紀純陽

(遼寧省楊樹研究所，遼寧　蓋州　115213)

楊樹基因工程育種研究進展

紀純陽

(遼寧省楊樹研究所，遼寧蓋州115213)

摘要:該文主要對國內外楊樹基因工程育種在抗蟲、抗病、抗除草劑、抗旱、抗逆、降低木質素及雄性不育等方面的研究進展進行了綜述，詳細介紹了各個方面近些年來的研究成果，并對楊樹基因工程育種中存在的問題及發(fā)展對策進行了討論。

關鍵詞:楊樹;基因工程;育種

楊樹不僅是重要的經濟樹種，在水土保持和維護生態(tài)環(huán)境方面也發(fā)揮重要的作用，我國現(xiàn)已成為世界上楊樹人工林面積最大的國家。楊樹因速生豐產、實用性強、分布廣、無性繁殖能力強、且基因組較小而成為研究林木生理和利用基因工程方法進行遺傳改良的理想模式植物。

1986年，Parson等人證實了楊樹可以進行遺傳轉化和外源基因在高等植物細胞中的表現(xiàn)以來，林木基因工程得到了迅速發(fā)展，尤其是楊樹的基因工程育種進展最為迅速。近年來國內外利用基因工程手段在楊樹良種選育研究方面取得了很大進展，尤其在抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆等方面。本文詳細對國內外楊樹基因工程育種研究進展進行了綜述，同時對存在的問題及發(fā)展對策進行了探討。

1　楊樹基因工程育種研究現(xiàn)狀

1.1抗蟲基因

抗蟲基因主要有2種:一種是蘇云金芽孢桿菌

(Bacillus thuringiensis)的δ-內毒素(δ-endotoxin)，簡稱Bt基因。另一種是蛋白酶抑制因子(Proteinase inhibitor)基因，簡稱PI基因，其中包括馬鈴薯蛋白酶抑制因子I(PI-I)、馬鈴薯蛋白酶抑制因子II(PIII)和豇豆胰蛋白酶抑制因子(CpTI)等，此外還有淀粉酶抑制劑基因和植物外源凝集素基因等。但目前的研究以農桿菌介導法轉化Bt基因為主。

1.1.1轉Bt基因McCown等用放射性基因槍法將Bt-Cry1Aa基因的融合基因導入銀白楊×大齒楊，獲得轉基因植株Bt-II，對舞毒蛾致死率達24%，天幕毛蟲致死率達60%，這是其他轉化方法中唯一成功的報道［1］。饒紅宇等通過根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導，將蘇云金桿菌毒蛋白基因Bt轉入楊樹NL-80106 (美洲黑楊×小葉楊)，獲得了再生植株，PCR分析結果表明，Bt基因已整合到基因組中，部分轉基因植株的殺蟲實驗表明，轉基因植株B45和B64對1齡舞毒蛾幼蟲有明顯抗性，飼喂轉基因楊樹葉片的幼蟲，其死亡率顯著

高于飼喂未轉基因楊樹葉片的幼蟲［2］。中國林業(yè)科學研究院將蘇云金桿菌殺蟲蛋白基因Bt導入歐洲黑楊，成功獲得了抗葉部害蟲的植株。幾年后再次用農桿菌對歐美楊葉片和莖段進行轉化，共獲得225株轉化再生植株，以舞毒蛾幼蟲進行測定，Bt毒蛋白基因已整合進入抗蟲植株的細胞DNA中，并表達出殺蟲活性［3］。姜靜等將蜘蛛殺蟲肽與Bt基因C肽序列的融合基因導入小黑楊中，轉基因株系表現(xiàn)出強烈的抗蟲效果，能顯著抑制舞毒蛾幼蟲的生長發(fā)育［4］。

高萍等用根癌農桿菌介導法，將Bt毒蛋白基因導入107楊的葉片及莖段外植體，經潮霉素抗性篩選，獲得了轉基因再生植株。提取轉基因植株的總DNA，經PCR擴增，部分植株呈陽性反應，證明目的基因已經整合到楊樹基因組中。以轉基因楊樹葉片飼喂天幕毛蟲幼蟲的殺蟲試驗結果表明，轉基因楊樹表現(xiàn)出一定的殺蟲活性［5］。

王連榮等用741楊和轉Bt-C ry1Ac基因741楊抗蟲株系Pb29互為接穗和砧木進行嫁接。結果表明Bt毒蛋白可以通過嫁接的方式在砧木和接穗間進行運輸。用各嫁接處理接穗葉片在室內喂飼楊扇舟蛾幼蟲，發(fā)現(xiàn)嫁接轉基因楊樹的非轉基因楊可提高對楊扇舟蛾幼蟲的致死率，延長發(fā)育歷期，表現(xiàn)出一定的抗蟲性［6］。

1.1.2轉蛋白酶抑制因子高等植物的蛋白酶抑制基因是近年來新興的抗蟲基因，在楊樹基因轉化中已有成功報道。郝貴霞等將廣譜抗蟲基因豇豆蛋白酶抑制劑(CpTI)基因導入毛白楊(Populus tomentosa Carr.) 1285雌株和毛新楊(P.tomentosa×P.bolleana)×毛白楊回交雜種，PCR鑒定和PCRSouthern檢測證實基因已整合進楊樹基因組中［7］。Massimo等利用農桿菌介導法將擬南芥半胱氨酸蛋白酶抑制基因Atcys導入白楊(Populus alba L.)中，獲得16株轉化植株，轉化率達到11%。Southern雜交和Northern雜交結果表明，Atcys基因已經整合入白楊的基因組中并正常表達。蟲試結果表明，轉基因植株能有效地抵抗楊樹的葉部害蟲［8］。

丁雙陽等研究了轉CpTI基因楊樹對美國白蛾幼蟲中腸解毒酶及乙酰膽堿酯酶的影響，結果酯酶、羧酸酯酶的活力受到明顯抑制，且隨時間的延長，抑制強度增加，飼喂48 h后，酶的活力分別比對照降低76.42%和73.91%;多功能氧化酶在飼喂的前12 h，表現(xiàn)為受到抑制，最大抑制率為35.78%，24 h后酶活力反而高于對照;谷胱甘肽轉移酶和乙酰膽堿酯酶活力也受到抑制，兩者表現(xiàn)及其相似，在飼喂后4 h抑制作用最強，酶活力分別比對照降低51.40% 和40.57%，但在整個試驗過程中，均沒有表現(xiàn)出隨時間加強的趨勢［9］。

1.1.3轉復合基因張冰玉等采用農桿菌介導法獲得8種銀腺雜種楊轉雙價抗蟲基因(Bt-Cry3A和OC-I)植株，其中轉基因株系BOGA-39對光肩星天牛幼蟲的毒殺和生長抑制作用顯著［10］。李明亮等通過農桿菌介導，將人工改造的蘇云金桿菌殺蟲結晶蛋白基因(Bt)轉化楊樹，得到楊樹再生植株，再將蛋白酶抑制劑基因(PI)導入已含Bt基因的轉基因楊樹，經PCR檢測和Southern雜交分析證明，最終獲得既含有Bt基因又含有蛋白酶抑制劑基因的轉基因楊樹植株。利用這種楊樹葉片飼喂舞毒蛾幼蟲的殺蟲試驗結果表明，轉基因楊樹具有明顯的殺蟲活性，而且含有Bt基因和蛋白酶抑制劑基因的雙基因植株，其抗蟲能力明顯高于僅含單一Bt基因的植株［11］。饒紅宇采用雙基因共轉法將經改造的Bt-Cry1Aa基因和CpTI基因轉入楊樹NL280106，獲得的轉雙價基因楊樹對1齡舞毒蛾幼蟲有明顯的殺蟲活性［12］。

諸葛強等以南林895楊為轉基因受體材料，以嫩芽或腋芽為外植體材料組織培養(yǎng)再生植株，利用農桿菌介導法轉化Bt基因和CpTI基因。經培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的植株經PCR分析，篩選獲得了18株整合有Bt基因和1株整合有CpTI基因的轉基因植株。部分轉基因植株的初步飼蟲實驗表明飼喂轉基因楊樹葉片可明顯抑制楊小舟蛾的生長發(fā)育［13］。

1.2抗病基因

植物的抗病基因主要有2種:抗病毒基因和抗菌基因?？共《净虻难芯恐饕强寺〔《就鈿さ鞍谆?，通過病毒外殼蛋白基因的導入，并借助交叉保護作用機理，達到降低病毒侵染的目的?？咕蛑饕袔锥≠|酶基因、抗菌肽基因和防御素基因。1.2.1抗病毒基因Cooper研究人員克隆出楊樹花葉病毒的外殼蛋白(PMV-cp)基因，并導入楊樹中，可在楊樹體內產生cp蛋白，對楊樹PMV的侵染起到一種類似于免疫學的交叉保護作用［14］。

1.2.2抗菌基因Harvey研究小組對創(chuàng)傷反應基因在毛果楊×美洲楊無性系中表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)楊樹損傷后產生了3種新的轉錄子mRNA，其中轉錄子win6和win8所編碼的幾丁質酶可以降解侵

染楊樹的真菌或細菌的細胞壁，win3轉錄子所編碼的多肽與豆科種子的蛋白酶抑制劑相似具有抑制昆蟲的功能。并已將win6基因與GUS報告基因融合，應用于楊樹抗病基因的遺傳轉化，但尚未有成功的報道［15］。Liang等將小麥的草酸鹽氧化酶基因(OxO)與CaMV35S啟動子連接，轉化雜交楊樹無性系Populus×euramericana，提高了轉化植株的抗病和抗脅迫能力［16］。Mentag等利用農桿菌介導法將編碼17個氨基酸的抗菌肽基因D4E1轉入雜交楊樹(Populus tremula L.×P.alba L.)中，PCR和Northern雜交檢測表明，D4E1基因已整合入雜交楊樹的核基因組中，轉化植株對多種病菌均有明顯抗性［17］。

1.3抗除草劑基因

Chupeau等以雜種楊(P.tremula×P.alba)葉片原生質體為受體，采用電擊法轉化乙酰乳酸合成酶(Als)突變基因，獲得了抗磺胺脲類除草劑的工程植株;轉化乙酰轉移酶(Pat)基因，獲得了抗草苷膦類除草劑的工程植株［18］。Gullner等將編碼抗除草劑乙酰替綠苯胺(Chloroacetanilide)的谷酰丙氨酶(GST)基因轉入楊樹雜交種內，轉基因植株葉片富含C-GST和谷胱氨酶(GSH)，楊樹的除草劑抗性得到提高［19］。Confalonieri等報道獲得了高抗草苷膦類除草劑Basta的轉基因白楊(P.alba L.)［19］。

1.4抗逆基因

1.4.1抗凍基因利用基因工程培育轉基因抗凍楊樹的研究尚在探索階段。Arisi等用擬南芥的Fe-SOD基因轉化楊樹，發(fā)現(xiàn)轉基因楊樹不僅葉綠體中Fe-SOD活性高于對照5～8倍，而且楊樹的抗凍性也明顯提高［20］。李春霞從胡蘿卜中克隆出抗凍蛋白(AFP)基因并對山楊進行了遺傳轉化，獲得4株卡那霉素抗性苗，經PCR檢測分析，其中1株呈陽性，初步表明AFP基因已經整合到山楊基因組中［21］。

1.4.2抗旱基因崔旭東等以歐美楊渤豐1號為試驗材料，在對其組織培養(yǎng)再生體系進行優(yōu)化的基礎之上，采用基因槍法對其進行5個抗旱相關基因——轉錄因子基因JERF36基因、ZxZF基因、AREB基因和功能基因SacB基因、GST基因的共轉化，培育出具有強抗旱性的轉基因楊樹新品種，同時，對外源基因在受體材料基因組上的整合特征進行深入探討，完善轉基因技術的理論基礎［22］。

1.4.3耐鹽堿基因楊傳平等將與甜菜堿合成有關的bet-A基因轉入小黑楊中，獲得陽性植株，Southern雜交結果表明，bet-A基因已整合進入小黑楊的基因組中，對轉化植株進行鹽脅迫，測定在不同的處理天數(shù)時，非轉基因植株與轉基因植株之間甜菜堿、脯氨酸、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的變化［23］。

樊軍鋒等利用葉盤轉化法首次開展了84 K楊雙價耐鹽基因mtlD/gutD的轉化研究，經誘導不定芽及誘導生根階段卡那霉素連續(xù)篩選，獲得了16株卡那霉素抗性植株。經PCR檢測，有4株呈陽性。耐鹽實驗表明，3株陽性植株抗NaCl能力，較對照有不同程度提高［24］。

宋建等以鹽漬生境下1～2年生107和18-1楊樹為材料，對不同樹齡和地徑的楊樹各營養(yǎng)器官中Na+、K+分布變化進行了研究。結果表明，在鹽漬生境中種植的含NTHK1的轉基因18-1楊樹比107楊樹更加耐鹽，可以更好地抵御鹽脅迫，維持離子平衡，NTHK1基因可能是通過增強轉基因楊樹聚集有害Na+至液泡的能力，以避免細胞質中過高的Na+對細胞造成傷害，從而提高了轉基因植株的耐鹽性［25］。

孫偉博等將大豆中編碼Na+/H+離子逆向轉運蛋白的GmNHX1基因構建到植物表達載體pGWB402Ω，通過農桿菌侵染葉盤法轉化南林895楊樹，PCR檢測和Southern雜交結果表明，GmNHX1基因已經整合入南林895楊樹基因組。對轉GmNHX1基因的南林895楊樹耐鹽性的生理生化指標進行檢測，結果表明GmNHX1基因的表達能夠提高轉基因楊樹的耐鹽性［26］。

1.5降低木質素基因

Hu等從白楊中克隆得到4CL基因，通過反義抑制使木質素的含量降低了45%，而纖維素的含量卻升高了15%，并能夠大大促進白楊的生長［27］。魏建華等將毛白楊(Populus tomentosa Carr.)的CCoAOMT(caffeoyl CoAO-methyltransferase)基因構建了反義表達載體轉化雜交楊(P.tremula×P.alba)，發(fā)現(xiàn)移栽5～6個月的轉基因植株的木質素含量比未轉基因對照楊樹下降17.9 %［28］。

薛英喜在輔酶A連接酶(4CL)基因楊樹和轉反義咖啡酰輔酶A3-0-甲基轉移酶(CCoAOMT)基因楊樹基礎上，對反義抑制木質素單體合成酶基因的轉基因楊樹木材進行了酶解分析，顯示5年生楊樹，供試轉基因楊樹的木質素含量均明顯低于非轉基因對

照;并且即使總木質素含量降低10%，仍未對轉基因楊樹的生長速度和生物質產量造成明顯影響。成熟木材中，抑制CCoAOMT基因表達的轉基因楊樹植株糖化效率顯著提高，而抑制4CL基因表達的轉基因楊樹植株糖化效率并無顯著改變;經烘干、抽提的莖糖化產量與酸溶木質素呈負相關。說明降低酸溶木質素含量可以明顯提高生物燃料生產中糖化效率，提高糖化產量［29］。

1.6雄性不育基因

李玲等將TA29-Barnasf基因導入抗蟲的轉基因歐洲黑楊(P.nigra)基因組中，轉TA29-Barnasf基因雄性楊樹在田間表現(xiàn)出了高度不育［30］。于來等將不育結構35S-PtAP3-IR-NOS轉入到毛白楊中，經檢測表明陽性植株中AP3，LFY，PI基因的表達受到明顯抑制，對毛白楊花發(fā)育將起到一定的抑制作用，本研究為利用轉基因手段獲得不育材料提供了依據(jù)［31］。

1.7其他基因方面

尹吳等以轉PEPC基因南林895楊和對照(南林895楊)為材料，分析不同轉基因植株的光合生理參數(shù)。結果轉PEPC基因楊樹與C4光合途徑相關的酶活性比對照增高，PEPC活性增加較為明顯，最高達38.6%。轉PEPC基因楊樹表現(xiàn)較強的對強光利用能力，其光飽和點比對照提高約10%～20%，飽和點時的光合速率比對照高17.7%～58.1%。轉PEPC基因楊樹光補償點低于對照，利用弱光的能力增強; CO2的利用效率較高。此外，轉基因楊樹羧化效率增高，比對照增加最高達62.3%［32］。

2　楊樹基因工程育種存在的問題

轉化效率低、實驗重復性差是楊樹基因工程育種過程中存在的主要問題。由于受氣候、環(huán)境、人為、實驗操作等因素影響，轉基因楊樹轉化效率極低。結合雜交育種的工作經驗，每年春季根據(jù)楊樹花枝的伸展情況，僅能進行1～2批花粉管導入外源DNA基因的雜交育種試驗，而且得到的后代僅有幾株是含有外源基因。這就要求根據(jù)轉化植株自身的特點，結合特定的試驗轉化方法，從實驗技術因素到環(huán)境因素方面創(chuàng)造有利的轉化條件，提高轉化效率。

外源基因的插入是隨機的，這種偶然性對基因組本身和在DNA/RNA蛋白質及生物性狀上的表達都會產生很大的影響。外源基因導入受體內部，只為轉基因利用提供了可能性，而受體的表達受到一系列生理生化過程的影響，以復雜的遺傳方式表達出來。在實際工作中，通過花粉管導入柳樹DNA基因的雜交育種實驗中，得到的后代在幼苗期有幾株葉形和柳樹接近，但隨著苗木的生長，慢慢的有的植株有了楊樹的葉形，而DNA結構還有待進一步的測定。在早期表達過程中將不能正常表達和表達低的轉化植株直接淘汰，增加表達的穩(wěn)定性。隨著科技的發(fā)展，能夠定點的插入外源基因，保持優(yōu)良的性狀遺傳是未來基因工程育種的發(fā)展方向。轉基因植株性狀變異的研究對優(yōu)良品種的選擇具有重大意義。

3　發(fā)展對策

目前導入楊樹中的抗性基因大多是來源于微生物、植物、控制單一性狀的基因。而楊樹的一些性狀(如抗旱、抗凍等)大都是多基因控制的。結合楊樹轉抗寒基因的試驗，抗寒基因設想從很多抗寒植物中提取，但是只有從山葡萄中提取到了抗寒基因。因此，如何根據(jù)林木自身的特點，研究、發(fā)掘適合于楊樹抗性提高的主基因，將是今后楊樹基因工程抗性育種的關鍵所在。

目前轉抗性基因研究多集中在抗蟲基因方面，而在抗逆基因、木質素基因及雄性不育基因等方面研究還很少。未來的趨勢是增加轉基因在其他方面的研究，同時增加雙價抗性基因(甚至是多價抗性基因)的研究。育種工作重點轉移到其他抗性轉基因上，能夠選育出更適合的楊樹新品種。

轉基因楊樹被應用于實際種植時要考慮它的生物安全性問題。轉基因楊樹對人與環(huán)境可能產生危害產生新型有害生物、新的過敏原、基因污染等。作者培育出的轉基因植株目前處于幼齡期，還未涉及到生物安全性問題。通過新型技術的開發(fā)，未來的楊樹基因工程育種更能保證轉化植株的生物安全性。

基因工程育種將成為未來楊樹發(fā)展的一個重要趨勢。將現(xiàn)代生物技術手段與常規(guī)育種方法相結合，不斷改良出新品種，是今后發(fā)展楊樹產業(yè)的主要方向。實現(xiàn)轉基因楊樹的合理化和產業(yè)化，必將產生巨大的經濟效益、社會效益和生態(tài)效益。

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Research advances on genetic engineering breeding of poplar

JI Chun-yang

(Liaoning Provincial Institute of Poplar，Gaizhou 115213)

Abstract:The research progress and achievements made in poplar genetic modification breeding in recent years are summarized in terms of pest resistance，disease resistance，herbicide resistance，drought resistance and another stress resistance，lignin reduction，and male sterility.Some existent problems were discussed and corresponding countermeasures offered.

Key words:Poplar; Gene engineering; Breeding

作者簡介:紀純陽(1982－)，男，遼寧遼陽人，工程師，主要從事楊樹生物技術及育種研究工作。E-mail: jichunyang19820125@163.com。

基金項目:遼寧省科學事業(yè)公益研究基金項目“楊樹轉抗寒調控基因育種研究”(2014002016)

收稿日期:2015-02-12;修回日期:2015-03-10

文章編號:1001－7380(2015) 02－0050－05

中圖分類號:S792.11; Q943.1

文獻標識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1001－7380.2015.02.012