王俊瑞， 魏常梅， 塔 拉， 崔晶花， 杜小莉， 韓艷秋

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050;2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京102206)

金黃色葡萄球菌是目前醫(yī)院感染的主要病原菌之一，可引起多種侵襲性感染，如骨髓炎、血流感染等［1-2］。金黃色葡萄球菌侵襲力的強弱與其表達的多種毒力因子密切相關，如各種黏附素(纖維黏連蛋白結合蛋白、凝聚因子和膠原蛋白結合蛋白等)、多種細胞外毒素(各種溶血素、殺白細胞毒素、腸毒素)等［3］，且不同金黃色葡萄球菌克隆株毒力因子分布特征存在明顯差異［4-6］。從侵襲性感染部位分離的金黃色葡萄球菌菌株表現(xiàn)出更強的體外侵襲及生物被膜形成能力，且高表達毒力調(diào)控基因agr和sarA［7］。金黃色葡萄球菌侵入宿主細胞后，由于受到細胞屏障的保護，其菌落特征及致病力方面更容易發(fā)生改變，難以清除［8］。這些研究結果提示，不同臨床來源的金黃色葡萄球菌分離株由于特定毒力因子分布及表達水平的不同，其侵襲力可能存在顯著差異，并決定其臨床感染進程和結局。因此，本研究以呼和浩特地區(qū)43例住院患者分離的43株金黃色葡萄球菌為研究對象，采用分子分型方法進行基因分型，分別采用抗菌藥物保護試驗和流式細胞內(nèi)化試驗探究不同基因型金黃色葡萄球菌體外侵襲力是否存在差異及其特征，為進一步研究金黃色葡萄球菌致病特征及其可能機制提供新的實驗數(shù)據(jù)，更好地指導臨床防控和治療金黃色葡萄球菌感染。

材料和方法

一、菌株來源

以2011年12月至2013年10月間內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)43例住院患者分離的醫(yī)院感染金黃色葡萄球菌43株作為研究對象，其中22株分離自傷口分泌物，8株分離自血樣本，6株分離自膿液樣本，3株分離自痰樣本，2株分離自中段尿樣本，1株分離自咽拭子樣本，1株分離自胸腹水樣本。

二、主要儀器、試劑和菌株

VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定和藥物敏感性分析系統(tǒng)及配套革蘭陽性菌鑒定卡GP(法國生物梅里埃公司)、2720型聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國 ABI公司)、脈沖場凝膠電泳(pulse field gel electrophoresis，PFGE)設備(美國 Bio-Rad公司)、流式細胞儀(FACS，美國BD公司)。

頭孢西丁藥物敏感性紙片購自英國Oxoid公司，溶葡萄球菌素購自Sigma公司，細菌基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，5-二醋酸羧基熒光素琥珀酸單胞菌酯(5-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CFSE)、臺芬藍和萬古霉素購自Sigma公司，24孔細胞培養(yǎng)板購自Coming公司。

A549肺腺癌細胞株及體外藥物敏感性試驗用質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科保存;PFGE用標準菌株沙門菌H9812菌株由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供。

三、方法

1.菌株鑒定和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)篩查 所有金黃色葡萄球菌分離株均采用VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定和藥物敏感性分析系統(tǒng)再次鑒定，并采用頭孢西丁紙片擴散法篩查MRSA，依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2013年版標準進行判斷和確認。

2.PFGE分型菌株 常規(guī)培養(yǎng)16～18 h配置菌懸液［3.5～4.5 麥氏單位，(1.05～1.35)×109cfu/mL］。250μL菌懸液中加入2μL溶葡萄球菌素(1 mg/mL)，移液槍充分吹打混勻。取250μL溶菌素處理后的菌懸液與預熱的1%SeaKemGold(SKG)等體積混合后加入模具，室溫靜置10～15 min制備膠塊。加入4 mL蛋白酶K/CLB細胞裂解液混合液中裂解。標準菌株處理方法相同。切取制備好的膠塊分別置于XbaⅠ內(nèi)切酶緩沖液及SmaⅠ限制性內(nèi)切酶緩沖液中孵育。膠塊在PFGE儀中進行電泳，以標準菌株進行條帶標準化處理。膠塊間圖像比較采用BioNumerics(Version 5.1，Applied Maths，Inc)軟件進行處理。設置條帶差異容許度為1.5%。采用UPGMA(組間非加權的幾何平均數(shù))方法進行聚類分析，采用Dice系數(shù)計算菌株相關性。

3.多位點序列分型(multi locus sequence typing，MLST) 根據(jù)文獻［9］的方法，隨機選取不同PFGE圖譜型2～3株MRSA為代表株(共25株)進行 7 個管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL)序列測定。首先對各菌株純培養(yǎng)物進行DNA提取(細菌基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司)，利用各基因特異性引物進行PCR擴增，PCR引物合成及PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術有限公司完成。PCR擴增與序列測定使用同一對引物。測序結果在http://saureus.mlst.net網(wǎng)站進行序列比對。

4.抗菌藥物保護試驗 金黃色葡萄球菌各PFGE型菌株在5 mL水解酪蛋白胨液體培養(yǎng)基中37℃恒溫搖床過夜培養(yǎng)。4℃，3 000×g離心10 min收集細菌，用 pH值7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次，在分光光度計下測吸光度(A)值(600 nm波長)，計算細菌濃度，離心后菌體用無抗菌藥物的DMEM細胞培養(yǎng)液均勻懸浮備用。

A549細胞用75 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)液含90%DMEM和10%胎牛血清。當細胞生長到75%～85% 時，用0.25%胰蛋白酶消化離心計數(shù)，接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng) ，每孔約加入5×104。37℃孵育24～36 h，每孔加入各型待測金黃色葡萄球菌懸液，細菌與細胞比例約為20∶1，37℃孵育2 h。PBS清洗2次，每孔加入含終濃度為200μg/mL萬古霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液500μL，5%CO2條件下37℃孵育1 h，用以殺滅未侵入細胞內(nèi)的細菌，包括游離于培養(yǎng)液中的細菌和僅與細胞發(fā)生黏附的細菌。PBS清洗2次，每孔加入 0.5%Triton 500 μL，作用 30 min。取10μL混懸液接種在羊血瓊脂血平板上，37°C孵育18～24h后計數(shù)菌落數(shù)。以回收細菌菌落數(shù)占侵襲試驗初始接種菌量的比例(%)表示該株細菌侵襲力的大小。

5.流式細胞內(nèi)化試驗 采用流式細胞內(nèi)化試驗對抗菌藥物保護試驗中檢測到的侵襲力差異明顯的菌株進行進一步驗證。(1)細菌標記:在進行流式細胞儀檢測前，用CFSE熒光對金黃色葡萄球菌標記(標記流程為:用分光光度計調(diào)整細菌濃度至1×109cfu/mL，用無菌PBS清洗3次，加入用 pH值 7.4 PBS配置的終濃度為1μg/mL的CFSE液體內(nèi)，置于37℃孵育2 h，給予不間斷震蕩搖晃)［10］。CFSE標記的細菌用PBS清洗離心3次后用于細胞侵襲試驗;(2)細胞侵襲試驗:以約5×104/孔細胞密度接種A549細胞到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，添加培養(yǎng)液培養(yǎng)24～36 h，用PBS清洗3次，調(diào)整細菌濃度，以細菌與A549細胞感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為20∶1的比例進行體外侵襲試驗，37℃孵育1 h。之后用PBS清洗2次。用0.25%胰酶消化2 min收集細胞，用PBS清洗，1 000×g離心5 min共2次，細胞加入含終濃度為0.2%臺芬藍溶液中。直接上流式細胞儀檢測，檢測參數(shù)包括CFSE熒光標記細菌的細胞百分率和每個細胞的相對平均熒光強度。以A549細胞常規(guī)培養(yǎng)組作為陰性對照，該組細胞未加入金黃色葡萄球菌。在流式細胞儀的散點圖上根據(jù)前向散射光和側向散射光2個參數(shù)設定無熒光標記A549細胞群(M1)和熒光標記細胞群(M2)。共計數(shù)10 000個細胞。以綠色熒光(CFSE)陽性細胞占總細胞的百分數(shù)來代表細菌的侵入率，以吸收系數(shù)表示不同菌株侵襲力的強弱［10］。吸收系數(shù)=平均每個細胞的平均CFSE熒光強度×CFSE陽性細胞比例。吸收系數(shù)越大表示相應菌株侵襲能力越強。

四、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0軟件對不同菌株體外侵襲力進行比較。體外侵襲力大小采用獨立樣本t檢驗進行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、MRSA篩查

頭孢西丁紙片擴散法試驗結果顯示，43株金黃色葡萄球菌中23株為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)，其中傷口分泌物樣本11株、血流樣本5株、膿液樣本4株、胸腹水樣本1株、痰液樣本1株、尿液樣本1株;23株MSSA臨床科室分布情況如下:皮膚科5株、普通外科4株、急診科3株、骨科2株、新生兒科2株、消化內(nèi)科2株、血液內(nèi)科1株、內(nèi)分泌科1株、神經(jīng)內(nèi)科1株、泌尿內(nèi)科1株、蒙醫(yī)科1株。20株為MRSA，其中傷口分泌物11株、全血樣本3株、膿液樣本2株、痰液樣本2株、尿液樣本1株、咽拭子樣本1株;20株MRSA臨床科室分布情況如下:骨科6株、神經(jīng)外科3株、泌尿內(nèi)科2株、神經(jīng)內(nèi)科2株、口腔科1株、普通外科1株、重癥監(jiān)護病房1株、泌尿外科1株、血液內(nèi)科1株、急診科1株、中醫(yī)科1株。

二、分子分型

PFGE分型結果顯示，43株金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)多樣性的基因背景特征，按照80%相似度的判斷依據(jù)，43株菌共分為12個基因型。其中，優(yōu)勢型為Ⅰ型和Ⅱ型，分別占25.6%(11/43)和34.9%(15/43)，其它型為少見型，占 39.5%(17/43)，見圖1。頭孢西丁篩選試驗結果顯示，Ⅰ型菌株和少見型菌株主要為MSSA(85.7%，24/28)，而 Ⅱ 型菌株均為MRSA(100.0%，15/15)。選擇各PFGE型菌株共25株進行MLST分型，分型結果見圖1。

圖1 43株金黃色葡萄球菌PFGE和MLST分型結果

三、抗菌藥物保護試驗

共選擇不同PFGE型菌株22株進行體外侵襲試驗，不同菌株間體外侵襲力差異明顯，結果見圖2。侵襲力最強的3株菌分別為S82、S08和S87，侵入率分別為3.27%、3.15%和3.09%。侵襲力最弱的3株菌為S06、S57和 S74，侵入率分別為0.22%、0.24%和1.16%。Ⅰ型菌株和Ⅱ型菌株體外侵襲力比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.84，P＞0.05)，Ⅰ型、Ⅱ型菌株體外侵襲力均顯著高于少見型，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.15、4.9，P＜0.01)。

四、流式細胞內(nèi)化試驗

經(jīng)抗菌藥物保護試驗檢測具有不同侵襲力的4株菌株(S06、S74、S79、S82)進行流式細胞內(nèi)化試驗。結果顯示，4株金黃色葡萄球菌侵襲力差異明顯，4株菌對A549細胞株的侵入率分別為4.03%、8.63%、16.51%和 20.31%，吸收系數(shù)分別為1.13、2.34、5.77和6.81。見圖3。

圖2 不同基因型金黃色葡萄球菌臨床分離株體外侵襲力比較

圖3 流式細胞內(nèi)化試驗檢測4株不同金黃色葡萄球菌侵襲力結果

討 論

金黃色葡萄球菌由于表達多種毒力因子而表現(xiàn)出強的侵襲能力，已被證實是造成多種侵襲性感染的主要病原菌之一，如骨髓炎、關節(jié)炎等，這些菌株常高表達特定毒力因子，特別是多種黏附素［11-12］。金黃色葡萄球菌的侵襲不僅能夠誘導宿主細胞凋亡及組織壞死，還能通過上調(diào)宿主細胞抗凋亡因子的表達使其能夠長期存活在宿主細胞中［13］。能夠在宿主細胞中長期存活的菌株在代謝活動、毒力因子表達等方面均發(fā)生相應變化以適應宿主環(huán)境［14］，部分菌株生長速度非常緩慢、菌落細小，生物學特征與小菌落突變株［15］相同或相近。由于菌株代謝特征的變化及宿主細胞的屏障作用，這類菌株對抗菌藥物的敏感性常明顯降低［16］，是造成慢性遷徙性感染的主要原因之一［17-18］。本研究對43株不同來源、不同耐藥性的金黃色葡萄球菌臨床分離株的體外侵襲力進行了初步研究后發(fā)現(xiàn)，不同基因型金黃色葡萄球菌體外侵襲力差異顯著，而且優(yōu)勢型菌株侵襲力明顯高于非優(yōu)勢型菌株，特別是ST-239型MRSA分離株。相關報道顯示，包括 ST-239型在內(nèi)的MRSA分離株攜帶更多的超抗原基因及PVL基因，進而造成其更強的致病力［5］。進一步針對ST-239型MRSA毒力因子攜帶特征及體內(nèi)外致病特征的研究有待于開展，以進一步明確不同部位、不同地域環(huán)境分離株致病力差異與菌株耐藥性演變之間存在的相關性及其機制。

針對不同臨床分離株侵襲力差異的研究已有報道。PARK等［19］以菌血癥患者分離菌株進行研究發(fā)現(xiàn)，不同分離株體外侵襲力差異顯著，但與患者是否出現(xiàn)侵襲性感染的并發(fā)癥無明顯相關性。這一結果提示，金黃色葡萄球菌侵襲力強弱可能并不是金黃色葡萄球菌侵襲性感染結局的主要決定因素。但該研究入選菌株數(shù)量較少(10株MSSA)且入選患者均為社區(qū)獲得性患者，對于醫(yī)院感染菌株及MRSA菌株的特征尚不明確。我國學者發(fā)現(xiàn)ST-239型MRSA株sasX基因敲除前后，2株菌的定植能力、致病力變化明顯［20］。這一結果提示，特定克隆株自身基因背景特征或毒力因子分布特征是造成菌株間致病力或侵襲力差異的主要原因。本研究所得結果相近，即臨床分離的優(yōu)勢克隆株特別是ST-239型菌株具有更強的體外侵襲力，提示優(yōu)勢克隆株因其自身毒力特征具有更強的生存及致病能力。我們需對這些菌株的基因背景特征進一步分析。此外，本研究中檢測到的體外侵襲力最弱的3株菌(S06、S57和S74)分別分離自咽部分泌物和痰液樣本;而侵襲力最強的3株菌(S82、S08和S87)中，2株分離自膿液樣本，1株分離自傷口分泌物樣本。雖然菌株數(shù)量較少，但這一結果也提示不同部位來源菌株致病力可能存在明顯差異，菌株遺傳背景特征差異可能是造成其侵襲力不同的主要原因。

本研究中，我們采用流式細胞內(nèi)化試驗對抗菌藥物保護試驗篩選出的呈現(xiàn)不同體外侵襲力的4株金黃色葡萄球菌分離株進行進一步分析，得出一致的結果。2種方法相比較，抗菌藥物保護試驗在方法學上較為簡便，對試驗條件及設備要求較低，但需要依據(jù)待檢測菌株耐藥性特征選擇適宜的抗菌藥物，并需進行多次預試驗來確定抗菌藥物的作用時間。流式細胞內(nèi)化試驗在檢測敏感性和準確性上更具優(yōu)勢，但對實驗室條件和設備的要求更高，檢測費用也相對較高。不同實驗室可依據(jù)自身情況選擇這2種方法進行相關研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)不同基因型醫(yī)院感染金黃色葡萄球菌臨床分離株體外侵襲能力差異顯著，優(yōu)勢克隆株特別是ST-239型MRSA株具有更強的體外侵襲能力。這一結果提示我們應對金黃色葡萄球菌優(yōu)勢克隆株的醫(yī)院內(nèi)傳播及感染治療給予更多關注。本研究的不足之處在于所研究的菌株數(shù)量有限，今后大樣本的研究仍有待開展，以更為準確地闡明不同基因背景克隆株致病特征及其與感染進程之間的相關性。

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