陳春艷，馬暉玲，董文科

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2.河南科技大學農(nóng)學院，河南 洛陽 471003；3.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；4.中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

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甘肅紅豆草無色花青素還原酶LAR基因的克隆和表達分析

陳春艷1,2,3,4，馬暉玲1,3,4*，董文科1,3,4

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2.河南科技大學農(nóng)學院，河南 洛陽 471003；3.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；4.中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

以甘肅紅豆草為材料，采用RT-PCR法克隆無色花青素還原酶LAR基因，分析該功能基因在甘肅紅豆草不同器官表達的差異性。結(jié)果表明，克隆的甘肅紅豆草LAR基因，與GenBank已報道LAR基因(登錄號：HM152981)序列相似性達到98.34%，其ORF長為1089 bp，編碼362個氨基酸殘基；其編碼的氨基酸序列與不同屬豆科物種的相似性存在較大的差異?；蛐蛄幸炎缘紾enBank，序列登錄號為KP013623。LAR基因在甘肅紅豆草不同器官表達差異較大；其中葉中表達量最高，其次是花和果，莖中表達量最低，這與器官間縮合單寧含量的變化規(guī)律一致。推測其表達與甘肅紅豆草縮合單寧器官間的積累差異有關(guān)。這些研究結(jié)果也為探索縮合單寧積累和表達調(diào)控的機制提供基礎。

甘肅紅豆草；RT-PCR；無色花青素還原酶；克隆與表達

紅豆草(Onobrychisviciaefolia)為多年生草本植物，紅豆草地上部分粗蛋白質(zhì)及氨基酸含量豐富，含有一定數(shù)量的粗脂肪、多種維生素和礦物質(zhì)及其他化學物質(zhì)。紅豆草的種子產(chǎn)量和產(chǎn)草量高，結(jié)實性能較好，營養(yǎng)物質(zhì)全面而豐富，適口性優(yōu)良。而且它能顯著增加土壤含氮量，也是一種花蜜液數(shù)量多的植物[1]。目前，紅豆草作為優(yōu)良的牧草在甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、寧夏、青海等23個省區(qū)廣泛栽培[2]。甘肅紅豆草(Onobrychisviciifoliacv.Gansu)是由普通紅豆草和高加索紅豆草自由雜交多次混合授粉的植株中單株選擇培育成的[3]。適合我國干旱半干旱地區(qū)建立人工草地，其產(chǎn)草量接近或超過早熟、速生、抗病蟲害、高產(chǎn)、耐旱的紫花苜蓿品種。

可溶性蛋白含量高是苜蓿引起家畜臌脹病的主要原因[4]?？s合單寧能夠與可溶性蛋白質(zhì)作用生成沉淀，避免引起臌脹病，然而紫花苜蓿葉片不含縮合單寧，只在種皮中少量存在。紅豆草在各個生長時期葉片都能生產(chǎn)很高濃度的縮合單寧[5]。家畜飼用富含縮合單寧的紅豆草后不會患臌脹病，普遍認為紅豆草是在遺傳資源創(chuàng)新途徑中和飼草利用方式解決紫花苜蓿引起牲畜臌脹病發(fā)生的一種理想牧草[6-7]。在遺傳資源創(chuàng)新方向，從紅豆草中鑒定和分離縮合單寧基因，進而利用基因工程技術(shù)將此基因?qū)氲杰俎Ｖ腥?，不失為一條改善苜蓿品質(zhì)和適口性的有效途徑。

目前，縮合單寧合成途徑已經(jīng)基本清楚。主要由公共苯丙烷途徑、核心類黃酮-花青素途徑、縮合單寧特異途徑完成，其中縮合單寧特異途徑最終決定其積累[8]?？s合單寧特異生成途徑中有兩個關(guān)鍵酶分別是無色花青素還原酶(leucoanthocyanidin reductase, LAR)和花青素還原酶(anthocyanidin reductase, ANR)[9-10]。LAR和ANR為單寧的生成提供了兩條不同的途徑和不同的前體物質(zhì)，然而前者的底物無色花青素又是經(jīng)花青素合成酶合成的花青素成為后者的底物，LAR在縮合單寧特異合成途徑中尤為重要[11]。一些研究證實LAR基因的表達與縮合單寧的累積呈正相關(guān)[12]，但是也有LAR活性與縮合單寧累積不符的報道[13]。LAR基因表達與縮合單寧合成受到種內(nèi)和種間差異的影響[14]。為此，探清甘肅紅豆草LAR基因結(jié)構(gòu)、功能及其表達具有重要的科學意義和實踐應用價值。

從植物組織中提取純度高、完整性好的高質(zhì)量RNA是進行Northern雜交、RT-PCR以及cDNA文庫構(gòu)建等分子生物學研究的必要前提[15-16]。然而紅豆草的組織和器官中富含酚、原花青素、花青素等次生代謝物以及蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子，其RNA提取難度較大，這些物質(zhì)嚴重影響RNA提取的質(zhì)量和效果。本研究通過改良總RNA提取方法，將提取獲得的總RNA粗提物純化，提出了一種有效的紅豆草總RNA的提取方法。進而利用RT-PCR法克隆甘肅紅豆草LAR基因，分析其序列特征，與其他高等植物的LAR基因進行相似性比較，并分析LAR基因的組織表達特征。以驗證該方法所提取的總RNA能否滿足下游分子生物學實驗，也為紅豆草分子生物學進一步研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料 紅豆草品種為甘肅紅豆草，由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院提供。

1.1.2 實驗試劑和處理方法 M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit購自上海生工生物工程公司，引物由北京賽百盛生物公司合成，Taq酶購自大連寶生物工程有限公司，SanPrep DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程公司，其他藥品、試劑為常規(guī)國產(chǎn)分析純。

所用的試劑為新開封試劑，用滅菌的0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)水配制，塑料耗材均需用0.1%DEPC dH2O處理24 h，高溫滅菌，烘干后備用；研缽、試劑瓶、玻璃棒、容量瓶等物品經(jīng)180℃高溫烘烤5 h，避免RNase污染。

1.2 RNA提取方法

1.2.1 CTAB法粗提RNA 取紅豆草幼嫩材料0.10 g，在液氮中研磨成粉，將粉末迅速轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中；加入600 μL的65℃ RNA提取緩沖液 [2%β-巰基乙醇(W/V)、2%CTAB(W/V)、4%PVP(W/V)、1.4 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)、25 mmol/L EDTA(pH 8.0)]，然后振蕩1 min，使材料裂解充分，在65℃水浴鍋中溫浴10 min，期間振蕩2～3次；然后在4℃和12000 r/min下高速離心10 min；吸取上清置于另1支1.5 mL離心管中，加入600 μL體積比為25∶24∶1的水飽和酚：氯仿：異戊醇混合液，上下顛倒混勻，放置于冰上10 min；在4℃和12000 r/min下高速離心10 min；吸取上清至另一離心管中，重復上述除蛋白步驟；吸取上清，加入167 μL 10 mol/L LiCl，上下顛倒混勻，置于-20℃冰箱3 h，在4℃和12000 r/min下高速離心20 min；棄上清液，將沉淀溶解于500 μL 0.1% DEPC水中，加入50 μL的3 mol/L NaAC(pH 5.2)，充分溶解后，再加入1375 μL -20℃的無水乙醇，混勻，放置于-70℃的超低溫冰箱中30 min，在4℃和12000 r/min下高速離心10 min，棄去上清；用70%乙醇洗滌2次，在4℃和12000 r/min下高速離心5 min；棄去上清，倒扣在濾紙上吸光殘余乙醇；沉淀于超凈工作臺中風干，加入50 μL 0.1% DEPC水溶解RNA，此為RNA粗提物。

1.2.2 RNA的純化 取RNA粗提物100 μL，加入900 μL 0.1% DEPC水，使其溶解，然后加入1000 μL體積比為25∶24∶1的水飽和酚：氯仿：異戊醇混合液，顛倒混勻，在4℃和12000 r/min下高速離心20 min；取上清于另一支1.5 mL離心管中，立即加入200 μL的3 mol/L NaAC(pH 5.2)和500 μL預冷的無水乙醇，混勻，放置于-70℃的超低溫冰箱中沉淀30 min，在4℃和12000 r/min下高速離心10 min，棄去上清；用70%乙醇洗滌2次，在4℃和12000 r/min下高速離心5 min；棄去上清，倒扣在濾紙上吸光殘余乙醇；沉淀于超凈工作臺中風干，加入50 μL 0.1% DEPC水溶解RNA，將其保存于-80℃的超低溫冰箱。

1.3 RNA質(zhì)量檢測

1.3.1 純度和濃度測定 取純化的RNA 1 μL，以0.1% DEPC水為空白液調(diào)零，在微量分光光度計下測定OD260和OD280值。

1.3.2 凝膠電泳檢測 取純化的RNA 10 μL，以1×TBE為緩沖液，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，30 min后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并照相。

1.4 基因克隆

1.4.1 First-Strand cDNA合成 使用上海生工生物工程公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行First-Strand cDNA合成反應，合成后產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR LAR基因 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的紅豆草無色花青素還原酶(LAR)基因(登錄號：HM152981)序列，利用分子生物學軟件DNAMAN 6.0設計特異引物：

LP1：5′-CGCCCGGGATGGCGACTTCCCCAGCCAATATC-3′

SmalⅠ

LP2：5′-GCGAGCTCTCAACAGGAAGCTGTTATTGGGACTG-3′

SacⅠ

PCR反應體系(25 μL)包括cDNA 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，引物LP1和LP2(10 pmol/μL)各1 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL。反應程序為,預變性：94℃、4 min，變性：94℃、1 min，退火：57℃、1 min，延伸：72℃、1.5 min，38個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應結(jié)束后取10 μL反應產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.4.3 與T載體連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞及測序 按回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進行回收，按照1∶4將pMD18-T Vector與目的片段進行連接，16℃反應6 h。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并進行藍白斑篩選。挑選陽性克隆于含100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，PCR擴增及SmalⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定陽性克隆后送于上海生工生物公司測序。

1.5 LAR基因生物信息學分析

基因開放閱讀框通過NCBI提供的ORF Finder(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找；核苷酸序列相似性檢索通過NCBI的BlastN、BlastP和DNAMAN 6.0軟件進行分析；用MEGA 6.0軟件進行氨基酸序列比對和LAR類蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進化樹分析；用http://expasy.org/tools/protparam.html網(wǎng)站進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析。通過應用ProtScale軟件的Hphob. Kyte & Doolittle算法對LAR蛋白進行親水/疏水性分析。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行保守功能區(qū)預測。

1.6 LAR基因組織表達特性分析

采用半定量RT-PCR方法對甘肅紅豆草LAR基因進行組織器官特異性表達分析。分別提取甘肅紅豆草葉、莖、花、果的總RNA，以等量的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃?zhèn)溆谩＿\用DNAMAN 6.0軟件設計引物和內(nèi)參引物如下：

LARP1：5′-ACGGCACTGTCCAAGCATA-3′

LARP2：5′-TTTCCCACAAAGAAGCAAGG-3′

ActinP1：5′-GAGCGTTTCCGTTGTCCTGA-3′

ActinP2：5′-AGGTGCTGAGGGAAGCCAAA-3′

以等量的cDNA進行RT-PCR，反應程序為,預變性：94℃、1 min，變性：94℃、30 s，退火：55℃、30 s，延伸：72℃、40 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應結(jié)束后取10 μL反應產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。進行3次重復實驗。通過目的條帶的亮度來分析基因表達的差異。

1.7 縮合單寧含量的測定

分別取甘肅紅豆草葉、莖、花、果各0.5 g，液氮研磨成粉末狀，加入3 mL提取液[含0.5%乙酸的70%丙酮(V/V)]研磨至勻漿，于5000 r/min下離心10 min，取上清液，沉淀用3 mL提取液清洗2次，合并上清液，并定容至10 mL；吸取2 mL上清液加入2 mL水和2 mL三氯甲烷且充分搖勻后于5000 r/min下離心10 min去除葉綠素(重復3次)；上清液即為提取液。采用正丁醇-鹽酸法[17]測定縮合單寧含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測

RNA的純度和完整性是分子生物學實驗成功與否的重要因素。利用改良CTAB法分離得到的甘肅紅豆草總RNA，經(jīng)微量分光光度計測定OD260/OD280值處于1.8～2.0之間(表1)；不同器官RNA電泳顯示28s和18s條帶較清晰，且28s條帶的亮度高于18s條帶(圖1)，結(jié)果表明得到的總RNA既未發(fā)生降解，又無DNA、蛋白質(zhì)等污染，質(zhì)量和純度較高。

表1 甘肅紅豆草不同器官總RNA的濃度及純度

2.2 LAR基因的擴增及克隆

圖1 甘肅紅豆草不同器官的總RNAFig.1 Total RNA of different organs in O. viciifolia cv.Gansu 1：莖 Stem，2：葉 Leaf，3：花 Flower，4：果 Fruit.

為確定改良CTAB法提取的紅豆草總RNA能否滿足下游分子生物學實驗。以該法提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴增得到約1100 bp左右的片段(圖2)?；厥誔CR產(chǎn)物，連接到pMD18-T Vector上，經(jīng)藍白斑篩選后，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒進行PCR擴增及SmalⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，得到的目的片段大小約為1100 bp(圖3，圖4)。表明這些克隆為陽性克隆，將其命名為：pMD-LAR，送交測序公司測序。

2.3 測序結(jié)果及序列分析

本研究克隆的甘肅紅豆草LAR基因已登記在GenBank(登錄號：KP013623)，將核酸序列用DNAMAN 6.0軟件進行比對分析，它與紅豆草LAR基因(登錄號：HM152981)具有98.34%的相似性。其開放閱讀框架為1089 bp，包括362個氨基酸編碼區(qū)和一個終止密碼子(TAG)。與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄相似性較高的幾種植物LAR基因核酸BLAST分析發(fā)現(xiàn)，該序列與豆科其他屬植物百脈根、蒺藜苜蓿、大豆、豌豆和大百脈根相似性在76%～93%，與杜鵑花科兔眼藍莓、?？破【苹ê退N薇科甜櫻桃的相似性低于75%(表2)。說明同屬間LAR基因具有很強的保守性，但不同物種間LAR基因在進化過程中發(fā)生較大變異。

圖2 LAR基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of LAR gene M：DL2000 Marker；1: PCR擴增產(chǎn)物 PCR product.

圖3 陽性克隆的PCRFig.3 PCR analysis of positive clonesM：DL1000 Marker；1,2：陽性克隆PCR產(chǎn)物 Positive clones PCR products.

圖4 陽性克隆的雙酶切鑒定Fig.4 Double digestion of positive clonesM：DL1000 Marker；1,2：陽性克隆SmalⅠ和SacⅠ雙酶切Positive clones digestion by SmalⅠ and SacⅠ.

2.4 蛋白特性分析

Protparam軟件分析甘肅紅豆草LAR蛋白分子式為C1774H2802N470O526S17，分子量為39675.6，編碼362個氨基酸，其中異亮氨酸含量最高(9.1%)，色氨酸最少(0.6%)。理論等電點為5.95，原子數(shù)為5589，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為36，帶負電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為42。脂肪系數(shù)為92.35。不穩(wěn)定系數(shù)為37.84，屬于穩(wěn)定蛋白。信號肽預測表明，基因編碼的蛋白無信號肽結(jié)構(gòu)，為非分泌性蛋白(non-secretory protein)。第20位的甘氨酸(Gly)具有最高的分值2.2，疏水性最強；第331位的賴氨酸(Lys)具有最低的分值-2.822，親水性最強；平均親水性(grand average of hydroelectricity，GRAVY)值為-0.064；親水性氨基酸平均分布在整個肽鏈中，且多于疏水性氨基酸(圖5)，為親水蛋白。利用CDD保守功能區(qū)在線分析LAR的保守區(qū)預測，發(fā)現(xiàn)LAR編碼的氨基酸序列具有典型的苯(基)吡喃酮芐基醚還原酶(PCBER，phenylcoumaran benzylic ether reductase)的特征結(jié)構(gòu)域，屬于短鏈脫氫/還原酶(short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)超家族成員(cd05259)；此氨基酸序列含有NAD(P)結(jié)合位點[NAD(P) binding site]和賴氨酸活性位點(active site lysine)(圖6)。

甘肅紅豆草LAR與其他物種LAR氨基酸序列比對結(jié)果表明，其LAR氨基酸序列與豆科植物紅豆草、蒺藜苜蓿、百脈根的相似性最高，分別達到96.44%，79.01%和73.28%；與薔薇科甜櫻桃、杜鵑花科兔眼藍莓和?？破【苹ǖ南嗨菩宰畹停謩e為62.53%，60.76%和60.66%。甘肅紅豆草LAR氨基酸序列與同科植物間的相似性為67.68%～96.44%，LAR編碼的氨基酸序列在豆科植物不同種間差異明顯，這與核酸序列變化的特征基本一致(圖7)。甘肅紅豆草LAR與其他科植物比較，其相似性更低。說明在同源關(guān)系相近的植物中LAR基因的保守性很強。

2.5 系統(tǒng)進化分析

對NCBI下載的9個物種的LAR氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)甘肅紅豆草LAR蛋白與豆科植物紅豆草親緣關(guān)系最近；它與豆科植物蒺藜苜蓿和豌豆的親緣關(guān)系也較近，其次為豆科植物大豆、百脈根和大百脈根。LAR蛋白與杜鵑花科兔眼藍莓、?？破【苹ê退N薇科甜櫻桃的親緣關(guān)系相對最遠(圖8)。豆科不同物種明顯聚類成一組，而其他科植物聚類為另一組。說明不同物種的LAR蛋白具有明顯的種屬特性，LAR蛋白在種間的變化也反映了植物學分類特征。

表2 甘肅紅豆草LAR基因與其他植物LAR基因cDNA序列相似性比較

圖5 LAR氨基酸序列疏水性分析Fig.5 The analysis of hydrophobicity of LAR polypeptide

圖6 預測的LAR蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Putative conversed domains of LAR protein

圖7 不同種LAR氨基酸序列比較Fig.7 Comparison of the amino acid sequences of LAR in different species O. viciifolia cv.GS：甘肅紅豆草(未公布)；O. viciifolia：紅豆草(AEF14422)；M. truncatula：蒺藜苜蓿(XP-003591830)；L. corniculatus：百脈根(ABC71331)；P. sativum：豌豆(AII26024)；G．max：大豆(AME23933)；L. uliginosus：大百脈根(AAU45392)；P. avium：甜櫻桃(ADY15310)；V. ashei：兔眼藍莓(AB610768)；H. lupulus：啤酒花(AEV899641)；Consensus：表示一致性序列，并在序列下用小寫字母列出；根據(jù)保守程度高低依次使用黑色、紅色和藍色陰影表示。括號中的編號為GenBank登錄號。Consensus indicates same sequences and are listed below in lowercase letters. According to the degree of conservation, black, blue and red are indicated. The numbers in parentheses indicate accession number of GenBank.

2.6 不同器官LAR基因表達和縮合單寧含量

采用半定量RT-PCR的方法分析LAR基因在莖、葉、花、果中的表達情況，結(jié)果見圖9。半定量結(jié)果表明LAR在甘肅紅豆草的各個器官中均表達，在葉中表達量最高，其次是花和果，在莖中表達量最低。縮合單寧含量在器官間的高低變化特征與LAR基因表達特征一致(圖10)。

圖8 LAR蛋白與其他物種LAR類蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of LAR proteins in O. viciifolia cv.Gansu and other species GenBank登錄號與圖7同。Accession number of GenBank is the same as Fig.7.

3 討論

圖9 甘肅紅豆草不同器官LAR表達的半定量RT-PCRFig.9 Semi-quantitative RT-PCR of LAR expression in different organs of O. viciifolia cv.Gansu

圖10 甘肅紅豆草不同器官縮合單寧含量Fig.10 Condensed tannins contents in different organs of O. viciifolia cv.Gansu

3.1 甘肅紅豆草總RNA提取法的改良及其效果評價

目前，對不同物種植物和組織器官提取RNA的方法進行了廣泛的研究，已獲得一些科學高效的方法[18-20]。但是仍然不能滿足實際實驗過程的需要，表現(xiàn)出不同種類的植物提取方法和效果差異較大，同一種植物不同的組織其RNA提取方法也需要調(diào)整；即使同一種植物同一組織，因植株基因型不同，RNA提取方法也可能不相同[18-21]。因此，根據(jù)植物組織的特點，摸索出適合不同植物針對性強的高質(zhì)量RNA提取方法十分必要。

紅豆草在生長過程中積累了諸如縮合單寧、多糖等大量的次生代謝物。與同科植物紫花苜蓿比較，紅豆草葉片積累更多的縮合單寧[5]。其組織中RNase的活性也較高，這些因素導致紅豆草RNA的提取難度更大。因此，獲得高質(zhì)量的RNA成為進行紅豆草分子生物學研究首要需解決的問題。本研究起初嘗試多種商業(yè)試劑盒提取紅豆草RNA，但在提取效果和穩(wěn)定性方面都難以滿足基因克隆和后續(xù)的實驗。為此，對傳統(tǒng)的CTAB法進行改良。實驗過程中在最初的提取緩沖液中加入4%PVP以防止次生代謝物與RNA結(jié)合；加入2%β-巰基乙醇以減少多酚物質(zhì)的干擾；利用水飽和酚∶氯仿∶異戊醇抽提以去除DNA、蛋白質(zhì)及葉綠素、花青素等色素類物質(zhì)對RNA的干擾。通過使用LiCl選擇性沉淀RNA，使RNA與多糖有效分離。將2管粗提RNA合并為1管進行純化，這樣既消除了多酚、次生代謝物及色素的影響，還能彌補純化過程中RNA的損失，保證了RNA的含量，提高其純度。應用該方法提取的紅豆草RNA，28s和18s條帶較清晰，無DNA污染，同時在下游反轉(zhuǎn)錄實驗中得到成功的應用。改良的RNA提取方法簡單、有效，所使用藥品為普通生化試劑。在提取的RNA效果、質(zhì)量和價格方面與一般的商業(yè)試劑盒相比具有明顯的優(yōu)勢，是一種實用的方法。另外，提取純化后獲得的RNA具有穩(wěn)定性強的特點，可適用于紅豆草不同器官RNA的提取和下游分子生物學實驗。

3.2 甘肅紅豆草LAR基因序列和表達分析

植物次生代謝物合成與積累量取決于其合成途徑中的限速酶，限速酶在植物次生代謝物生物合成途徑中往往位于代謝支路分叉口或途徑的下游。植物縮合單寧合成代謝途徑末端酶的無色花青素還原酶(LAR)基因克隆與分析，有助于解析植物次生代謝縮合單寧合成和積累的機制。本研究對RT-PCR克隆的甘肅紅豆草LAR基因cDNA片段利用相關(guān)軟件進行了生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)其LAR基因具備一個完整的開放閱讀框架，大小為1089 bp；它屬于SDR超家族成員，含有NAD(P)結(jié)合位點和賴氨酸活性位點(圖6)。這與依賴于無色花青素還原酶催化生成縮合單寧需要NAD(P)H參與的研究結(jié)果一致[22]。研究也發(fā)現(xiàn)豆科山螞蝗屬植物銀葉藤[22]和蓼科植物金蕎麥[23]LAR蛋白同樣含有NAD(P)結(jié)合位點和賴氨酸活性位。由此推斷該蛋白具有花青素還原酶的典型的結(jié)構(gòu)特征和生物特性，超量表達可以提高縮合單寧的含量。

甘肅紅豆草LAR基因全長序列與同屬植物已知序列[24]的相似性高達98%，與不同屬的幾種豆科植物的相似性在76%～93%，而與其他科植物的相似性在75%以下(表2，圖7，8)，聚類分析表明豆科與非豆科幾種植物明顯聚為兩類。說明在同源關(guān)系相近的植物中LAR基因的保守性強，這與其他學者對其他基因在不同物種同源性分析時的結(jié)論一致，即屬內(nèi)同源性高，屬間或種間相對低[25-27]?？梢?，LAR序列在不同種植物間的差異基本符合植物學分類，在一定程度上反映不同物種的親緣關(guān)系遠近。甘肅紅豆草LAR與其他幾種不同屬豆科植物和其他科植物在核酸序列的相似性都存在較大的差異(表2)?？梢?，LAR蛋白在進化上多樣性，即它們是由不同祖先蛋白趨同進化的結(jié)果[26]。

縮合單寧含量高低影響牧草飼用品質(zhì)和營養(yǎng)價值，同時縮合單寧對于植物具有抗紫外線、抗病、抗蟲、清除自由基等功能。適量地增加牧草中縮合單寧的含量可以減緩反芻動物瘤胃中大量蛋白的快速分解，進而避免形成過多氣體而造成胃和腸道腫大導致的臌脹病。大量研究表明LAR基因的表達與縮合單寧的累積有關(guān)[10,12,28]。本研究證實，LAR基因在甘肅紅豆草的不同器官中均有表達且具有很強的組織特異性，其中在葉中表達量最高，其次是花和果，在莖中只有微量表達。研究也發(fā)現(xiàn)縮合單寧含量在不同器官的變化順序依次為葉>花>果>莖。可推斷甘肅紅豆草LAR表達和縮合單寧的合成密切相關(guān)。毛白楊LAR表達在不同器官差異顯示，PtrLAR1和PtrLAR3在根中含量最高，其次是莖、成熟葉片，在幼葉和葉柄中含量較低，這也與毛白楊器官間縮合單寧含量的差異順序一致[7]。研究也證實葡萄編碼無色花色素還原酶的VvLAR基因通過其組織及時空表達的特異性調(diào)控葡萄果實發(fā)育過程中原花色素的種類和積累[10]。進一步說明編碼無色花色素還原酶的LAR基因在器官間的表達量差異較大，具有很強的組織和時空表達的特異性，而且與縮合單寧積累密切相關(guān)，也可能影響牧草的產(chǎn)量和品質(zhì)[29]?？梢姡琇AR基因在不同器官間表達差異的分子機制的研究也十分必要，這將為調(diào)控縮合單寧的積累提供必要的借鑒。

4 結(jié)論

以甘肅紅豆草為材料，采用常規(guī)CTAB法提取總RNA后，增加總RNA粗提物的純化步驟，得到高質(zhì)量的總RNA。以獲得的總RNA為模板，通過RT-PCR克隆無色花青素還原酶LAR基因。獲得的LAR基因與已發(fā)表的LAR基因具有98.34%的相似性，其開放閱讀框長為1089 bp，編碼362個氨基酸殘基；預測編碼的蛋白質(zhì)具有典型的苯(基)吡喃酮芐基醚還原酶的特征結(jié)構(gòu)域，含有NAD(P)結(jié)合位點和賴氨酸活性位點。注冊該基因到GenBank中，注冊號為KP013623。表達分析發(fā)現(xiàn)，LAR基因在甘肅紅豆草葉中表達量最高，其次是花和果，莖中表達量最低，這與器官間縮合單寧含量的變化規(guī)律一致，推測LAR表達與縮合單寧器官間的積累差異有關(guān)。這些成果的取得為紅豆草種質(zhì)資源改良提供理論支持和技術(shù)保障，也為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高紫花苜蓿葉片縮合單寧的含量，以改善紫花苜蓿品質(zhì)、培育抗臌脹病苜蓿新品質(zhì)提供理論依據(jù)。

[1] Chen B S. Research of yield and nutrition in sainfoin. Grassland of China, 1983, (2): 36-38.

[2] Chen B S. Sainfoin is an excellent leguminous forage and a plant for water and soil conservation. Science of Soil and Water Conservation, 1984, 29(8): 14-18.

[3] Chen B S. Sainfoin[M]. Lanzhou: Gansu Science and Technology Press, 1992: 18.

[4] Howarth R E, Sarkar S K, Fesser A C,etal. Some properties of soluble proteins from alfalfa (Medicagosativa) herbage and their possible relation to ruminant bloat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1977, 25(1): 175-179.

[5] Wu Z L, Niu J L, Zhang Y P,etal. Tannin dynamics study for sainfoin. Chinese Journal of Grassland, 1993, (5): 25-27.

[6] McMahon L R, McAllister T A, Berg B,etal. A review of the effects of forage condensed tannins on ruminal fermentation and bloat in grazing cattle. Canadian Journal of Plant Science, 2000, 80: 469-485.

[7] Wang Y P, Yang Z M, Zhang B. Identification of protein related to biosynthesis of condensed Tannin inOnobrychistanaiticaspreng. Acta Agrestia Sinica, 2000, 8(2): 126-131.

[8] Zhao W J, Zhang D, Ma L J,etal. Biosynthetic pathway, functional genes and metabolic engineering of proanthocyanidins. Plant Physiology Communications, 2009, 45(5): 509-519.

[9] Xie D Y, Sharma S B, Paiva N L,etal. Role of anthocyanidin reductase, encoded by BANYULS in plant flavonoid biosynthesis. Science, 2003, 299: 396-399.

[10] Bogs J, Downey M O, Harvey J S,etal. Proanthocyanidin synthesis and expression of genes encoding leucoanthocyanidin reductase and anthocyanidin reductase in developing grape berries and grapevine leaves. Plant Physiology, 2005, 139(2): 652-663.

[11] Yuan L, Wang L, Han Z,etal. Molecular cloning and characterization of PtrLAR3, a gene encoding leucoanthocyanidin reductase fromPopulustrichocarpa, and its constitutive expression enhances fungal resistance in transgenic plants. Journal of Experiment Botany, 2012, 63(7): 2513-2524.

[12] Paolocci F, Robbins M P, Madeo L,etal. Ectopic expression of a basic helix-loop-helix gene transactivates parallel pathways of proanthocyanidin biosyn thesis: structure, expression analysis, and genetic control of leucoanthocyanidin 4-reductase and anthocyanidin reductase genes in Lotus corniculatus. Plant Physiology, 2007, 143(1): 504-516.

[13] Wang Y, Zhang Q L, Luo Z R. Isolation and expression of gene encoding leucoanthocyanidin reductase fromDiospyroskakiduring fruit development. Biologia Plantarum, 2010, 54(4): 707-710.

[14] Pang Y, Wenger J P, Saathoff K,etal. A WD40 repeat protein fromMedicagotruncatulais necessary for tissue-specific anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis but not for trichome development. Plant Physiology, 2009,151(3): 1114-1129.

[15] Sambrook J, Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual[M]. Vol.2. Beijing: Beijing Sciences Press, 1995: 343-392.

[16] Shi B S, Zhuo L H. Modification and comparation of total extraction methods fromPrunuscerasiferaleaves. Molecular Plant Breeding, 2006, 4(5): 721-725.

[17] Terrill T H, Rowan A M, Douglas G B.etal. Determination of extractable and bound condensed tannin concentrations in forage plants, prote in concentrate meals and cereal grains. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1992, 58(3): 321-329.

[18] Li H, Wang X L. The difficulties in the isloation of RNA from plant tissues and their resolving strategies. Bio Technology Information, 1999, (1): 36-39.

[19] Gasic K, Hernandez A, Korban S S. RNA extraction from different apple tissues rich in polyphenols and polysaccharides for cDNA library construction. Plant Molecular Biology Reporter, 2004, 22(4): 437-438.

[20] Rodrigues S M, Soares V L F, de Oliveira T M,etal. Isolation and purification of RNA from tissues rich in polyphenols, polysaccharides, and pigments of annatto (BixaOrellanaL.). Molecular Biotechnology, 2007, 37(3): 220-224.

[21] Ainsworth C. Isolation of RNA from floral tissue ofRumexacetosa(sorrel). Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12(3): 198-203.

[22] Tanner G J, Francki K T, Abrahams S,etal. Proanthocyanidin biosynthesis in plants:purification of legume leucoanthocyanidin reductase and molecular cloning of its cDNA. Journal of Biology Chemistry, 2003, 278: 31647-31656.

[23] Ma J, Wang B, Dai Y,etal. Cloning and expression analysis of leucoanthocyanidin reductase gene inFagopyrumdibotrys. Acta Pharmaceutica Sinica, 2012, 47(7): 953-961.

[24] Thill J, Regos I, Farag M A,etal. Polyphenol metabolism provides a screening tool for beneficial effects ofOnobrychisviciifolia(sainfoin). Phytochemistry, 2012, 82: 67-80.

[25] Shen B Y, Liu Y H, Zhang J L,etal. Analysis of cloning and sequence characteristics of cDNA ending the GBSS I gene from tubers ofSloanumtuberosum. Acta Prataculturae Sinica, 2010, 19(5): 1-8.

[26] Li L Q, Huang Y B, Wang X Y. Cloning, sequence analysis and prokaryotic expression of the WRKY6 gene of potato. Acta Prataculturae Sinica, 2011, 20(2): 177-183.

[27] Lv H Y, Li Y X, Kong F J,etal. Recent progress in studies on Na+/H+antiporter in plants. Chinese Bulletin of Botany, 2003, 20(3): 363-369.

[28] Wang L, Jiang Y, Yuan L,etal.Isolation and characterization of cDNAs encoding leucoanthocyanidin reductase and anthocyanidin reductase fromPopulustrichocarpa. PLoS One, 2013, 8(5): e64664. doi: 10.1371/journal. Pone. 0064664.

[29] Daniel A H. Biomass allocation is an important determinant of the tannin concentration in growing plants. Annals of Botany, 2007, 99: 111-120.

參考文獻：

[1] 陳寶書. 紅豆草產(chǎn)量和營養(yǎng)成分的研究. 中國草原, 1983, (2): 36-38.

[2] 陳寶書. 紅豆草是優(yōu)良的豆科牧草和水土保持植物. 中國水土保持, 1984, 29(8): 14-18.

[3] 陳寶書. 紅豆草[M]. 蘭州: 甘肅科學技術(shù)出版社, 1992: 18.

[5] 吳自立, 牛菊蘭, 張躍平, 等. 紅豆草中丹寧的動態(tài)研究. 中國草地學報, 1993, (5): 25-27.

[7] 王玉萍, 楊茁萌, 張博. 頓河紅豆草縮合單寧生物合成相關(guān)蛋白鑒定. 草地學報, 2000, 8(2): 126-131.

[8] 趙文軍, 張迪, 馬麗娟, 等. 原花青素的生物合成途徑、功能基因和代謝工程. 植物生理學通訊, 2009, 45(5): 509-519.

[15] 薩姆布魯克J, 拉塞爾D W. 分子克隆實驗指南[M]. 2版. 北京: 科學出版社, 1995: 343-392.

[16] 史寶勝, 卓麗環(huán). 紫葉李葉片總RNA提取方法的改進與比較. 分子植物育種, 2006, 4(5): 721-725.

[18] 李宏, 王新力. 植物組織RNA提取的難點及對策. 生物技術(shù)通報, 1999, (1): 36-39.

[23] 馬婧, 王斌, 代銀, 等. 金蕎麥無色花色素還原酶基因FdLAR的克隆和表達分析. 藥學學報, 2012, 47(7): 953-961.

[25] 沈?qū)氃? 劉玉匯, 張俊蓮, 等. 馬鈴薯塊莖GBSSI基因的cDNA克隆及其序列特征分析. 草業(yè)學報, 2010, 19(5): 1-8.

[26] 李立芹, 黃玉碧, 王西瑤. 馬鈴薯WRKY6基因的克隆、序列分析與原核表達研究. 草業(yè)學報, 2011, 20(2): 177-183.

[27] 呂慧穎, 李銀心, 孔凡江, 等. 植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白研究進展. 植物學通報, 2003, 20(3): 363-369.

Cloning and Expression Analysis of a Leucoanthocyanidin Reductase (LAR) Gene fromOnobrychisviciifoliacv.Gansu

CHEN Chun-Yan1,2,3,4, MA Hui-Ling1,3,4*, DONG Wen-Ke1,3,4

1.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.CollegeofAgronomy,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China; 3.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Lanzhou730070,China; 4.Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

A leucoanthocyanidin reductase (LAR) gene was cloned using RT-PCR fromOnobrychisviciifolia(sainfoin) cv. Gansu, and the level of LAR gene expression was analyzed in different plant organs. The LAR gene sequence fromO.viciifoliacv. Gansu shared a high level of similarity (98.34% homology) with anO.viciifoliaLAR gene in GenBank (accession No: HM152980). However, the coding sequence of amino acids is obviously different from those in other genera of the Fabaceae. The open reading frame (ORF) comprised 1089 bp, encoding 362 amino acid residues. The sequence of the LAR gene from the present study was submitted to GenBank with the accession number KP013623. LAR expression differed between plant organs ofO.viciifoliacv. Gansu. LAR expression was highest in leaves, followed by flowers and fruit, and was lowest in stem tissues, which corresponded to concentration of condensed tannins in different organs ofO.viciifoliacv. Gansu. It is inferred that LAR gene expression is in some way involved in condensed tannin accumulation inO.viciifoliacv.Gansu. These results provide fundamental information and a method for exploring the regulation mechanism of condensed tannin accumulation.

Onobrychisviciifoliacv.Gansu; RT-PCR; leucoanthocyanidin reductase; cloning and expression

10.11686/cyxb2014452

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-11-03；改回日期：2015-01-07

甘肅省科技廳科技支撐計劃項目(1104NKCA087)和國家自然科學基金項目(31200299)資助。

陳春艷(1977-)，女，甘肅蘭州人，實驗師，在讀博士。E-mail:ccy0713@126.com *通訊作者Corresponding author. E-mail:mahl@gsau.edu.cn

陳春艷，馬暉玲，董文科. 甘肅紅豆草無色花青素還原酶LAR基因的克隆和表達分析. 草業(yè)學報, 2015, 24(6): 177-187.

Chen C Y, Ma H L, Dong W K. Cloning and Expression Analysis of a Leucoanthocyanidin Reductase (LAR) Gene fromOnobrychisviciifoliacv.Gansu. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 177-187.