王敬華，葛 平，陳 蓉，徐 蓉，劉學杰

(上海市臨床檢驗中心，上海200126)

近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學和科學技術的發(fā)展，新的科技成果正不斷地被迅速應用于醫(yī)學科學研究和臨床實踐。其中，臨床微生物檢驗技術也得到快速發(fā)展，各種非培養(yǎng)快速診斷方法的建立縮短了檢驗時間［1-2］。但作為循證醫(yī)學的直接證據(jù)，病原菌分離培養(yǎng)仍然是診斷感染性疾病的金標準，也是進行體外藥物敏感性試驗、合理選擇抗菌藥物進行個體化抗感染治療的主要手段。作為細菌培養(yǎng)和鑒定的前期基礎，微生物標本接種技術得到一定發(fā)展，出現(xiàn)了商品化的自動化、半自動化接種儀。目前在國內臨床微生物實驗室中，以接種環(huán)手工分區(qū)劃線接種標本方法為主，兼有自動化、半自動化標本接種方法共存，尚難以進行統(tǒng)一操作和標準化。為提高檢驗質量，開展有效的標本接種質量控制，我們就臨床微生物實驗室細菌分離接種技術的發(fā)展現(xiàn)狀和研究進展進行綜述。

一、目前微生物標本接種的經(jīng)典方法

利用接種環(huán)分區(qū)劃線以獲取單個菌落是經(jīng)典的細菌接種方法，目前仍然被國內外臨床實驗室廣泛采用。但該方法也存在一些弊端。首先，該方法對個人操作水平要求較高，不僅必須做到無菌操作，而且要通過嚴格培訓和長期操作實踐，才能獲得理想的分離效果;其次，人工接種方法總體效率低，并受操作者個人水平和接種習慣的影響，主觀影響因素較多，重復性差;另外，在整個接種過程中，標本完全暴露于空氣中，操作者與標本近距離接觸，自身健康受到威脅?？傊?，這種經(jīng)典的細菌接種方法工作效率低，難以進行標準化和實施質量控制，無法滿足現(xiàn)代化的實驗室對自動化、標準化的要求。

二、自動化快速接種技術發(fā)展現(xiàn)狀

標本接種自動化和標準化是臨床微生物實驗室提高檢驗質量、開展質量控制的主要研究和發(fā)展的方向之一。19世紀70年代，美國已經(jīng)開始了自動化微生物接種儀的研究。1973年，美國埃德坎貝爾博士與美國食品藥品管理局研究員發(fā)明了螺旋接種方法自動計算細菌的數(shù)量，并最早于1977年獲得螺旋接種儀的發(fā)明專利，于1979年與Interscience的創(chuàng)始人Fracois/Jalenque共同研發(fā)生產(chǎn)了第一代螺旋細菌接種儀，主要用于食品藥品中微生物檢驗。1992年，他們重新校正了Spiral螺旋接種方法，并申請了專利，成為第一代接種儀接種原理的理論基礎。

迄今，自動化接種儀研究方興未艾，自動化快速接種技術仍然不夠成熟。目前，僅有少數(shù)幾種自動或半自動化微生物接種儀投放市場，而且多數(shù)仍處于逐步完善階段，甚至是臨床試驗階段。因此，配備自動化微生物接種儀的國內臨床微生物實驗室還很少;國際范圍內，也僅有很少大型的臨床實驗室配備全自動細菌分離培養(yǎng)系統(tǒng)。按照接種原理分類，現(xiàn)有自動化接種儀均采用劃線接種的原理，能夠實現(xiàn)半定量接種，仍然歸屬為第一代產(chǎn)品。與日趨成熟的微生物自動化鑒定技術相比較，第一代接種儀在接種技術的諸多方面還很不成熟，有一些技術問題尚待解決［3］。

在第一代接種儀中，以意大利Diesse公司生產(chǎn)的Robobact system全自動微生物分離培養(yǎng)系統(tǒng)、法國Interscience公司研制的EasySpiral Pro全自動螺旋接種儀以及法國生物梅里埃公司推出的PREVI Isola自動化微生物接種儀最具代表性。

Robobact system全自動微生物分離培養(yǎng)系統(tǒng)將標本接種與平板孵育集成到一臺儀器，使用方便。采用特制的平板和簡單劃線接種技術，平板面積小，無分區(qū)劃線設計，可以用于糞便、拭子、尿液標本中病原菌的分離培養(yǎng)［4］，但不適合下呼吸道標本，因這類標本可能含有大量正常菌群而又需要分離培養(yǎng)其中的苛養(yǎng)菌［5］，不宜全部采用選擇性培養(yǎng)基，無分區(qū)接種難以達到分離效果。

EasySpiral Pro全自動螺旋接種儀實現(xiàn)標本自動加樣、自動接種、自動清洗、消毒接種針等過程，其中自動接種過程僅需25 s，除了進行細菌分離培養(yǎng)，還能夠用于藥物敏感性試驗［6-7］。但在涂布平板進行藥物敏感性試驗時，有時會將瓊脂整個卷起;為防止交叉污染，每份標本接種后都必須進行清洗、消毒接種針，由于部分細菌對消毒劑耐藥或形成芽胞，25 s內徹底殺滅所有細菌理論上是不可能的［8-9］;而且，高濃度消毒劑未必就能達到理想的殺菌效果，接種針還可能攜帶殘余消毒劑;由于該儀器為單臂型(一個接種通道)，每個工作循環(huán)(包括標本更換、平板更換、吸樣、接種、清洗消毒)只能處理1份標本，僅接種1塊平板;需要清洗、消毒和人工填充平板，自動化操作過程難以連續(xù)進行;特別是在操作過程中，為防止交叉污染，實際需要清洗和消毒接種針次數(shù)多、時間長［9］，工作效率不高，不適于大批量標本接種。這些因素可能是造成該儀器目前難以在臨床微生物實驗室大量推廣應用的主要原因。

PREVI Isola自動化微生物接種儀是目前被認為自動化程度最高、接種效率最高、技術最成熟的接種儀。具有自動平板填充功能，可選擇平板、貼標簽并記錄平板類型和接種時間等［10-12］;可精確吸取標本，并使用接種涂布器分離接種，重復性很好，交叉污染率較低［13］;與手工法比較，平板有效利用率高，分離到單個菌落多［14］;但該接種儀不能進行自動化標本杯開蓋、關蓋，出現(xiàn)卡板現(xiàn)象可導致死機;同批次接種不同類型標本時，接種效率低;不適合接種導管、組織等［13］;接種涂布器無法將精確吸取的標本全部接種到平板，因此事實上該儀器仍然只能做到半定量接種。PREVI Isola自動化微生物接種儀還存在一個嚴重設計缺陷:由17個接種環(huán)并排構成的接種涂布器呈一個平面，必須和同樣呈平面的平板表面完美結合，否則二者難以充分接觸，不僅平板有效利用率下降使分離有效性下降，而且可能導致接種失敗，得出假陰性培養(yǎng)結果。事實上，批量生產(chǎn)的含瓊脂平板其表面難以完全做到真正水平。美國食品藥品管理局于2012年12月發(fā)出通知，在全球范圍召回PREVI Isola自動化微生物接種儀［15］。另外，接種儀自身制造成本較高，市場銷售價格昂貴;每接種1份標本均需要更換價格不菲(20～30元人民幣)的接種涂布器，造成使用成本增加;相對于菲薄的微生物檢驗利潤、昂貴的儀器價格和較高的使用成本，使其難以在包括我國在內的廣大發(fā)展中國家推廣。

有研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有自動化接種儀均缺乏有效的自動標本均質化預處理功能。而標本均質化效果是影響微生物檢驗質量的關鍵程序，也是實現(xiàn)標本接種全程自動化程序中的關鍵技術?，F(xiàn)有自動化接種儀仍采用人工打開標本蓋、加入處理液進行均質化處理的傳統(tǒng)方法［13］，不僅延誤標本接種時間、降低接種過程自動化程度、增加標本污染機會，而且存在實驗室生物安全隱患。

我國開展自動化微生物接種技術研究的時間較短，特別是研究成果的轉化速度相對滯后，總體研發(fā)水平低于國際同行。國內學者魏志勇等［16］研制發(fā)明了自動化微生物接種儀，并獲得國家發(fā)明專利。與現(xiàn)今流行的螺旋接種儀不同，魏志勇發(fā)明的微生物自動接種儀仍然采用劃線接種原理，屬于第一代自動化接種儀。但與前述其他第一代接種儀不同，該儀器模擬手工接種，采用分區(qū)劃線的方法，有利于提高病原菌的分離效果;同時，該儀器采用紅外線加熱消毒的方法進行接種環(huán)滅菌，使接種環(huán)的滅菌效果更可靠，較早期第一代自動化接種儀有一定的先進性。但目前尚未見其相應儀器面世，實驗數(shù)據(jù)不詳，特別是接種速度和接種效果尚未見報道。

三、細菌分離培養(yǎng)技術的發(fā)展趨勢

2001年我國衛(wèi)生部頒發(fā)了《醫(yī)院感染診斷標準(試行)》，其中臨床實驗室分離病原菌臨床意義的判定標準已經(jīng)具體量化到“cfu/mL”［17］，與《臨床微生物學操作指南》等國際診斷標準的要求是基本一致的［5］。因此，細菌定量檢驗，尤其是條件致病菌定量檢驗，對正確診斷和合理治療臨床最常見的由條件致病菌所引起的臨床感染(90%以上)［18］，具有非常重要的指導意義。

現(xiàn)有細菌培養(yǎng)檢驗技術是基于對細菌進行定性或半定量檢驗，重復性差，難以進行標準化。臨床微生物實驗室僅能對尿液標本、導管進行菌落計數(shù)，對來自下呼吸道的標本做粗略的半定量檢驗［8］，其他標本不做定量檢驗［5，8］，已不能滿足臨床診斷和治療的需要;基于定性或粗略半定量檢驗，實驗室分離菌株的臨床意義(特別是呼吸道標本中的條件致病菌，如念珠菌屬、不動桿菌屬和銅綠假單胞菌等)及細菌培養(yǎng)檢驗報告的臨床診斷價值已經(jīng)愈來愈受到臨床醫(yī)師的質疑。因此，細菌培養(yǎng)的定量檢驗已經(jīng)成為臨床實驗室迫切需要解決的技術難題，已經(jīng)受到包括檢驗界專家在內的國內外學者的廣泛關注。然而迄今為止，國際上尚缺乏操作簡便、快捷，可用于多種標本進行細菌培養(yǎng)準確定量檢驗的方法。因此，開展臨床微生物檢驗標本準確定量檢驗分析，建立細菌培養(yǎng)定量檢驗方法，將成為臨床細菌分離培養(yǎng)技術未來新的發(fā)展趨勢。

四、自動化微生物接種技術研究進展與前期探討

準確的標本定量接種技術是建立細菌培養(yǎng)定量檢驗方法的基礎;而標本接種自動化是微生物檢驗全程自動化不可或缺的關鍵技術。因此，細菌培養(yǎng)定量檢驗方法的建立應當基于先進的標本自動化接種技術。由于國際上尚沒有比較理想的自動化接種儀，特別是能夠準確定量接種的自動化儀器，缺乏先進的研究平臺，使細菌培養(yǎng)定量檢驗技術相關研究進展緩慢。目前，包括法國生物梅里埃公司、法國Interscience公司等國際知名微生物檢驗儀器和試劑生產(chǎn)商，仍然在致力于自動化接種技術的科研攻關。

國內王敬華等［3，19］新近發(fā)明了一種多通道自動化微生物接種儀，探討了解決微生物標本準確定量接種的問題，該研究創(chuàng)新了接種原理，徹底摒棄接種環(huán)和劃線接種方法。利用伯努利原理(同一流質內，流體流速與壓力呈反比，即流速大，壓強小;流速小，壓強大)進行接種，因而不存在接種環(huán)污染、消毒劑攜帶、頻繁更換涂布器或涂布器與平板接觸不良等第一代接種儀所面臨的技術難題［5］;而且該儀器不配備自動化平板填充系統(tǒng)，而是通過采用連通器原理，設計多通道接種儀，與單通道的第一代接種儀相比，10個接種通道同步工作，有望提高接種儀的實際接種效率;通過特殊設計，標本杯已經(jīng)具備自動化標本均質化預處理功能，可以節(jié)省標本預處理時間30 min以上，且均質化的液化標本與標本殘渣自動分離，保證標本均質化效果，為標本的準確定量接種奠定了基礎。實驗證明，在壓強恒定條件下，單位時間內密閉容器內液體通過相同孔徑導管的流度相同?；诹黧w力學特性，結合伯努利原理，作為定量接種的理論基礎，該方法有望成為自動化標本的準確定量接種方法。前期實驗表明，采用該接種方法所獲得的分離接種效果明顯優(yōu)于第一代接種儀。

總之，與自動化微生物鑒定儀比較，微生物自動化接種技術還很不成熟，在一定程度上遲滯全自動微生物檢驗流水線研發(fā)過程。微生物接種自動化研究方興未艾，目前尚缺乏能夠自動化準確定量接種的檢驗技術。開展細菌定量檢驗和分析是臨床診斷和治療的迫切需求，也是臨床微生物檢驗領域研究值得密切關注的課題之一。加快研制和開發(fā)具有我國完全自主知識產(chǎn)權的自動化接種儀，建立細菌培養(yǎng)定量檢驗方法，不僅具有非常重要的臨床應用價值和科學研究價值，而且具有重要的社會意義和經(jīng)濟價值。

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