·綜述·

基因工程細(xì)胞移植治療坐骨神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展

Research progress on transplantation of gene engineering cells for repairing the sciatic nerve injury

賀菊芳，余資江(貴陽醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

[關(guān)鍵詞]基因轉(zhuǎn)染；坐骨神經(jīng)損傷；修復(fù)與再生

坐骨神經(jīng)是人體最粗大的神經(jīng)，主要支配股二頭肌長頭、半腱肌、半膜肌和大收肌、小腿及足的全部肌肉以及除隱神經(jīng)支配區(qū)以外的小腿與足的皮膚感覺。在損傷嚴(yán)重的情況下，遠(yuǎn)段發(fā)生的軸突壞死、髓鞘分解消失和神經(jīng)鞘膜增生等，即“瓦勒變性”過程，引起股后部肌肉及小腿和足部所有肌肉全部癱瘓，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不能屈、踝關(guān)節(jié)與足趾運(yùn)動(dòng)功能完全喪失，呈足下垂，且小腿后外側(cè)和足部感覺喪失，足部出現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)性改變，可嚴(yán)重影響傷者的日常生活。坐骨神經(jīng)損傷為臨床常見且術(shù)后修復(fù)效果不佳，如何修復(fù)其損傷、修復(fù)后的效果如何等難題已成為基礎(chǔ)與臨床研究的重要熱門課題?；蚬こ碳?xì)胞[1-2]，即在體外對供體細(xì)胞用基因重組技術(shù)導(dǎo)入或刪除某一或某些基因以改變細(xì)胞的表型(包括生長特性、對毒物的抵抗力以及生產(chǎn)分泌某些治療性蛋白)等，即進(jìn)行遺傳修飾過的細(xì)胞。因此基因工程細(xì)胞技術(shù)結(jié)合顯微手術(shù)的應(yīng)用，使得坐骨神經(jīng)損傷后康復(fù)的效果更加理想。本文結(jié)合近些年國內(nèi)外熱門研究的幾種基因工程細(xì)胞，用于移植治療動(dòng)物模型坐骨神經(jīng)損傷的研究現(xiàn)狀進(jìn)行闡述。

1神經(jīng)干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是一種高度未分化具有自我更新和多向分化潛能的母干細(xì)胞。在損傷或者病理狀態(tài)下，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞受局部微環(huán)境的影響可以及時(shí)準(zhǔn)確地向損傷部位遷移，并向特定細(xì)胞類型分化，使神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或退行性疾病得以恢復(fù)相應(yīng)功能[3]，橋接功能賦予其在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中具有很大潛能。此外，神經(jīng)干細(xì)胞也可廣泛應(yīng)用于潛在的治療性轉(zhuǎn)基因載體，并且還能為在功能上高效穩(wěn)定表達(dá)有效因子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物提供平臺(tái)[2，4]。

多方面的生物優(yōu)勢使得神經(jīng)干細(xì)胞在基礎(chǔ)研究中占據(jù)重要地位。Fu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾的神經(jīng)干細(xì)胞(通過PCR技術(shù)檢測在轉(zhuǎn)錄水平上持續(xù)6周表達(dá))，具有促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的應(yīng)用潛力。雷正旺等[6]研究還發(fā)現(xiàn)利用神經(jīng)營養(yǎng)素-3基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞，通過肌內(nèi)注射使局部釋放神經(jīng)營養(yǎng)素-3加快軸突再生速度以促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生，有效減緩了失神經(jīng)支配肌肉的萎縮。這些很好地證明了在坐骨神經(jīng)的修復(fù)與再生試驗(yàn)中，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的可以充分利用神經(jīng)干細(xì)胞的橋接作用、自我更新和多向分化潛能并在局部釋放有效因子，同時(shí)也驗(yàn)證了它在神經(jīng)損傷后的遷徙特性。

2施旺細(xì)胞

施旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，沿著神經(jīng)元的軸突分布，反復(fù)包裹著軸突形成髓鞘。髓鞘表面固有的一層基膜能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，在周圍神經(jīng)再生中起到很重要的作用，主要是促進(jìn)受損的神經(jīng)元的存活和軸突的再生。當(dāng)神經(jīng)被切斷后，受到破壞的施旺細(xì)胞立即在軸突斷端發(fā)生封閉保護(hù)，以防止健康的軸突軸漿流失和彌散性潰變，進(jìn)而起到神經(jīng)的重要作用。

胡蓮美等[7-8]實(shí)驗(yàn)研究，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，成功地將外源性基因神經(jīng)生長因子和腦源性神經(jīng)生長因子導(dǎo)入施旺細(xì)胞中，使外源性基因成功表達(dá)，而且被轉(zhuǎn)染的施旺細(xì)胞仍保持較強(qiáng)的增殖能力，后將基因修飾的細(xì)胞與HHK(人發(fā)角蛋白)復(fù)合移植。實(shí)驗(yàn)3周后觀察到HHK絲間增生了大量排列整齊的施旺細(xì)胞和少量軸突；6周后HHK絲束中出現(xiàn)大量與正常神經(jīng)纖維基本一致的神經(jīng)纖維；9周后再生的神經(jīng)纖維明顯增多，有明顯的神經(jīng)外膜形成，增殖的組織中有新形成的微血管和排列規(guī)則的施旺細(xì)胞。Zong等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，NT-3基因修的飾施萬細(xì)胞與PLGA管構(gòu)建的神經(jīng)移植復(fù)合體能促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)的缺損再生，其再生的效果明顯優(yōu)于單NT-3基因組和施旺細(xì)胞組。施旺細(xì)胞是治療周圍神經(jīng)損傷的種子細(xì)胞，但分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)有時(shí)效局限性[10-11],利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)彌補(bǔ)這一缺陷，為治療周圍神經(jīng)損傷提供另一條有效途徑。

3神經(jīng)元

神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，由細(xì)胞體和長的細(xì)胞軸突構(gòu)成。丁文彬[12]和高峰等[13]從家兔脊髓中提取骨髓源性神經(jīng)組織定向干細(xì)胞(簡稱為NTCSCs)作為母體細(xì)胞，使攜帶GFP病毒的NTCSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞，培養(yǎng)出能夠進(jìn)行移植的干細(xì)胞源性神經(jīng)元細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5 cm的長距離坐骨神經(jīng)缺損的家兔在8周后能正常行走，肌肉力量恢復(fù)良好，工程化神經(jīng)元組織能夠快速傳導(dǎo)生物電。12周時(shí)，檢測到腓腸肌蛋白含量趨向正常，經(jīng)過HKP示蹤法、透射電鏡、免疫組織化學(xué)檢測之后，發(fā)現(xiàn)受損坐骨神經(jīng)中植入的NTCSCs神經(jīng)元存活狀況良好。神經(jīng)元作為神經(jīng)組織的關(guān)鍵組成成分，用作于基因載體，對神經(jīng)損傷的修復(fù)可起到重要作用。

4神經(jīng)前體細(xì)胞

神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells，NPCs)泛指處于發(fā)育更早期的細(xì)胞，是不甚嚴(yán)格的概念，屬于多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能、自我更新和增殖的能力，在特定的微環(huán)境變化中可分化為神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞[13]。人前腦啡肽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的鎮(zhèn)痛介質(zhì),屬于一種內(nèi)源性的阿片肽，由前腦啡肽原經(jīng)酶切加工而來。有研究發(fā)現(xiàn),人前腦啡肽原基因修飾永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞后，可長時(shí)間高水平地分泌高氨酸腦啡肽，在大鼠坐骨神經(jīng)鞘內(nèi)注射基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效果[13]。

5骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類存在于骨髓中的原始細(xì)胞，在合適的條件下可分化為機(jī)體內(nèi)許多不同種類的細(xì)胞。其具有來源豐富、取材方便、培養(yǎng)簡單、免疫原性低和可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子等優(yōu)點(diǎn)[14]，因此受到研究者們的青睞。Chen等[15]證實(shí)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的的特點(diǎn)，使其向神經(jīng)樣細(xì)胞方向分化，為移植修復(fù)神經(jīng)損傷提供了證據(jù)。

近幾年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是國內(nèi)的熱門研究之一。張威等[16]用轉(zhuǎn)染NT-3的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合去細(xì)胞同種異體神經(jīng)作為坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)的材料，有效提高了神經(jīng)傳導(dǎo)速度的恢復(fù)，對靶器官也具有明顯的促進(jìn)作用。陳解元等[17]使用大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型，鞘內(nèi)注射人前腦啡肽原基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人前腦啡肽原mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，減輕了神經(jīng)病理性疼痛。楊勁松等[18]使用基因工程的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯促進(jìn)了兔坐骨神經(jīng)的再生。鄭明輝等[19]的試驗(yàn)中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療坐骨神經(jīng)損傷，對神經(jīng)纖維的再生和功能的恢復(fù)有促進(jìn)作用,這與Ding等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

6肌源細(xì)胞

肌源細(xì)胞(myogentic cells)起源于胚胎血管祖細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)娜藶榄h(huán)境下也可分化為血細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等不同胚層的組織細(xì)胞。這種具有可塑性強(qiáng)、分布廣泛、來源豐富的肌源細(xì)胞，為自體干細(xì)胞治療退行性疾病或組織器官損傷的修復(fù)提供理想的種子細(xì)胞。Dadon-Nachum等[21]研究了神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾肌源細(xì)胞在大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型的治療效果。在試驗(yàn)中，他們分別給肌源細(xì)胞單一轉(zhuǎn)染腦源性神經(jīng)生長因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子、類胰島素一號增長因子和血管內(nèi)皮生長因子后混合培養(yǎng)，從中獲取的培養(yǎng)基可以在低氧環(huán)境中減輕運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元系NSC34表現(xiàn)出的毒性效應(yīng)。此外，被轉(zhuǎn)染的且存活下來的肌源細(xì)胞在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中表達(dá)和分泌上述神經(jīng)生長因子，移植后4種神經(jīng)生長因子在協(xié)同作用下可減輕坐骨神經(jīng)損傷。

7存在的問題和展望

坐骨神經(jīng)損傷是常見的周圍神經(jīng)損傷，在當(dāng)前受到廣泛的關(guān)注和研究。目前基礎(chǔ)研究主要是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使目的細(xì)胞大量表達(dá)特定蛋白來改善局部微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)與再生，其效果相對于神經(jīng)移植和單純性的細(xì)胞移植要明顯。然而基因工程細(xì)胞技術(shù)當(dāng)前還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，在臨床上應(yīng)用甚少，且基因工程細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷的機(jī)制、選何種目的細(xì)胞及表達(dá)的特定蛋白等問題，都有待于進(jìn)一步的深入研究?；蚬こ碳?xì)胞技術(shù)作為一種新的治療手段得到了重視，應(yīng)聯(lián)合外科顯微技術(shù)、藥物治療、針灸等多種治療方法聯(lián)合，通過綜合治療，相信將會(huì)在周圍神經(jīng)自體移植或神經(jīng)導(dǎo)管支架橋接手術(shù)中得到廣泛應(yīng)用并起到更好的治療效果，從而減輕患者術(shù)后的活動(dòng)不便和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

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(編輯：周小林)

[中圖分類號]R322.85

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)06-0666-03

[收稿日期]2015-05-16[修回日期] 2015-06-10

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81060108)；貴州省科技廳2012年社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合SY字[2012]3153號)

doi:10.11659/jjssx.01E015003