葛根素體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展*

★姜麗1*嚴(yán)小軍1李云2徐國良1*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)體育教學(xué)部南昌 330004)

摘要：葛根素具有提高免疫力，增強(qiáng)心肌收縮力，降血壓，改善微循環(huán)，抗血小板聚集，降血糖等作用，可用于治療冠心病、心肌梗死、高血壓等心血管疾病及突發(fā)性耳聾和糖尿病等癥。因其毒性小、安全范圍廣、療效好，臨床應(yīng)用不斷拓展，已成為生產(chǎn)心腦血管疾病的藥品或保健品的重要原料藥。考慮到葛根素藥代動(dòng)力學(xué)研究日漸深入，本文將從樣品前處理，檢測(cè)方法，藥物吸收、分布、代謝與排泄(ADME過程)及體內(nèi)過程影響因素等方面較系統(tǒng)地對(duì)葛根素近年來的藥代動(dòng)力學(xué)研究作一綜述，為葛根素制劑工藝及臨床應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：葛根素；藥代動(dòng)力學(xué)；樣品前處理；檢測(cè)方法；影響因素

葛根素(Puerarin)于19世紀(jì)70年代被成功提取，90年代被批準(zhǔn)用于臨床[1]。近年來，因其毒性小、療效好，臨床應(yīng)用非常廣泛，如高血壓、心絞痛、心肌梗死、冠心病、等心血管疾病，突發(fā)性耳聾和糖尿病等癥[2]。本課題組成員早在973計(jì)劃基金項(xiàng)目“基于經(jīng)典方劑相關(guān)的基礎(chǔ)研究”中，發(fā)現(xiàn)重用葛根配伍組對(duì)大鼠降糖效果更好，且推測(cè)發(fā)揮作用主要為葛根素等異黃酮類成分。為此，本文對(duì)葛根素藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)內(nèi)容作一簡單梳理，為以葛根素為主要效應(yīng)成分的中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)提供依據(jù)。

1生物樣品前處理

生物樣品直接來源于機(jī)體，通過前處理可提高待測(cè)樣品結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度；改善組分的可測(cè)定性(如成分富集)；提高選擇性(如排除雜質(zhì)干擾)；延長色譜柱使用期限。藥代動(dòng)力學(xué)研究中，首要處理的是去除樣品中的蛋白質(zhì)，使結(jié)合的藥物釋放出來，以便于準(zhǔn)確地測(cè)定藥物及其代謝物的總濃度，另一方面，去除蛋白質(zhì)可減少乳化的形成，保護(hù)儀器性能。去除蛋白質(zhì)方法一般有：(1)生成不溶性鹽。應(yīng)用的試劑主要有酸類(如HClO4、HPO3、Cl3CCOOH、HCOOH等)和重金屬鹽類(如CuSO4、AgNO3、ZnSO4等)。兩者作用原理均為形成不溶性鹽而沉淀，前者需pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，后者則需滿足pH大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。沉淀經(jīng)離心即可得到澄明上清液。(2)鹽析和脫水。鹽析法中常使用的中性鹽有Na2SO4、NaCl等，其親水性比蛋白質(zhì)強(qiáng)，高濃度鹽與蛋白質(zhì)膠粒競(jìng)爭水化膜，降低蛋白質(zhì)溶解度而析出，使藥物及其代謝物釋放出來。脫水法常用能與水混溶的有機(jī)溶劑如MeOH、CH3CH2OH、ACN等，當(dāng)它們過量存在時(shí)，可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)沉淀，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物釋放出來。(3)組織酶消化法。其中枯草菌溶素常用于水解蛋白，其在偏堿性pH范圍內(nèi)使蛋白質(zhì)肽鍵降解，并可使藥物析出，且條件溫和，避免某些藥物在強(qiáng)酸或高溫下水解。(4)液-液萃取(Liquid-liquid extraction，LLE)。此法常用于生物樣品中待測(cè)物質(zhì)與基質(zhì)的分離，是應(yīng)用最多的分離、凈化技術(shù)。因多數(shù)藥物親脂性強(qiáng)，而生物樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)多為強(qiáng)極性物質(zhì)，利用二者溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。因而用有機(jī)溶劑提取一次即可從大量樣品中富集待測(cè)物用于分析。(5)固相萃取(Solid-phase extraction，SPE)。采用固體材料如C18作為固定相，利用固定相對(duì)液相各組分的分配系數(shù)不同，將液相中待分析的組分從各種化合物的混合物中分離出來，避免了溶劑提取時(shí)蛋白質(zhì)沉淀引起的乳化和藥物損失。(6)高速離心。此法一般用于血漿蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)和血清的分離。

生物樣品中葛根素提取常采用有機(jī)溶劑沉淀、酸處理法及固相萃取法。

1.1有機(jī)溶劑沉淀法包括筆者在內(nèi)的大多數(shù)研究者常通過添加有機(jī)溶劑沉淀蛋白，如MeOH[3]、ACN[4]、無水乙醇[5]或95%乙醇[6]，血漿與溶劑的比例多為1∶2～1∶8[3-8]。

1.2酸處理法鄧新國等[9]〗對(duì)家兔房水中葛根素樣品前處理方法如下：家免房水及玻璃體樣本中加入等體積0.5 mol/L的HClO4溶液以除去蛋白質(zhì)，渦漩混勻1min，離心5 min，取上清進(jìn)樣測(cè)定。

李妮等[10]首次用HPLC法對(duì)健康人、糖尿病腎病病人服用葛根素后體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究。樣品處理方法如下：取血清100 μL，加入100μL 6% HClO4，渦旋振蕩2 min，895×g離心10 min，取上清進(jìn)樣測(cè)定。

潘震宇等[11]采用新型LC/LC-UV系統(tǒng)測(cè)定人體或動(dòng)物血漿中葛根素的藥物濃度。血樣處理方法如下：300μL血漿樣品中加入15% Cl3CCOOH溶液600 μL，渦旋振蕩1 min，離心10 min后，取上清進(jìn)樣測(cè)定。

1.3有機(jī)溶劑-酸處理結(jié)合法吳鴻飛等[12]研究了葛根素微乳和混懸液在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，并采用HPLC法測(cè)定葛根素血藥濃度。其血漿處理方法如下：取30μL血漿，加入15μLMeOH，渦旋混合5min后，繼加入30 μL 5% HClO4，渦旋2 min后，離心15 min，上清液用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?0μL流動(dòng)相復(fù)溶，取30μL進(jìn)樣測(cè)定。

Jeevan K.Prasain等[13]在葛根素大鼠血清中的藥動(dòng)學(xué)研究中則采用MeOH-1% CH3COOH處理血清樣品，可得到滿意的回收率。

1.4固相萃取法王慶慶[14]等用在線固相萃取法結(jié)合HPLC-MS，對(duì)葛根素在比格犬中的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究，用ACN-MeOH-0.1% HCOOH(體積比為25∶25∶50)以0.2 mL/min進(jìn)行洗脫。馮怡等[15]采用LC-MS/MS法測(cè)定兔血漿中葛根素的濃度，血漿樣品中加入內(nèi)標(biāo)后采用固相萃取法處理。

2檢測(cè)方法

葛根素分析檢測(cè)方法包括高效液相色譜法(HPLC)、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)、液質(zhì)聯(lián)用分析法(LC-MS)、薄層色譜-紫外分光光度法(TLC-UV)和薄層色譜-熒光分光光度法(TLC-FL)等。

2.1高效液相色譜法目前，葛根素藥動(dòng)學(xué)研究定量方法大多數(shù)采用HPLC法，如李彧[16]等研究了葛根素和冰片配伍前后的血藥濃度及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的變化情況；陳小新等[17]測(cè)定了葛根素自微乳在比格犬體內(nèi)生物利用度；姚晨等[18]利用微滲析技術(shù)，采用HPLC法測(cè)定家兔眼內(nèi)葛根素滴眼液的濃度；高春艷等[19]研究了葛根素和依達(dá)拉奉之間的藥動(dòng)學(xué)相互影響及冰片對(duì)葛根素在大鼠腦中分布的影響。

2.2液質(zhì)聯(lián)用法王文艷等[20]采用LC-MS/MS研究了樹枝狀聚合物PAMAM葛根素復(fù)合物在家兔眼內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，王瑩等[21]用LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中包括葛根素在內(nèi)的異黃酮和黃酮類成分。

2.3其它方法朱秀媛等[22-23]曾采用TLC-UV和TLC-FL分離測(cè)定大鼠體內(nèi)葛根素濃度，但此方法需血量較大且操作繁瑣，靈敏度較低。田景振等[5]采用高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)對(duì)葛根黃酮緩釋膠囊在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)使用磷酸緩沖液(pH=7.4)作流動(dòng)相測(cè)定葛根素，響應(yīng)低且基線不平，后改用硼酸緩沖液結(jié)果較為理想。

3體內(nèi)過程

3.1葛根素在體內(nèi)的吸收葛根素治療心腦血管疾病的療效已得到充分肯定，但是其水溶性及口服生物利用度低，臨床主要以靜脈注射為主，靜脈注射后體內(nèi)消除半衰期短，故需頻繁或大劑量給藥，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)(如溶血、急性腎衰、過敏性休克等)，極大地制約了其應(yīng)用[25]。因此，促進(jìn)葛根素口服制劑的吸收成為研究熱點(diǎn)之一。陳小新[26-27]等研究了大鼠及比格犬體內(nèi)葛根素自微乳藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，葛根素自微乳在兩種動(dòng)物體內(nèi)生物利用度均顯著提高。

3.2葛根素在體內(nèi)的分布大鼠、家兔、比格犬及人的藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)均表明，葛根素在體內(nèi)多臟器均有分布且分布較快。靜脈注射后，葛根素較多分布于血漿、腎臟及肝臟，其次在睪丸、脾臟、心臟和肌肉亦有分布。在腦中也可測(cè)到葛根素，但含量較低，表明葛根素可透過血腦屏障。蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，葛根素的血漿蛋白結(jié)合率依次為：肝(32.5%)>腎(27.1%)>血漿(24.6%)>肺(15.8%)[22]。

鄧新國等[9]腹腔注射葛根素后發(fā)現(xiàn)，其能通過血-房水屏障，眼房水和玻璃體均有分布，表明葛根素可經(jīng)全身給藥用于治療眼部疾病。

杜力軍等[6]制備的葛根黃酮灌胃給藥30 min后，在小鼠各組織中的藥物濃度從高到低分別為腎>肝>腦>心；在大鼠各組織中為腎>脾>心>肝>肺>腦。

在生理狀態(tài)下，靜注金森腦泰注射液15 min后，葛根素在肝臟及腎臟組織中濃度分別占總給藥量0.3%和31.7%。隨首時(shí)間的延長，組織中藥物濃度下降很快，30 min后肝中藥物濃度僅為總劑量的0.09%，1 h后腎臟內(nèi)藥量占總劑量的3%，說明葛根素主要在腎臟中分布[28]。

3.3葛根素在體內(nèi)的代謝與排泄 研究表明，葛根素經(jīng)大鼠肝微粒體代謝，為細(xì)胞色素P450酶 (Cytochrome P450 Proteins，CYP)的底物，當(dāng)葛根素濃度>10 mg/L 時(shí)，葛根素的代謝表現(xiàn)出明顯的飽和性，并不隨濃度的增加而呈線性增加；葛根素的消除速率隨CYP濃度增加而增加，呈線性相關(guān)[29]。如果葛根素和CYP誘導(dǎo)劑合用后，這些藥物將誘導(dǎo)CYP的活性，進(jìn)而導(dǎo)致葛根素的代謝增強(qiáng)，最終使葛根素血藥濃度降低，療效減弱。從以上結(jié)果可看出，大鼠肝CYP參與了葛根素代謝，對(duì)葛根素與CYP相關(guān)藥物相互作用機(jī)理的研究，有助于預(yù)防和減輕葛根素與其它藥物間的不良反應(yīng)，最大限度地提高藥物安全性和有效性，對(duì)臨床合理用藥具有重要意義[30]。

健康人體靜注葛根素后[10，23]，主要由腎臟清除，且在體內(nèi)分布和消除均較快，無蓄積。在糖尿病腎病(DN)早期，葛根素體內(nèi)代謝無顯著改變，但隨著腎損傷加重，葛根素體內(nèi)分布及清除均明顯減慢，導(dǎo)致體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程發(fā)生變化。推薦DN進(jìn)入臨床中期，葛根素用量宜小。

4葛根素藥動(dòng)學(xué)影響因素

葛根素藥代動(dòng)力學(xué)過程受多種因素影響，包括動(dòng)物的種屬及其生理病理狀態(tài)，藥物給藥途徑、吸收促進(jìn)劑和藥物劑型及配伍等。

4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類及其生理、病理狀態(tài) 金昔陸等[31]對(duì)葛根素在大鼠、家兔和狗的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與體重的相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，葛根素在3種動(dòng)物體內(nèi)過程不僅存在種屬差異，且藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與體重呈一定的相關(guān)性，如表觀分布容積(Vd)、穩(wěn)態(tài)分布容積(Vss)、體內(nèi)平均滯留時(shí)間(MRT)、清除率(CL)、分布半衰期(t1/2α)與體重呈正相關(guān)，而速率常數(shù)則隨體重增加而迅速減少。

禁食12 h小鼠灌胃葛根黃酮后，在15~ 30 min血藥濃度達(dá)到峰值，如不禁食則達(dá)峰時(shí)間后移[6]。

比較大鼠腦缺血再灌注組和正常組，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)、Vd、MRT、體內(nèi)消除時(shí)間有較大差異，葛根素在前組大鼠體內(nèi)為二室模型，在后組大鼠體內(nèi)為一室模型。病理狀態(tài)下，大鼠體內(nèi)的葛根素AUC增加、MRT延長、Vd減小，說明在腦缺血再灌注引起的病理損傷下，葛根素從血漿進(jìn)入其他組織灌注速度變慢，體內(nèi)清除時(shí)間延長。推測(cè)在病理狀態(tài)下，機(jī)體膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力低下造成[32-35]。

4.2給藥途徑 一般灌胃葛根黃酮后，葛根素在5～15 min即可被檢出，0.5～1 h達(dá)高峰，之后進(jìn)入消除相。大鼠灌胃200 mg/kg葛根素后，其消除相半衰期(t1/2β)為1.305 h，分布半衰期(t1/2α)為0.17 h；大鼠靜脈注射葛根素，消除半衰期t1/2β為(20±8) min，t1/2α為(24±9)min，表明灌胃葛根黃酮，其分布和消除時(shí)間均較靜脈注射途徑延長[36]。在給藥途徑上，除了注射和灌胃外，近年來也有研究者通過鼻腔[37]、皮膚[38]和眼部[39]給藥。

此外，葛根素的排泄與給藥途徑密切相關(guān)。灌胃給藥時(shí)，葛根素制劑在大鼠主要排泄途徑為糞便[22]，給藥24 h后糞便排泄量為總給藥量的35.7%，尿液排泄量為1.85%。靜脈途徑給藥時(shí)則正好相反[11]，尿液排泄占34%，糞便排泄僅占8.9%。

4.3劑型或復(fù)方因素 針對(duì)葛根素難溶、口服吸收差而影響其臨床療效，因此，通過劑型改造等手段提高葛根素在體內(nèi)吸收的程度與速度十分必要。近年來，葛根素研究熱點(diǎn)集中在提高生物利用度方面，出現(xiàn)了許多新劑型，如葛根素納米粒[39]、葛根素固體分散體[40-41]、葛根素磷脂復(fù)合物[42]、葛根素脂質(zhì)體[43-44]、葛根素分子篩復(fù)合物[45]，這些研究為葛根劑型改革提供了一些參考。

魯傳華等[38]制備葛根素納米粒，并測(cè)定了其在小鼠體內(nèi)的生物利用度。結(jié)果顯示，葛根素納米?？商岣吒鸶乜诜锢枚?，加快體內(nèi)的吸收，且達(dá)峰時(shí)間延長，平均滯留時(shí)間增加，絕對(duì)生物利用度為50.64%。龔顯峰等[40]將葛根素、磷脂與PVP制成固體分散體，比較研究其與原料藥在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)差異。結(jié)果表明，固體分散體相對(duì)生物利用度比葛根素原料藥增加了2.53倍。

顧一珠等[43]利用薄膜分散-超聲法制備了葛根素脂質(zhì)體并比較其與葛根素水溶液吸收情況，結(jié)果表明，脂質(zhì)體生物利用度提高了68%，說明葛根素制成脂質(zhì)體后，口服吸收顯著提高。鄧赟等[44]采用逆相蒸發(fā)法制備了葛根素脂質(zhì)體，并與葛根素滴眼液在家兔淚液中的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，葛根素脂質(zhì)體制劑的MRT、AUC分別為葛根素滴眼液的3.89、3.06倍。表明葛根素制成脂質(zhì)體后，可提高藥物在淚液中的濃度及延長其體內(nèi)滯留時(shí)間，進(jìn)而增加吸收。

配伍對(duì)葛根素藥代動(dòng)力學(xué)也有影響。研究表明[3]，葛根素單用或與天麻素合并用藥時(shí)，其體內(nèi)動(dòng)力學(xué)行為也不完全相同。聯(lián)合給藥后，葛根素在大鼠體內(nèi)主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與單獨(dú)給藥比較有顯著性差異。無論是灌胃還是靜脈注射，CL降低、MRT延長；相對(duì)生物利用度提高，尤以灌胃組效果顯著。

5研究展望

近年來，葛根素及含有葛根素的復(fù)方制劑在藥物和保健食品中的應(yīng)用愈加廣泛，其藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道也逐漸增多。因復(fù)方中各成分間相互作用進(jìn)而影響藥動(dòng)學(xué)過程，故針對(duì)復(fù)方藥動(dòng)學(xué)研究，應(yīng)以復(fù)方本身為研究對(duì)象，并將配伍關(guān)系考慮進(jìn)去，才能得到較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。建立中藥復(fù)方效應(yīng)成分藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)同步分析模型(PK-PD)，從兩者之間的差異找出量化依據(jù)，同時(shí)加強(qiáng)生理和病理狀態(tài)下葛根素在體內(nèi)的吸收分布和代謝研究，為臨床治療提供用藥指導(dǎo)。

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收稿日期：(2015-04-09)編輯：曾文雪

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

通信作者：徐國良，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥理及藥代動(dòng)力學(xué)。Tel：0791-87118576，E-mail：xuguoliang6606@126.com。

基金項(xiàng)目：第一作者：姜麗，講師。研究方向：中藥藥理評(píng)價(jià)與藥代動(dòng)力學(xué)。Tel：15270034170，E-mail：jiangli1009@126.com。