齊軍茹 翁靜宜 馮紀(jì)璐 劉倩茹 楊曉泉

(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院， 廣東 廣州 510640)

干熱法及大分子擁擠體系制備的共價(jià)復(fù)合物的物化性質(zhì)*

齊軍茹 翁靜宜 馮紀(jì)璐 劉倩茹 楊曉泉

(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院， 廣東 廣州 510640)

通過(guò)干熱法和大分子擁擠體系分別制備大豆7S球蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物，討論不同反應(yīng)體系制備的產(chǎn)物的物化性質(zhì)差異.根據(jù)糖基化產(chǎn)物在7S等電點(diǎn)(pH=4.8)和中性條件(pH=6.5)下的溶解性將其分成兩組分，對(duì)其接枝度、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、內(nèi)置熒光和濁度進(jìn)行分析.結(jié)果表明：在大分子擁擠環(huán)境下，7S在液相環(huán)境中發(fā)生了一定程度的水解，生成小分子的肽鏈，有利于多糖的共價(jià)接入;MC48(pH=4.8時(shí)制得，大分子擁擠體系)中主要是接枝程度較高的糖基化產(chǎn)物，MC65(pH=6.5時(shí)制得，大分子擁擠體系)中含有的糖基化產(chǎn)物接枝度較低，且程度不均勻;干熱法制備得到的DH48(pH=4.8時(shí)制得)和DH65(pH=6.5時(shí)制得)接枝度較低，差異性不及大分子擁擠環(huán)境顯著.SDS-PAGE、圓二色光譜、內(nèi)置熒光分析結(jié)果表明，大分子擁擠環(huán)境下制得的MC48和MC65物化性質(zhì)差異顯著，而干熱法制得的DH48和DH65的物化性質(zhì)差異不明顯.

大豆7S球蛋白；葡聚糖；物化性質(zhì)；大分子擁擠體系；Maillard反應(yīng)

從食品工業(yè)的效益角度來(lái)看，Maillard反應(yīng)是一種高效、安全的蛋白質(zhì)物性修飾方法[1- 3].多糖與蛋白質(zhì)的共價(jià)接枝可以大大提高蛋白質(zhì)的功能特性，如熱穩(wěn)定性、乳化特性、凝膠特性、發(fā)泡特性以及抗氧化性等[4- 9].到目前為止，常用來(lái)進(jìn)行Maillard反應(yīng)的主要是干熱法，它通過(guò)控制一定的溫度和濕度使蛋白質(zhì)和多糖發(fā)生共價(jià)復(fù)合反應(yīng)[10- 12].然而，干熱法通常需要長(zhǎng)達(dá)數(shù)天或者數(shù)周的反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)程度難以控制，容易導(dǎo)致產(chǎn)物發(fā)生過(guò)度的褐變，因此在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中并不可行，反應(yīng)得到的產(chǎn)物沒(méi)有商業(yè)價(jià)值[13].從經(jīng)濟(jì)性的角度而言，一種反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單的糖基化方法才是業(yè)界所希望的.

文獻(xiàn)[14]中報(bào)道了一種新型的糖基化加工方法——利用大分子擁擠環(huán)境完成Maillard反應(yīng).大分子擁擠環(huán)境是生命科學(xué)領(lǐng)域的新概念，已被應(yīng)用到當(dāng)前其他研究領(lǐng)域中.近年來(lái)，科學(xué)家們已充分證明，pH值、溶液中的離子強(qiáng)度、溶液的組成和分子擁擠程度都是影響Maillard反應(yīng)的重要因素[15].在反應(yīng)體系中，高濃度的大分子物質(zhì)遵循分子排斥容積理論，能促進(jìn)反應(yīng)向著結(jié)合的方向進(jìn)行[16].同時(shí)，在大分子擁擠環(huán)境中，蛋白質(zhì)的聚集程度也被大大降低[12,14].除了干熱法之外，還有許多其他的方法也能進(jìn)行糖基化反應(yīng).例如，筆者曾利用80%的乙醇反應(yīng)體系促進(jìn)大豆酸沉蛋白與葡聚糖的共價(jià)復(fù)合反應(yīng)[17]，Xu等[18]采用干熱法制備了7S球蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物，Zhang等[14]采用大分子擁擠環(huán)境來(lái)促進(jìn)7S球蛋白和葡聚糖的Maillard反應(yīng)等.

筆者前期的研究結(jié)果表明，在大分子擁擠環(huán)境中，高濃度的葡聚糖能有效地抑制大豆7S球蛋白的熱聚集行為[14].然而，與干熱法相比，大分子擁擠環(huán)境下制得的共價(jià)復(fù)合物不夠穩(wěn)定，而且糖基化程度不均勻，糖基化產(chǎn)物整體的物化性質(zhì)較差.以往的研究也表明，不同方法制備的糖基化產(chǎn)物的物化性質(zhì)有顯著差異，但截至目前，尚未有人探討造成這種差異的根本原因.另外，蛋白質(zhì)與多糖共價(jià)復(fù)合的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物的物化性質(zhì)在包括等電點(diǎn)的酸性范圍內(nèi)能得到有效的改善，因此，關(guān)注等電點(diǎn)處共價(jià)復(fù)合物的物性和結(jié)構(gòu)以得到真正具有優(yōu)異功能的糖基化產(chǎn)物，應(yīng)該是蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物制備的核心問(wèn)題，并更具有研究意義.而且，等電點(diǎn)處獲得的糖基化產(chǎn)物與傳統(tǒng)中性范圍得到的糖基化產(chǎn)物的差異很可能是進(jìn)一步深化蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物的應(yīng)用的關(guān)鍵.

文中采用傳統(tǒng)干熱法和大分子擁擠體系制備得到糖基化產(chǎn)物，并根據(jù)pH4.8(7S球蛋白等電點(diǎn))和pH6.5(中性)下的溶解度將產(chǎn)物分離分級(jí)，系統(tǒng)地研究了兩種制備體系下所得共價(jià)復(fù)合物的物化性質(zhì)的差異，探討等電點(diǎn)處獲得的糖基化產(chǎn)物具有優(yōu)異功能的本質(zhì)原因，并為不同條件下得到的糖基化產(chǎn)物的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆粕購(gòu)于山東禹王有限公司，用杜馬斯燃燒法測(cè)得其蛋白質(zhì)含量為55.923%±0.158%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)；葡聚糖(分子質(zhì)量67 ku)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑如無(wú)特殊注明均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Alpha-4型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST公司生產(chǎn)；DYCZ-30型垂直板電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)；UV2300型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美公司生產(chǎn)；Nano-ZS型激光動(dòng)態(tài)力度掃描儀，英國(guó)Malvern公司生產(chǎn)；F-7000型熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司生產(chǎn)；MultiMode SPM型原子力顯微鏡，美國(guó)Veeco公司生產(chǎn)；MOS-450型圓二色性光譜儀，法國(guó)BioLogic Science公司生產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆7S球蛋白的制備

大豆7S球蛋白按文獻(xiàn)[19]的方法分離制備.

1.3.2 大豆7S球蛋白糖基化產(chǎn)物的制備

(1)大分子擁擠體系制備

將7S與葡聚糖(DEX)分別按50 g/L和150 g/L的質(zhì)量濃度分散于蒸餾水中(pH=7.0),充分溶解后置于4 ℃冰箱中水化過(guò)夜，再在95 ℃恒溫下加熱攪拌6 h，冰浴結(jié)束反應(yīng).用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至4.8，攪拌2 h后于10 000g下離心30 min.得到的上清液回調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥后得到組分MC48.沉淀以1∶10的比例復(fù)溶回調(diào)pH值至6.5，10 000g下離心30 min，上清液冷凍干燥后得到組分MC65.

(2)干熱法制備

將7S與DEX按1∶1的質(zhì)量比混合后分散于磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L，pH=6.8)中.冷凍干燥后，將凍干粉末放入干燥器中(底部放置過(guò)飽和的KBr溶液)，置于60 ℃的烘箱中反應(yīng)4 d.干熱后的粉末重新分散到蒸餾水中，用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至4.8，攪拌2 h后于10 000g下離心30 min.得到的上清液回調(diào)pH值至6.5，冷凍干燥后得到組分DH48.沉淀以1∶10的比例復(fù)溶后,回調(diào)pH值至6.5，10 000g下離心30 min，冷凍干燥后得到組分DH65.

采用Dumas法測(cè)得凍干的MC48、MC65、DH48和DH65樣品中蛋白質(zhì)含量分別為4.21%、70.33%、15.45%和48.19%(干重，換算系數(shù)為5.71).

1.3.3 SDS-PAGE分析方法

依據(jù)Laemmli[20]的方法進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳)分析.分離膠含量為12%(體積分?jǐn)?shù)，下同)，濃縮膠含量為5%，電極緩沖液(含SDS)為T(mén)ris-甘氨酸緩沖液(pH值約為8.3)，上樣量為10 μL.加樣后電流設(shè)定為40 mA，樣品進(jìn)入濃縮膠后改為80 mA，當(dāng)電泳跑至距離電泳槽橡膠底邊約1.5 cm時(shí)，關(guān)閉電源.分別用考馬斯亮藍(lán)R-250試劑和過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色法對(duì)凝膠膠片進(jìn)行蛋白質(zhì)及糖染色.

1.3.4 接枝度的測(cè)定

將0.5 mL待測(cè)樣品(蛋白質(zhì)含量1 g/L)、0.5 mL NaHCO3溶液(質(zhì)量濃度40 g/L)、0.5 mL SDS溶液(質(zhì)量濃度100 g/L)、0.5 mL TNBS溶液(質(zhì)量濃度1 g/L)均勻混合，在40 ℃條件下避光反應(yīng)2 h，加入1 mol/L的HCl溶液0.25 mL和0.01 mol/L的HCl溶液2.25 mL以終止反應(yīng)，并于340 nm處測(cè)定其吸光度A.

接枝度(DG)的計(jì)算公式如下：

式中，A樣和ρ樣分別為糖基化產(chǎn)物的吸光度及蛋白質(zhì)含量(g/L)，A白和ρ白分別為大豆7S球蛋白的吸光度及蛋白質(zhì)含量(g/L).

1.3.5 內(nèi)置熒光光譜分析方法

內(nèi)置熒光光譜分析參照文獻(xiàn)[21]中的方法.用5 mmol/L的磷酸標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(pH=7.0)配制糖基化產(chǎn)物及對(duì)照樣待測(cè)液(蛋白質(zhì)含量為1 g/L)，在激發(fā)波長(zhǎng)334 nm處用熒光分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行發(fā)射波長(zhǎng)掃描(350～500 nm)，記錄各樣品的熒光光譜.電壓為600 MV，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均設(shè)置為5 nm.

1.3.6 濁度的測(cè)定

濁度測(cè)定根據(jù)Damodaran等[22]的方法.分別稱取一定量的大豆7S球蛋白、混合物和糖基化產(chǎn)物溶于不同pH值的水溶液中(樣品蛋白質(zhì)含量為2 g/L)，于540 nm處測(cè)定吸光值.

1.3.7 圓二色光譜分析方法

用0.01 mol/L的磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(pH=7.0)溶解一定量的待測(cè)樣品(蛋白質(zhì)含量為0.1 g/L)，掃描波長(zhǎng)設(shè)定為190～250 nm，所用樣品池的光程為2 mm.圓二色光譜(CD)測(cè)定時(shí)所用的分辨率為0.5 nm，掃描速度為100 nm/min，靈敏度為10 °/m，實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃.實(shí)驗(yàn)值取6次掃描的平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE結(jié)果及分析

采用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物的形成，結(jié)果如圖1所示.圖1(a)中泳道2(蛋白質(zhì)染色)和圖1(b)中泳道2(糖染色)都是典型的7S球蛋白特征條帶.圖1(a)和1(b)中泳道6-9的分離膠的頂部均有多分散性條帶形成.蛋白質(zhì)染色和糖染色的一致性說(shuō)明，在組分MC48、MC65、DH48和DH65中，7S球蛋白和葡聚糖之間均發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)，生成了高分子質(zhì)量的共價(jià)復(fù)合物.泳道5中的特征條帶與7S球蛋白的(泳道2)無(wú)異，說(shuō)明沒(méi)有經(jīng)過(guò)加熱處理的7S球蛋白-葡聚糖混合物不會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng).在液相環(huán)境和干熱狀態(tài)下，7S球蛋白經(jīng)加熱處理后，α、α′和β亞基條帶明顯減弱(見(jiàn)泳道3、4)，而在分離膠的頂部有新的大分子質(zhì)量物質(zhì)產(chǎn)生，這說(shuō)明單純的加熱處理使得7S球蛋白發(fā)生自聚集反應(yīng)；泳道3中亞基條帶變淡程度比泳道4中明顯，說(shuō)明液體環(huán)境下7S球蛋白自聚集程度更加顯著.

圖1 不同反應(yīng)條件下的蛋白質(zhì)和糖染色的電泳圖譜

Fig.1 Electrophoretograms with protein and carbohydrate staining under different reaction conditions

1—對(duì)照物；2—7S；3—7S，水浴(95 ℃，6 h)；4—7S，干熱(60 ℃，4 d)；5—7S+葡聚糖混合物(未加熱)；6—MC48；7—MC65；8—DH48；9—DH65

大分子擁擠體系中，在樣品上樣量相同的條件下，糖染色的特征條帶顏色程度相當(dāng)(見(jiàn)圖1(b)中泳道6和7)，而蛋白質(zhì)染色(見(jiàn)圖1(a))泳道6的顏色明顯較泳道7淺.由于葡聚糖不帶電荷，未接枝的葡聚糖自身在凝膠電泳中不能向下移動(dòng)，因此不會(huì)干擾糖染色，這說(shuō)明糖染色電泳圖中的泳道6對(duì)應(yīng)的是接枝到7S球蛋白的葡聚糖，并且在MC48中，共價(jià)接枝在7S球蛋白上的葡聚糖比例要高于組分MC65.共價(jià)接枝結(jié)合了更多的葡聚糖鏈，使得MC48在7S球蛋白等電點(diǎn)下的溶解性提高，變?yōu)榭扇芙M分.同時(shí)，圖1(a)中泳道6和7的α、α′和β亞基條帶明顯減弱，條帶的下端有小分子物質(zhì)生成，這說(shuō)明在液體環(huán)境下7S球蛋白發(fā)生了一定程度的水解，這與圖1(a)中泳道3的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明7S球蛋白在液相環(huán)境下會(huì)分解成小分子的肽鏈，而經(jīng)過(guò)糖基化反應(yīng)和pH4.8、pH6.5環(huán)境下的沉淀分離后，留在組分MC48中的主要是接枝程度較高的大分子質(zhì)量糖基化產(chǎn)物，留在組分MC65中的則是不同接枝程度的較小分子質(zhì)量的糖基化產(chǎn)物.

對(duì)比大分子擁擠環(huán)境，干熱法制備得到的組分DH48和DH65在電泳條帶上的差異不及大分子擁擠環(huán)境下的兩種組分顯著，這說(shuō)明DH48和DH65的糖基化程度差異不及MC48、MC65的顯著，7S球蛋白上共價(jià)結(jié)合的葡聚糖數(shù)目相差不大.

2.2 接枝度測(cè)定結(jié)果及分析

Maillard反應(yīng)基于反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生的Amadori重排，使蛋白質(zhì)分子中游離氨基基團(tuán)連接到多糖分子的還原端.文中用接枝度來(lái)表征體系游離氨基的變化，從而表征蛋白質(zhì)與多糖的Maillard反應(yīng)的程度.

圖2所示為不同反應(yīng)條件下糖基化產(chǎn)物的接枝度變化.由圖可知，大分子擁擠環(huán)境下制備的糖基化物接枝度均高于干熱條件下制得的產(chǎn)物.MC48、MC65、DH48和DH65的接枝度分別為46.02%、21.58%、18.03%和8.03%.結(jié)合SDS-PAGE電泳圖譜分析可知，在大分子擁擠環(huán)境下，7S球蛋白在液相環(huán)境中加熱處理后發(fā)生了一定程度的水解，分子結(jié)構(gòu)的展開(kāi)為糖鏈的共價(jià)接枝提供了更多的位點(diǎn)，使接枝度提高.

圖2 不同反應(yīng)條件下的糖基化產(chǎn)物的接枝度

Fig.2 DG of glycosylated products under different reaction conditions

2.3 濁度結(jié)果及分析

大豆7S球蛋白聚集至一定程度的蛋白質(zhì)溶液，其顆粒直徑會(huì)變大，導(dǎo)致濁度升高[23].圖3顯示了兩種方法制備得到的共價(jià)復(fù)合物以及它們的對(duì)照樣在不同pH值下的濁度變化.由圖3(a)和3(b)可知，大豆7S球蛋白在等電點(diǎn)(pH=4.8)處附近的濁度最高，單純加入葡聚糖后，濁度有所下降，這說(shuō)明單純加入多糖對(duì)大豆7S球蛋白的聚集有一定的削弱作用；而糖基化物的濁度與大豆7S球蛋白相比有明顯的降低趨勢(shì)，這說(shuō)明多糖共價(jià)接枝在蛋白質(zhì)分子表面能有效減少大豆7S球蛋白的聚集，這與張曦[24]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子表面共價(jià)結(jié)合親水性較強(qiáng)的多糖分子會(huì)使得大豆7S球蛋白整體的親水性提高，溶解性增強(qiáng)，濁度降低.同時(shí)由于多糖的空間排阻效應(yīng)削弱了蛋白質(zhì)分子間的靜電結(jié)合作用，最終達(dá)到減少蛋白質(zhì)分子聚集的效果.

圖3 共價(jià)復(fù)合物和對(duì)照樣的濁度

在大分子環(huán)境下制備得到的兩種組分的濁度差異要大于干熱法制得的兩種組分.結(jié)合接枝度分析結(jié)果可知，在大分子環(huán)境下制得的兩種組分的接枝程度差異較大，導(dǎo)致濁度差異顯著.而干熱法制備得到的組分接枝度差異不明顯，導(dǎo)致濁度差異不顯著.

2.4 內(nèi)置熒光光譜結(jié)果及分析

Maillard反應(yīng)中一個(gè)顯著的特征是有色物質(zhì)的生成，而熒光物質(zhì)是Maillard反應(yīng)高級(jí)階段有色物質(zhì)的前體物.通過(guò)對(duì)內(nèi)源熒光強(qiáng)度的比較，可以進(jìn)一步反映糖基化反應(yīng)的程度[25].

如圖4所示，在其他條件相同的情況下，大分子擁擠環(huán)境下得到的糖基化產(chǎn)物在43 nm處的熒光強(qiáng)度均大于干熱法制得的產(chǎn)物，其中MC48的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，說(shuō)明該組分的美拉德反應(yīng)程度最高，MC65次之.干熱條件下，同樣是pH=4.8時(shí)制得的可溶組分的熒光強(qiáng)度較大，pH=6.5時(shí)制得的次之，這也與2.2節(jié)中接枝度的結(jié)果相一致.

圖4 共價(jià)復(fù)合物和對(duì)照樣的內(nèi)置熒光光譜

Fig.4 Intrinsic fluorescence emission spectra of conjugates and contrast samples

MC-H7S：大分子擁擠環(huán)境下7S熱處理；DH-H7S：干熱條件下7S熱處理；下同

由大分子擁擠體系和干熱法制得的產(chǎn)物差異性分析可知，干熱反應(yīng)體系是一種固―固非均相反應(yīng)體系，只有當(dāng)多糖分子中的還原性醛基有機(jī)會(huì)與蛋白質(zhì)中的伯氨基接觸時(shí)才會(huì)發(fā)生化學(xué)作用.在這種環(huán)境下，固相反應(yīng)物間的實(shí)際接觸面積較小，且反應(yīng)物間的接觸不均勻、不充分，反應(yīng)受到限制，產(chǎn)物性能差別較大.在液相體系中，蛋白質(zhì)與多糖之間接觸的幾率更大，在相對(duì)較短的反應(yīng)時(shí)間下，反應(yīng)的程度更高，且各組分性能較均勻[26].

2.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

采用圓二色光譜來(lái)研究不同組分蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化.由圖5(a)可知，大分子體系中，糖基化后在不同pH值下分離出的組分蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大，由7S和混合物的圓二色光譜曲線能看出明顯的α-螺旋和β-折疊有序結(jié)構(gòu)(α-螺旋的CD譜在192 nm附近有一正峰，在208、222 nm處有2個(gè)負(fù)的特征肩峰；β-折疊在216～218 nm處有一負(fù)峰，在185～200 nm處有一強(qiáng)的正峰)，7S加熱后負(fù)峰振幅明顯增大，表明7S生成了更多的β-折疊結(jié)構(gòu)，王金梅[27]和王昌盛[28]的研究也表明，加熱能使蛋白質(zhì)的β-折疊結(jié)構(gòu)增加.MC45在198 nm附近有一負(fù)峰，在220 nm附近有一小而寬的正峰，是典型的無(wú)規(guī)則卷曲特征圖譜，結(jié)合之前的分析，這可能是因?yàn)镸C48在糖基化反應(yīng)過(guò)程中結(jié)合了更多的糖鏈，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較大程度地伸展開(kāi)來(lái)，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序轉(zhuǎn)變?yōu)橐詿o(wú)規(guī)則卷曲為主.而對(duì)比大豆7S球蛋白，MC65的負(fù)峰有少許下降，說(shuō)明MC65的二級(jí)結(jié)構(gòu)因?yàn)樘墙又Πl(fā)生了一定的變化，但效果沒(méi)有MC48顯著.孫常雁[29]在研究乳清蛋白-葡聚糖的CD光譜時(shí)也發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白分子中接入的葡聚糖分子數(shù)量越多，蛋白質(zhì)分子舒展程度越大，即越能打開(kāi)蛋白質(zhì)原有的有序緊密結(jié)構(gòu)，最終影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)[30- 31].

圖5 不同反應(yīng)條件下的糖基化產(chǎn)物的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜

Fig.5 Far-UV CD spectra of conjugates and contrast samples under different reaction conditions

由圖5(b)可知，干熱體系各組分的CD圖譜沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明干熱條件下糖基化產(chǎn)物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化不大.結(jié)合接枝度結(jié)果可知，該反應(yīng)體系下所得接枝產(chǎn)物的糖基化程度不高，這也是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著變化的重要原因.

3 結(jié)論

文中用大分子擁擠體系和干熱法制備7S-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物，根據(jù)糖基化產(chǎn)物在7S等電點(diǎn)(pH=4.8)和中性條件(pH=6.5)下的溶解性差異進(jìn)行分離分級(jí).通過(guò)SDS-PAGE、圓二色光譜、內(nèi)置熒光光譜、濁度等分析手段系統(tǒng)探討了不同糖基化產(chǎn)物的物化性質(zhì)差異，得出以下結(jié)論：

(1)在大分子擁擠體系下，與葡聚糖共價(jià)接枝后分別在pH=4.8和pH=6.5下沉淀分離得到的組分中，留在MC48中的主要是接枝程度較高的糖基化物，MC65中則是不同接枝程度且分子質(zhì)量較小的糖基化物.換言之，MC48中接枝的多糖鏈能夠完整地包裹在7S球蛋白分子表面，而MC65中多糖鏈部分包裹7S球蛋白，接枝度相對(duì)較低，由此可以推測(cè)，大分子擁擠體系得到的兩組分糖基化產(chǎn)物在后續(xù)的物性表征中會(huì)有明顯的不同.

(2)大分子環(huán)境下得到的糖基化物接枝程度高的主要原因是7S球蛋白在液體環(huán)境中發(fā)生了一定程度的水解，分解成小分子的肽鏈，為葡聚糖的共價(jià)接枝提供了更多的位點(diǎn).

(3)SDS-PAGE、圓二色光譜、內(nèi)置熒光光譜、濁度分析等的結(jié)果表明，大分子環(huán)境下制備得到的MC48和MC65物化性質(zhì)差異顯著，而干熱法制得的DH48和DH65的物化特性差異不明顯.

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Physicochemical Properties of Covalent Conjugates Prepared in Macromolecular Crowding Environment or via Dry-Heating Method

QiJun-ruWengJing-yiFengJi-luLiuQian-ruYangXiao-quan

(School of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China)

Two kinds ofβ-conglycinin-dextran conjugates were prepared respectively in the macromolecular crowding environment or via the dry-heating method,and then a comparison was made in their physicochemical property.On the basis of the solubility of glycation products at the isoelectric point ofβ-conglycinin (pH=4.8) or under the neutral condition (pH=6.5),the products were separated into two components,and then a discussion was conducted about the graft degree,secondary structure,internal fluorescence and turbidity of the two components.The results show that (1)β-conglycinin in the macromolecular crowding and liquid phase environment is hydrolyzed to a certain degree,with small peptide chains being produced,which is beneficial to the covalent access of polysaccharide; (2) MC48 obtained at pH4.8 in the macromolecular crowding environment,is mainly the glycation product of high graft degree,while MC65 obtained at pH6.5 in the macromolecular crowding environment,contains the glycation products of both low and uneven graft degree; and (3) DH48 and DH65 obtained respectively at pH4.8 and pH6.5 via the dry-heating method,are of low graft degree,and their difference is less significant than that in the macromolecular crowding environment.Moreover,it is found from SDA-PAGE,CD and intrinsic fluorescence emission spectra that there exists a significant difference in physicochemical property between MC48 and MC65,while an insignificant difference between DH48 and DH65.

β-conglycinin;dextran;physicochemical properties;macromolecular crowding environment;Maillard reaction

2015- 05- 08

國(guó)家自然科學(xué)基金青年面上連續(xù)資助項(xiàng)目(31370036) Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China(31370036)

齊軍茹(1977-),女,博士,副教授，主要從事蛋白質(zhì)物性修飾研究.E-mail: jrqi@scut.edu.cn

1000- 565X(2015)11- 0016- 07

TS 201.1

10.3969/j.issn.1000-565X.2015.11.003