。

在試驗過程中，為了鑒別診斷是否有BVDV混合感染，本研究室采用上海繼錦化學(xué)科技有限公司的牛(Bovine)病毒性腹瀉抗體(BVDV-Ab)ELISA檢測試劑盒和BVDV、BCV和BRV三重RT-PCR檢測方法進(jìn)行了相應(yīng)的抗原和抗體檢測，檢測結(jié)果顯示為陰性，排除該場犢牛腹瀉的病毒性因素，進(jìn)一步證實了病原菌分離鑒定的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

本研究分離株的血清型為O101，使用K88、K99、987p和F41的PCR鑒定引物均沒有擴增到目的條帶[9]，與早期研究中牛羊群中主要的菌毛蛋白為K99和F41有區(qū)別[10-11]。昆明系小白鼠作為大腸桿菌的毒力模型使用較為廣泛[12]，本研究中僅采用了小白鼠毒力試驗[13]，沒有使用本動物回歸試驗檢測分離菌株的毒力，有待于后期研究中進(jìn)一步開展。

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Isolation and Identification of O101 Multidrug-resistant Serotype Bovine PathogenicEscherichiacoli

Li Shu-guang1,2, Zhang Na1,2, Wang Yu-mao1,2, Li Feng1,2, Lin Chu-wen2, Shen Zhi-qiang1, Li Jin-lin1,2

((1.ShandongBinzhouAcademyofAnimalScience&VeterinaryMedicine,Binzhou,Shandong256600; 2.ShandongLvduBio-technologyCo.Ltd,Binzhou,Shandong256600))

The cases of calf diarrhea death in a large-scale beef cattle farm were collected, the corresponding isolated pathogen, molecular identification, serological identification, drug sensitivity test, mice pathogenicity test were conducted and a targeted therapy was undertaken thereafter to the herds. The results showed that one srain of bovine pathogenic Escherichia coli, serotype O101 with strong multidrug resistance and high pathogenicity to mice, was successfully isolated and used in the sensitive medicine for timely treating of follow-up diarrhea calves.

calf diarrhea; escherichia coli; multidrug resistance; clinical treatment

2014-07-31，

2014-11-16

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(SDAIT-12-011-12)；

李書光(1982-)，男，山東惠民人，在讀博士研究生，助理研究員，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail:lshug@163.comΔ同等貢獻(xiàn)作者：張 娜(1984-)，女，碩士，助理研究員，山東泰安人，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail:

*[通訊作者] 李金林(1960-)，男，山東治化人，推廣研究員，主要從事洼地綿羊選育研究與開發(fā)。E-mail:lijinlin116@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)02-0072-03