李 明 綜述，劉躍亮 審校

(1.重慶市巫溪縣人民醫(yī)院檢驗科 405800；2.重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院，重慶 400000)

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·綜 述·

泛素蛋白酶體抑制劑的分子機制

李 明1綜述，劉躍亮2審校

(1.重慶市巫溪縣人民醫(yī)院檢驗科 405800；2.重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院，重慶 400000)

泛素化； 蛋白酶復合物； 抑制劑； 分子機制

生物體細胞在精細的調(diào)節(jié)之下進行蛋白質(zhì)合成，這有助于維持機體細胞的正常增殖、分化和代謝運轉(zhuǎn)，以及選擇性地降解多余無用的蛋白質(zhì)。泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，是機體內(nèi)蛋白質(zhì)降解的另一主要方式。該系統(tǒng)步驟多、過程復雜，主要包括底物蛋白質(zhì)的多泛素化修飾和26S蛋白水解酶復合物對底物蛋白質(zhì)的降解。由機體細胞自然識別程序識別出需要降解的蛋白質(zhì)，泛素蛋白分子通過共軛雙鍵與底物蛋白質(zhì)連接形成標簽蛋白(即泛素降解底物蛋白質(zhì))，再被26S蛋白水解酶復合物系統(tǒng)識別并水解。針對泛素化蛋白酶降解系統(tǒng)的抑制劑(即泛素蛋白酶體抑制劑)，不僅可以促進機體有害代謝物的清理，還表現(xiàn)出明顯的抗癌效果，該抑制劑已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準作為部分實體性腫瘤治療的一線用藥。但是，眾多臨床試驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該抑制劑具有不可忽略的不良反應且不具有經(jīng)口服的生物可利用特性，這在很大程度上影響其廣泛地應用于臨床。本文就泛素蛋白酶體抑制劑的分子機制進行綜述，為其在新藥開發(fā)、臨床前試驗研究和實體性腫瘤的臨床治療評估提供理論依據(jù)。

1 泛素化、去泛素化和蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)

細胞內(nèi)環(huán)境或外界環(huán)境中某些信號分子的刺激啟動細胞凋亡程序，再通過識別需要降解的蛋白質(zhì)，如損傷的蛋白質(zhì)或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，以及無生物功能的廢棄蛋白質(zhì)等，啟動泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。泛素化蛋白質(zhì)降解主要通過兩個步驟來完成：底物蛋白質(zhì)(即待降解蛋白質(zhì))的多泛素化和以水解方式降解底物蛋白質(zhì)[1]。該過程包括許多其他蛋白質(zhì)和酶的參與、復雜而精細的蛋白質(zhì)間的作用和其他生化反應。

1.1 泛素化蛋白酶復合體 泛素化蛋白酶復合體主要由泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)和泛素連接酶(E3)構成。在所有泛素化修飾的類型中，研究較透徹的是第48位賴氨酸連接的泛素化修飾(K48)和第63位賴氨酸連接的泛素化修飾(K63)。前者的主要功能是對底物蛋白質(zhì)進行標記，使蛋白酶體能夠特異地識別并降解被修飾的蛋白；后者的主要功能是通過修飾作用賦予底物蛋白質(zhì)新的生物功能而不會導致其降解，如使其具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運或開啟其他信號通路的功能。

1.2 底物蛋白質(zhì)的多泛素化 多泛素化修飾過程主要包括：(1)泛素活化，即泛素分子的C末端與E1半胱氨酸殘基共價連接形成硫酯鍵。具體過程：胞質(zhì)中存在的游離的、由76個氨基酸構成的泛素分子在三磷腺苷(ATP)的參與下被泛素活化酶激活后，泛素分子的第76位甘氨酸(Gly)與泛素活化酶上特殊的半胱氨酸(Cys)殘基形成一個高能硫酯鍵，然后將轉(zhuǎn)酯作用活化的泛素分子從泛素活化酶轉(zhuǎn)移到泛素結合酶的Cys上[2]，釋放出泛素活化酶，形成泛素結合酶-泛素復合物，使底物蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化。(2)在E3連接酶參與下，泛素分子從泛素結合酶-泛素復合物上脫離，通過共價連接的硫酯鍵連接到底物蛋白質(zhì)的賴氨酸(Lys)殘基上，形成泛素-底物蛋白質(zhì)復合物。最后，多個泛素分子重復地連接到已經(jīng)被泛素化的待降解蛋白質(zhì)，形成多泛素鏈。E3連接酶是指環(huán)狀結構，其主要功能是拉近E2結合酶與底物之間的距離，最終使泛素充分接近底物蛋白質(zhì)的Lys殘基；少數(shù)E3連接酶含有HECT結構域[3]，其在轉(zhuǎn)移泛素分子到底物蛋白之前，先與泛素通過共價結合為中間體，促進繼續(xù)泛素化，由單泛素化延長成多泛素鏈。通常至少需要4個泛素殘基，才能被26S蛋白酶體識別并降解目的蛋白質(zhì)[4]。

1.3 泛素介導的蛋白質(zhì)水解 有機生物體內(nèi)負責聚泛素化蛋白質(zhì)降解的蛋白酶復合體是26S蛋白酶復合體，主要由具有催化功能的20S核心顆粒和具有受體作用的覆蓋其兩端蓋狀結構的19S調(diào)節(jié)顆粒組成。經(jīng)泛素活化的底物蛋白質(zhì)聚集到26S蛋白酶體周圍，與蛋白酶體19S的泛素受體相互作用，多泛素化蛋白質(zhì)被執(zhí)行去泛素化和打開蛋白質(zhì)的折疊結構，去折疊后的蛋白質(zhì)再通過兩個孔狀結構進入26S蛋白酶復合體的20S核心顆粒內(nèi)部。經(jīng)酶催化的多次切割，最終形成3～22個氨基酸殘基的小肽。與其他的翻譯后修飾類似，泛素化修飾是一個可逆的過程，泛素鏈能夠被去泛素化酶移除，分解為單個泛素分子被循環(huán)再利用。

1.4 去泛素化 去泛素，是指泛素化蛋白質(zhì)在特異性水解酶 (去泛素化酶) 的作用下，多泛素鏈被解離為單個泛素分子，可再次參與泛素化過程。去泛素化酶(DUB)與泛素化蛋白酶體復合物，在一定程度上存在競爭關系。DUB屬于蛋白酶體超家族，根據(jù)其催化亞基結構的不同，分為泛素C 末端水解酶家族(UCH)、含JAB1/PAB1/MPN 結構域的金屬蛋白酶家族(JAMM)、泛素特異性蛋白酶家族(USP)、卵巢癌蛋白酶家族(OTU)和MJD 結構域蛋白酶家族[5]。在真核細胞內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多種DUB，它們能利用活性硫醇位點將泛素與底物蛋白質(zhì)拆開[3]。DUB能水解泛素和底物蛋白質(zhì)之間的硫酯鍵，還能把錯誤識別的底物從泛素化復合體中釋放出來，并重新釋放出泛素分子。19S蛋白酶體的底座蛋白質(zhì)成分在打開底物蛋白質(zhì)折疊結構后，具有運輸未折疊的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)移去泛素化底物蛋白到催化核心顆粒等作用。20S核心催化顆粒由4層指環(huán)狀結構的蛋白質(zhì)包裹[6]。外層指環(huán)狀結構由7個α亞單位構成，分別是α1～α7，而內(nèi)層為7個β指狀結構，分別為β1～β7，β1亞單位具有半胱氨酸蛋白酶樣(C-L)水解活性，β2具有胰蛋白酶樣(T-L)水解活性，β5亞單位表現(xiàn)糜蛋白酶(CT-L)活性[7]。

2 泛素-蛋白酶體抑制劑相關的信號通路

2.1 人乳頭瘤病毒(HPV)感染與p53蛋白的泛素化 p53是一種腫瘤抑制蛋白質(zhì)，具有轉(zhuǎn)錄因子作用，參與細胞周期抑制調(diào)節(jié)，可誘導細胞凋亡。p53表達水平是在泛素蛋白酶系統(tǒng)的嚴密調(diào)控下進行的[8]。HDM2是一個指狀的E3連接酶，與p300/CBP組合為一種復合物，促進多泛素化和p53蛋白的快速降解[9]。因此，在抗腫瘤治療研究中，抑制p53蛋白與HDM2蛋白的相互作用及抑制蛋白酶體活性成為研究的關鍵點，可通過這種方案來增加p53蛋白的細胞內(nèi)水平。當然，前提是腫瘤細胞可以表達野生型的p53蛋白。但是，多數(shù)腫瘤細胞都發(fā)生了p53基因的突變或缺失，因此給抗腫瘤藥物的設計帶來了限制。研究表明HPV自身的E6蛋白(HPV-E6)及相關蛋白具有HECT結構域E3連接酶作用，可促進泛素化蛋白酶體對p53蛋白的降解。p53蛋白很容易通過HPV-E6蛋白介導的程序發(fā)生轉(zhuǎn)移，使HPV感染相關腫瘤，如多數(shù)的子宮癌和越來越多的頭頸部腫瘤，具有低選擇性的突變或缺失p53基因[8，10]。所以，幾乎所有的HPV感染陽性的宮頸癌和頭頸部腫瘤都保留著表達野生型p53蛋白的特性。由此認為，如果抑制HPV病毒E6蛋白酶表達，在一定程度上，可以促進野生型p53蛋白在HPV陽性實體腫瘤的表達增強。

2.2 細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑p27泛素化 細胞周期素與蛋白激酶(CDK)的生物活性狀態(tài)密切相關，可促進CDK的活化和細胞周期運行。約超過15種細胞周期素存在于人類基因組[7]。細胞周期素表達水平是轉(zhuǎn)錄誘導和蛋白酶體降解嚴密調(diào)控的結果。抑制蛋白酶體降解活性，可導致細胞周期蛋白的異常表達，從而促進不恰當?shù)腃DK活化、啟動細胞周期進程，導致細胞周期紊亂。這一特點可以為腫瘤治療提供有用的研究靶點，如啟動細胞凋亡和程序性的有絲分裂中斷機制。另外，p27蛋白對調(diào)節(jié)靜止期細胞進入細胞周期有著重要的作用[10]。由轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)介導的細胞與細胞之間的相互作用所引起的細胞周期抑制，部分由p27蛋白參與。泛素化蛋白酶體降解p27蛋白后，可以恢復細胞周期進程，該生物現(xiàn)象通過一系列復雜的生化反應完成，其中涉及環(huán)指狀E3連接酶與SCFSkp2 復合[11]。另有研究表明，E3連接酶片段SCFSkp2復合物的生物活性需要泛素樣多肽蛋白NEDD8黏附到SCFSkp2復合物上形成蛋白復合物后，才能被泛素蛋白酶體所識別[12-13]。所以，致力于NEDD8蛋白抑制劑，可通過恢復p27蛋白的生物活性阻滯過度增殖的腫瘤細胞，使腫瘤細胞停滯于細胞周期的某一階段，為抗腫瘤研究提供新思路。

2.3 促凋亡蛋白Bcl-2蛋白家族泛素化降解 Li等[14]研究表明，抑制泛素化蛋白酶體可導致促凋亡蛋白Bcl-2蛋白家族成員高表達，包括Noxa、Bax和Bik等蛋白表達上調(diào)。此外，關于使用反義寡核苷酸或干擾RNA(siRNA)或短發(fā)夾RNA(shRNA)的研究已經(jīng)表明，在部分腫瘤的細胞模型中，如骨肉瘤、頭勁部腫瘤、結胞癌等，Bcl-2蛋白家族成員可通過泛素化蛋白酶體誘導降解的方式參與介導細胞凋亡[15-17]。在利用泛素蛋白酶體抑制劑處理部分實體性腫瘤細胞時，Noxa和Bax等蛋白質(zhì)表達增加時，p53表達水平提高，其具體機制尚不清楚。此外，泛素蛋白酶體抑制劑還可促進MCL-1蛋白質(zhì)(一種具有抗細胞凋亡作用的Bcl-2家族成員之一)的表達增加[18]。而MCL-1是一個直接的泛素化蛋白酶底物[19]，可以抑制細胞凋亡，泛素蛋白酶體抑制劑和MCL-1表達抑制劑共同處理腫瘤細胞，可增強泛素蛋白酶體抑制劑促進細胞凋亡的作用。事實上，MCL-1抑制劑，如obatoclax(GX15-070)或針對MCL-1蛋白表達的mRNA和shRNA，已經(jīng)被證明具有明顯提高泛素蛋白酶體抑制劑殺死血液系統(tǒng)腫瘤或?qū)嶓w腫瘤細胞的作用[20]。

2.4 腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體和NF-κB信號通路的泛素化抑制 死亡配體腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)與細胞質(zhì)膜受體DR4和DR5結合后，可誘導外源性細胞凋亡通路活化[20]。泛素化蛋白酶體抑制劑作用于部分腫瘤細胞后，表現(xiàn)出DR4和DR5的表達上調(diào)，從而增強對TRAIL受體的敏感性。臨床前實驗已經(jīng)表明，蛋白酶體抑制劑作用于TRAIL后，具有明顯的抑制實體腫瘤細胞增殖的效果。

多種血液性腫瘤和實體惡性腫瘤細胞內(nèi)，NF-κB因子處于過表達和(或)過度活化狀態(tài)。通常情況下，NF-κB以無活性形式存在，被胞質(zhì)中的內(nèi)源性抑制劑κB(IκB)所控制；活化后的NF-κB因子，可誘導多種與細胞增殖和存活相關基因的過表達和腫瘤組織血管生成異?；钴S。NF-κB被外源刺激物激活，涉及IκB的磷酸化、泛素化及蛋白酶體降解[21,24]。游離的NF-κB則遷移到細胞核內(nèi)并促進相關基因的轉(zhuǎn)錄。部分泛素化蛋白酶體抑制劑的抗腫瘤研究，也是針對抑制IκB的降解而抑制結構性活化的NF-κB因子的促癌作用。

3 小 結

泛素蛋白酶體抑制劑，在實體性腫瘤治療中已初見成效。目前，在抗實體性腫瘤的臨床研究中，第一代泛素蛋白酶體抵制劑，如硼替佐米已經(jīng)投入應用。而第二代抵制劑，主要針對第一代藥物的不足而研究設計，如增強抑制劑對實體性腫瘤細胞的敏感性，使其可以通過口服應用，或研究其他更利于開展臨床應用的方案。在作用機制方面，也增加了更多的抑制位點或通過對不同的生物信號通路進行調(diào)控，間接調(diào)控促進細胞凋亡與抑制細胞凋亡之間的平衡，如針對去泛素酶作用藥物的作用靶點，通過泛蛋白酵素來調(diào)節(jié)去泛素酶的水平[22]。而Chauhan等[23]研究表明，小分子物質(zhì)(P5091)可以作為泛蛋白酵素酶的抑制劑，對硼替佐米耐藥的腫瘤細胞，通過誘導其凋亡而產(chǎn)生抗實體性腫瘤的作用。Li等[24]研究證實泛素蛋白酶體抑制劑可誘導吞噬細胞對實體性腫瘤細胞的抗原提呈作用來發(fā)揮機體自身免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。此外，被誘導的吞噬細胞還具有增強正常細胞的生存能力和增加異質(zhì)細胞對抑制劑藥物的敏感性的作用?？傊核氐鞍酌阁w抑制劑的研究與應用，還需要大量的、有價值的研究工作和研究數(shù)據(jù)的支撐，因此應該積極地關注新的研究發(fā)現(xiàn)和進展。

[1]Shen M，Schmitt S，Buac D，et al．Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy[J]．Exp Opin Ther Targets，2013，17(9)：1091-1108．

[2]Zhang N，Chen T，Liu C，et al．Inhibition of ubiquitin protein expression and 20S proteasome activity by irbesartan prevents post-infarction ventricular remodeling and decreases TNF-α generation[J]．Biomed Rep，2013，1(6)：935-939．

[3]Spratt DE，Walden H，Shaw GS．RBR E3 ubiquitin ligases:new structures,new insights,new questions[J]．Biochem J，2014，458(3)：421-437．

[4]Gallastegui N，Groll M．The 26S proteasome:assembly and function of a destructive machine[J]．Trends Biochem Sci，2010，35(11)：634-642．

[5]Li J，D′Angiolella V，Seeley ES，et al．USP33 regulates centrosome biogenesis via deubiquitination of the centriolar protein CP110[J]．Nature，2013，495(7440)：255-259．

[6]Winkler LL，Hwang J，Kalejta RF．Ubiquitin-independent proteasomal degradation of tumor suppressors by human cytomegalovirus pp71 requires the 19S regulatory particle[J]．J Virol，2013，87(8)：4665-4671．

[7]Liu X，Xiao W，Wang XD，et al．The p38-interacting protein (p38IP) regulates G2/M progression by promoting α-tubulin acetylation via inhibiting ubiquitination-induced degradation of the acetyltransferase GCN5[J]．J Biol Chem，2013，288(51)：36648-36661．

[8]Chaturvedi AK，Engels EA，Pfeiffer RM，et al．Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States[J]．J Clin Oncol，2011，29(32)：4294-4301．

[9]Pan W，Lahue BR，Ma Y，et al．Core modification of substituted piperidines as Novel inhibitors of HDM2-p53 protein-protein interaction[J]．Bioorg Med Chem Lett，2014，24(8)：1983-1986．

[10]肖春海，吳娟芳．人類乳頭瘤病毒分型在宮頸早期病變中的臨床意義[J]．檢驗醫(yī)學與臨床，2012，9(22)：2794-2795．

[11]Chen L，Wu T，Wei TQ，et al．Skp2-mediated degradation of p27 regulates cell cycle progression in compressed human bladder smooth muscle cells[J]．Kaohsiung J Med Sci，2014，30(4)：181-186．

[12]Weathington NM，Mallampalli RK．Emerging therapies targeting the ubiquitin proteasome system in cancer[J]．J Clin Invest，2014，124(1)：6-12．

[13]Ungermannova D，Lee J，Zhang G，et al．High-throughput screening AlphaScreen assay for identification of small-molecule inhibitors of ubiquitin E3 ligase SCFSkp2-Cks1[J]．J Biomol Screen，2013，18(8)：910-920．

[14]Xu GW，Toth JI，da Silva SR，et al．Mutations in UBA3 Confer Resistance to the NEDD8-Activating Enzyme Inhibitor MLN4924 in Human Leukemic Cells[J]．PLoS One，2014，9(4)：1-10．

[15]Li T，Ho L，Piperdi B，et al．Phase II study of the proteasome inhibitor bortezomib (PS-341,Velcade) in chemotherapy-na?ve patients with advanced stage non-small cell lung cancer (NSCLC)[J]．Lung Cancer，2010，68(1)：89-93．

[16]Bedford L，Lowe J，Dick LR，et al.Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets[J]．Nat Rev Drug Discov，2011，10(1)：29-46．

[17]van Dijk M，Murphy E，Morrell R，et al．The proteasome inhibitor bortezomib sensitizes AML with myelomonocytic differentiation to TRAIL mediated apoptosis[J]．Cancers，2011，3(1)：1329-1350．

[18]Kahana S，F(xiàn)inniss S，Cazacu S，et al．Proteasome inhibitors sensitize glioma cells and glioma stem cells to TRAIL-induced apoptosis by PKCε-dependent downregulation of AKT and XIAP expressions[J]．Cell Signall，2011，23(8)：1348-1357．

[19]Zang Y，Thomas SM，Chan ET，et al．Carfilzomib and ONX 0912 inhibit cell survival and tumor growth of head and neck cancer and their activities are enhanced by suppression of Mcl-1 or autophagy[J]．Clin Cancer Res，2012，18(20)：5639-5649．

[20]Doi K，Li R，Sung SS，et al．Discovery of marinopyrrole A (maritoclax) as a selective Mcl-1 antagonist that overcomes ABT-737 resistance by binding to and targeting Mcl-1 for proteasomal degradation[J]．J Biol Chem，2012，287(13)：10224-10235．

[21]Yang QH，Xu YJ，F(xiàn)eng GF，et al．Effects of soothing liver and invigorating spleen recipes on NF-kappaB signal pathway related genes and proteins in primary hepatocytes of rats with NASH[J]．Zhong Yao Cai，2013，36(9)：1469-1467．

[22]Fraile JM，Quesada V，Rodriguez D，et al．Deubiquitinases in cancer:new functions and therapeutic options[J]．Oncogene，2012，31(19)：2373-2388．

[23]Chauhan D，Tian Z，Nicholson B，et al．A small molecule inhibitor of ubiquitin-specific protease-7 induces apoptosis in multiple myeloma cells and overcomes bortezomib resistance[J]．Cancer Cell，2012，22(3)：345-358．

[24]Li C，Johnson DE．Bortezomib induces autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells via JNK activation[J]．Cancer Letter，2012，314(1)：102-107．

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.047

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