郭志成 楊宏芳 王曉慧

上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院（上海200438）

過(guò)度訓(xùn)練是指長(zhǎng)時(shí)間訓(xùn)練導(dǎo)致的身體疲勞和機(jī)能下降在短時(shí)間內(nèi)不能恢復(fù)， 疲勞不斷增加或累積且運(yùn)動(dòng)能力下降。過(guò)度訓(xùn)練在競(jìng)技體育中并不少見(jiàn)，特別是備戰(zhàn)比賽前的集訓(xùn)期。 過(guò)度訓(xùn)練不僅降低運(yùn)動(dòng)能力，還可能使運(yùn)動(dòng)員出現(xiàn)呼吸道感染等運(yùn)動(dòng)性免疫抑制癥狀，影響訓(xùn)練和比賽。目前，除運(yùn)動(dòng)員的主觀感覺(jué)外，多應(yīng)用7大類生理指標(biāo)（血睪酮水平、皮質(zhì)醇水平，睪酮/皮質(zhì)醇比值，晨脈，Hb水平，血尿素、血清肌酸激酶）的綜合評(píng)定來(lái)反映運(yùn)動(dòng)員是否出現(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練及過(guò)度訓(xùn)練的程度和原因，但這些指標(biāo)均沒(méi)有特異性，且個(gè)體差異較大，不能準(zhǔn)確地反映過(guò)度訓(xùn)練。 因此，需要有某種分子能準(zhǔn)確地反映過(guò)度訓(xùn)練，并且檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速。近年來(lái)的研究顯示， 血漿游離DNA （cell free DNA，cfDNA）的水平很可能是一個(gè)很好的候選分子。

cfDNA是指血漿或血清中未與細(xì)胞結(jié)合的雙鏈DNA片段。 正常人體中血漿cfDNA的水平很低，當(dāng)各種原因如腫瘤、過(guò)度訓(xùn)練等使組織、細(xì)胞過(guò)氧化，或使組織、細(xì)胞損傷、壞死而發(fā)生炎癥時(shí)可使血漿cfDNA水平顯著增加。 因此，血漿cfDNA水平也成為部分腫瘤如結(jié)腸癌[1]、乳腺癌[2]和前列腺癌[3]發(fā)生的敏感監(jiān)測(cè)指標(biāo)。 自1982年首次報(bào)道了運(yùn)動(dòng)通過(guò)增多的自由基損傷組織，引起DNA斷裂，使血中出現(xiàn)較多的cfDNA[4]之后，近幾年來(lái)關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)血漿cfDNA的影響及意義越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。已發(fā)現(xiàn)多種運(yùn)動(dòng)方式，如馬拉松[5-7]、舉重[8]等耐力或抗阻的力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)使cfDNA水平增加。且血中cfDNA的水平與過(guò)度運(yùn)動(dòng)所致無(wú)菌性炎癥的嚴(yán)重程度[9]或運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[10]成正比。 血漿cfDNA的水平被認(rèn)為是目前最有希望成為反映過(guò)度訓(xùn)練的特異指標(biāo)[11]。

目前，用real time PCR方法研究血漿cfDNA水平的幾乎都是針對(duì)人的研究，尚缺乏針對(duì)大、小鼠的研究。本課題組前期的研究建立了檢測(cè)大鼠血漿cfDNA水平的real time PCR的方法，并研究了大強(qiáng)度訓(xùn)練所致的過(guò)度訓(xùn)練對(duì)雄性大鼠血漿cfDNA水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練雄性大鼠的血漿cfDNA水平顯著升高（約增加4.53倍）， 血漿cfDNA水平能成為雄性大鼠過(guò)度訓(xùn)練的新監(jiān)測(cè)指標(biāo)[12]。 本研究在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)由大負(fù)荷訓(xùn)練所致的過(guò)度訓(xùn)練對(duì)雌性大鼠血漿cfDNA水平的影響，研究其能否成為反映雌性大鼠過(guò)度訓(xùn)練的指標(biāo)。 這不僅為過(guò)度訓(xùn)練提供新監(jiān)測(cè)指標(biāo)， 而且可利用過(guò)度訓(xùn)練大鼠模型進(jìn)行過(guò)度訓(xùn)練機(jī)制的研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

30只2月齡健康雌性SD大鼠購(gòu)自上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （滬）2013-0018，動(dòng)物批號(hào)：2013001804004，使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2014-0002。 隨機(jī)分為3組：安靜對(duì)照組、大強(qiáng)度訓(xùn)練組和過(guò)度訓(xùn)練組，每組10只。 自由攝食、飲水。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

安靜對(duì)照組大鼠不進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。 大強(qiáng)度訓(xùn)練組和過(guò)度訓(xùn)練組大鼠在跑臺(tái)上適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)3天后進(jìn)行9周的跑臺(tái)訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6天，休息1天。 運(yùn)動(dòng)方案參照文獻(xiàn)[13-15]進(jìn)行了部分修改。 兩組大鼠的訓(xùn)練方案前6周相同，后3周大強(qiáng)度訓(xùn)練組大鼠每天訓(xùn)練30 min，而過(guò)度訓(xùn)練組大鼠訓(xùn)練到力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)給予電刺激，大鼠不繼續(xù)跑動(dòng)，停跑后呼吸急促、神情倦怠，腹臥位，捕捉時(shí)逃避反應(yīng)明顯減弱。 具體訓(xùn)練方案見(jiàn)表1。

1.3 取材

每周六上午用天平稱量各組大鼠體重。 第9周末訓(xùn)練結(jié)束后36小時(shí)，各組大鼠麻醉后進(jìn)行腹腔靜脈采血，EDTA抗凝，離心（3000 r/min，10 min）后取上清即血漿，保存于-80℃低溫冰箱內(nèi)待測(cè)。

1.4 測(cè)試方法

1.4.1 大鼠血漿游離DNA水平檢測(cè)

表1 大鼠訓(xùn)練方案

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（美國(guó)ABI公司的Step One Plus）檢測(cè)大鼠血漿游離DNA水平。 擴(kuò)增基因?yàn)榇笫蠡蚝孔钬S富的B1重復(fù)序列，它與人類Alu基因同源。 擴(kuò)增引 物 的 序 列 為：5’-CCA GGA CAC CAG GGC TAC AGA G-3’（正向）和5’-CCC GAG TGC TGG GAT TAA AG-3’（反向），擴(kuò)增產(chǎn)物109 bp。 25 μl的PCR反應(yīng)體系為：2 μl 的10 倍 稀 釋 的 大 鼠 血 漿，2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix （Thermo scientific公司）12.5 μl，25 μM的上下游引物各0.3 μl， 不含DNA和RNA的去離子水9.9 μl。 95°C預(yù)變性8 min后，95°C變性30 s，55°C退火40 s，72°C延伸1 min，50個(gè)循環(huán)。 不同濃度的大鼠DNA標(biāo)準(zhǔn)品在同一條件下進(jìn)行擴(kuò)增， 做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有標(biāo)準(zhǔn)品和血漿樣品都做復(fù)孔。根據(jù)溶解曲線判斷擴(kuò)增的特異性， 再根據(jù)擴(kuò)增曲線設(shè)定基線和閾值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得各樣本的Ct值及DNA濃度。

1.4.2 大鼠血漿睪酮（T）、皮質(zhì)酮（Cort）水平和T/C比值

睪酮和皮質(zhì)酮ELISA試劑盒分別購(gòu)于美國(guó)R&D和美國(guó)CUSABIO公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。睪酮的值除以皮質(zhì)酮的值即為T/C比值。

1.4.3 大鼠血漿肌酸激酶和氧化、抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

各檢測(cè)指標(biāo)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。 比色法檢測(cè)大鼠血漿肌酸激酶（CK）水平和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的活性。 將0.1 ml血漿在37°C反應(yīng)5 min使GSH濃度降低1 μmol/L定義為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的一個(gè)酶活力單位。 TBA法檢測(cè)大鼠血漿丙二醛（MDA）含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件包處理分析， 所有數(shù)據(jù)均以± s 表示。 體重采用重復(fù)測(cè)量方差分析；其余各指標(biāo)采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。 皮爾森相關(guān)系數(shù)分析過(guò)度訓(xùn)練組cfDNA與其他指標(biāo)的相關(guān)性。 P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化

本研究中過(guò)度訓(xùn)練組有2只大鼠在第8周因肺炎死亡，可能與過(guò)度訓(xùn)練致大鼠抵抗力降低有關(guān)。實(shí)驗(yàn)前和6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練后3組大鼠體重?zé)o顯著性差異，而9周后大強(qiáng)度訓(xùn)練組和過(guò)度訓(xùn)練組大鼠的體重與安靜對(duì)照組相比均顯著降低，且過(guò)度訓(xùn)練組降低得更明顯。過(guò)度訓(xùn)練組大鼠體重從第7周力竭運(yùn)動(dòng)開(kāi)始增長(zhǎng)緩慢， 第8周停止增長(zhǎng)，第9周下降；而大強(qiáng)度訓(xùn)練組大鼠體重在第7、8周還持續(xù)增長(zhǎng)，到第9周停止增長(zhǎng)（表2）。

2.2 各組大鼠血漿T、Cort水平和T/C比值

與安靜對(duì)照組相比，過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿T水平顯著降低（P < 0.05），而大強(qiáng)度訓(xùn)練組大鼠血漿T水平無(wú)變化；大強(qiáng)度訓(xùn)練和過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿Cort水平均顯著升高（P < 0.05，P < 0.01）、T/C比值均顯著降低（P <0.01）。 與大強(qiáng)度訓(xùn)練組相比，過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿Cort顯著增加（P < 0.01）， 而血漿T水平和T/C比值無(wú)差異（表3）。

表2 各組大鼠體重變化（± s）

表2 各組大鼠體重變化（± s）

*P < 0.05，**P < 0.01，與安靜對(duì)照組相比；#P < 0.05，與大強(qiáng)度訓(xùn)練組相比。

?????(g) ?? ?????(g) 6 ? 7 ? 8 ? 9 ? ??????n = 10? 189.25???6.12? 249.86???15.48? 263.55???13.34? 269.82???14.04? 278.25???10.24????????n?=?10?? 186.21???7.84? 244.79???11.53? 249.98???11.89?? 259.39???11.31?? 257.52???12.91?????????n?=?8?? 192.8???11.77? 251.35???15.91? 256.81???16.50?? 256.10???14.46??? 251.44???14.43????

與安靜對(duì)照組相比， 大強(qiáng)度訓(xùn)練組和過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿cfDNA水平均顯著增加（P < 0.05，P < 0.01），均值分別是對(duì)照組的2.04倍和4.46倍左右；與大強(qiáng)度訓(xùn)練組相比，過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿cfDNA水平顯著升高（P< 0.05），均值約是大強(qiáng)度訓(xùn)練組的2.19倍（表3）。

表3 各組大鼠血漿T、Cort、T/C比值以及血漿cfDNA水平比較（± s）

表3 各組大鼠血漿T、Cort、T/C比值以及血漿cfDNA水平比較（± s）

*P < 0.05，**P < 0.01，與安靜對(duì)照組相比；#P < 0.05，##P < 0.01，與大強(qiáng)度訓(xùn)練組相比。

?? ??????n = 10? ???????n = 10? ??????n = 8? T??g/L? 0.35???0.19? 0.26???0.16? 0.22???0.12*?Cort??g/L?? 6.86???1.64? 10.65???2.13*? 13.58???2.83**##?T/C ??? 0.059???0.049? 0.025???0.014**? 0.021???0.013**?cfDNA?ng/L?? 8.84???5.13? 18.05???10.70*? 39.45???29.03**#?

2.3 各組大鼠血漿CK、MDA水平及血漿SOD、GSH-Px活性比較

過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿CK和MDA水平均較安靜組和大強(qiáng)度訓(xùn)練組顯著升高（P < 0.05），大強(qiáng)度訓(xùn)練組大鼠上述指標(biāo)與安靜對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P > 0.05）。血漿SOD和GSH-Px的活性3組間無(wú)顯著差異（表4）。

表4 各組大鼠血漿CK、MDA水平和SOD、GSH-Px活性比較（± s）

表4 各組大鼠血漿CK、MDA水平和SOD、GSH-Px活性比較（± s）

*P < 0.05，與安靜對(duì)照組相比；#P < 0.05，與大強(qiáng)度訓(xùn)練組相比。

?? ??????n = 10? ???????n = 10? ??????n = 8? CK?U/L? 243.97???68.94? 259.14???56.97? 329.72???52.94*#?MDA?nmol/ml?? 3.99???0.68? 4.35???0.?53? 5.14???1.02*#?SOD?U/ml?? 77.96???5.57? 79.11???7.50? 74.41???7.91?GSH-Px?U?? 1896.97???174.49? 1832.22???165.92? 1891.67???194.34?

2.4 過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿cfDNA水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性

如表5所示， 血漿cfDNA水平與血漿Cort、T/C比值的相關(guān)系數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為0.834（P < 0.01）、-0.459 （P < 0.05）。 血 漿cfDNA 水 平 與T、CK、MDA、GSH-Px和SOD的相關(guān)系數(shù)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P >0.05）。

表5 血漿cfDNA水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

3.1 血漿cfDNA是否能成為過(guò)度訓(xùn)練的監(jiān)測(cè)指標(biāo)?

對(duì)過(guò)度訓(xùn)練動(dòng)物模型的判斷主要是通過(guò)訓(xùn)練史、動(dòng)物的形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)來(lái)確定。 體重下降常常提示有過(guò)度訓(xùn)練的可能， 運(yùn)動(dòng)能力下降在過(guò)度訓(xùn)練中也較突出。 此外，7大類生理指標(biāo)在判斷過(guò)度訓(xùn)練中起著非常重要的作用。 以往的過(guò)度訓(xùn)練動(dòng)物模型中常見(jiàn)的是血睪酮水平、 血皮質(zhì)酮水平、T/C比值和Hb水平顯著下降，血清CK和尿素顯著升高[15]等。本研究采用的過(guò)度訓(xùn)練模型 （6周遞增訓(xùn)練+3周大強(qiáng)度力竭訓(xùn)練）已被證實(shí)是一成功的過(guò)度訓(xùn)練模型[13，14]。 同時(shí)，本研究還設(shè)一大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)照組，即前6周的遞增訓(xùn)練方案完全一樣，后3周的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度也相同，但訓(xùn)練時(shí)間為30 min，而不是運(yùn)動(dòng)到力竭。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)度訓(xùn)練雌性大鼠有2只大鼠因肺炎死亡；其余過(guò)度訓(xùn)練大鼠皮毛枯槁、眼神倦怠無(wú)光、體重降低；在造模后期大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間減少，提示運(yùn)動(dòng)能力降低。 運(yùn)動(dòng)后36 h過(guò)度訓(xùn)練大鼠血漿T水平、T/C比值顯著下降， 血漿Cort和CK顯著升高，表明過(guò)度訓(xùn)練組的雌性大鼠存在過(guò)度訓(xùn)練。 而大強(qiáng)度訓(xùn)練組大鼠則一般情況尚可，體重沒(méi)有出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)；運(yùn)動(dòng)能力也沒(méi)有顯著變化； 運(yùn)動(dòng)后36 h的血漿T、CK水平?jīng)]有改變，但T/C比值因Cort的顯著增加而顯著下降，表明大強(qiáng)度訓(xùn)練組大鼠未達(dá)到過(guò)度訓(xùn)練的程度。

定量PCR擴(kuò)增血漿cfDNA的特異性、敏感度主要取決于選擇的保守基因、擴(kuò)增引物及擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。 人血漿cfDNA檢測(cè)中常選擇的保守基因是β-球蛋白、肌肉生長(zhǎng)抑制素[11]和L1PA2[16]，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度分別為189 bp、88 bp和雙片段（90 bp和220 bp）。 本研究參考文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增小鼠B1基因的方法[17]，擴(kuò)增了與小鼠B1基因序列基本相同的大鼠B1基因。 由于cfDNA可能是全長(zhǎng)的， 也可能是被隨機(jī)剪切的雙鏈DNA，為提高檢出的敏感性和準(zhǔn)確性，需選擇拷貝數(shù)多的保守基因。 大、小鼠中的B1基因（與人的Alu基因同源）最保守，含量最豐富，約5萬(wàn)個(gè)拷貝，重復(fù)單位長(zhǎng)130 bp，所以不論是全長(zhǎng)的cfDNA，還是切斷的cfDNA都能檢測(cè)出來(lái)。根據(jù)溶解曲線，本研究證實(shí)該引物能特異地?cái)U(kuò)增大鼠B1基因； 測(cè)得的雌性安靜對(duì)照組大鼠血漿cfDNA為8.84 ± 5.13 ng/L，之前測(cè)得的雄性安靜對(duì)照組大鼠血漿cfDNA為2.46 ± 2.43 ng/L，推測(cè)這種差別可能來(lái)源于性別差異，也可能來(lái)源于年齡的不同（雌性大鼠17周齡，雄性大鼠13周齡）。 由于沒(méi)有正常安靜大、小鼠的血漿cfDNA范圍，缺乏大、小鼠血漿cfDNA水平的研究，所以無(wú)法比較本方法與其他方法的優(yōu)劣。

研究認(rèn)為，不論是一次大強(qiáng)度過(guò)度訓(xùn)練[5-8，18]，還是持續(xù)一段時(shí)間（慢性）的大強(qiáng)度或大負(fù)荷過(guò)度訓(xùn)練[9，11]，都可使血漿cfDNA的水平迅速升高， 且增加幅度明顯（從幾倍到幾十倍不等）； 血漿cfDNA水平增加得越顯著， 則越可能出現(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練以及過(guò)度訓(xùn)練的程度越嚴(yán)重[9]。本研究結(jié)果顯示大強(qiáng)度訓(xùn)練組和過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿cfDNA水平均升高；且過(guò)度訓(xùn)練組大鼠血漿cfDNA水平比大強(qiáng)度訓(xùn)練組大鼠高，約是后者的2.19倍（39.45± 29.03 vs 18.05 ± 10.70 ng/L）。 相關(guān)性分析顯示，雌性大鼠血漿cfDNA水平與血漿Cort水平正相關(guān)， 與T/C比值、運(yùn)動(dòng)能力顯著負(fù)相關(guān)。 以上結(jié)果提示，與雄性大鼠一樣，雌性大鼠血漿cfDNA水平也可以成為過(guò)度訓(xùn)練的監(jiān)控指標(biāo)。在耐力性運(yùn)動(dòng)持續(xù)一段時(shí)間后，若大鼠血漿cfDNA水平比安靜時(shí)增加了4、5倍以上時(shí)， 提示可能存在過(guò)度訓(xùn)練。 而大強(qiáng)度訓(xùn)練未達(dá)到過(guò)度訓(xùn)練時(shí)， 血漿cfDNA水平也會(huì)增加，但增加幅度較低。當(dāng)然，上述結(jié)果需更多的實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

如果是單次大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)， 則血漿cfDNA清除較快，通常在2～12小時(shí)內(nèi)恢復(fù)正常[5-8，18]，而慢性的大強(qiáng)度和大負(fù)荷過(guò)度訓(xùn)練不僅使血漿cfDNA快速升高，而且升高的cfDNA水平維持較久，從1天到十幾天不等，與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)負(fù)荷和運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目有關(guān)[9，11]。 因此，本研究中連續(xù)力竭運(yùn)動(dòng)所致的過(guò)度訓(xùn)練大鼠在訓(xùn)練停止后36 h （以避免運(yùn)動(dòng)對(duì)血漿激素水平的影響） 仍能檢測(cè)出高水平的血漿cfDNA水平。 根據(jù)血漿cfDNA在慢性過(guò)度訓(xùn)練中快速、明顯地增加以及清除較慢的特點(diǎn)，可以推測(cè)：若想監(jiān)測(cè)過(guò)度訓(xùn)練的出現(xiàn)和恢復(fù)過(guò)程， 或許可通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察血漿cfDNA水平在訓(xùn)練后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。 此外，用血漿cfDNA水平反映過(guò)度訓(xùn)練還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是檢測(cè)方便。 只需一滴血，就可快速（耗時(shí)3小時(shí)左右）、簡(jiǎn)便（只需分離血漿和PCR擴(kuò)增）地獲得血漿cfDNA的值。鑒于過(guò)度訓(xùn)練的危害，以及體重、運(yùn)動(dòng)能力和七大類生理指標(biāo)檢測(cè)的繁瑣、耗時(shí)和缺乏特異性，能夠簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)血漿cfDNA水平來(lái)反映過(guò)度訓(xùn)練具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3.2 過(guò)度訓(xùn)練導(dǎo)致血漿cfDNA增加的可能機(jī)制

1982年首次報(bào)道運(yùn)動(dòng)使血中出現(xiàn)cfDNA時(shí)，研究者就認(rèn)為其可能機(jī)制是運(yùn)動(dòng)通過(guò)增多的自由基引起DNA斷裂[4]。而部分研究也支持自由基增多或過(guò)氧化增強(qiáng)在運(yùn)動(dòng)使血漿cfDNA增多中的重要作用[9，10，19]。 本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度訓(xùn)練的雌性大鼠血漿cfDNA水平顯著升高的同時(shí)，血漿氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA顯著增加；但相關(guān)性分析中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA水平與MDA的相關(guān)性， 提示氧化增強(qiáng)可能與本研究由大負(fù)荷訓(xùn)練所致的過(guò)度訓(xùn)練雌性大鼠的血漿cfDNA水平的增加無(wú)關(guān)，這與我們關(guān)于大強(qiáng)度訓(xùn)練所致的雄性過(guò)度訓(xùn)練大鼠的研究結(jié)果不同，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

除了氧化增強(qiáng)在運(yùn)動(dòng)增加血漿cfDNA水平中發(fā)揮作用之外，目前還得到較多認(rèn)可的是：血漿cfDNA水平的來(lái)源是組織、細(xì)胞（包括肌肉細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等）受損后損傷DNA的釋放入血[9，11，20]。 血漿CK水平是最常用的反映骨骼肌細(xì)胞損傷及其適應(yīng)與恢復(fù)的一個(gè)敏感指標(biāo)。當(dāng)大強(qiáng)度或大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，特別是大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于肌肉細(xì)胞膜的通透性增加、肌肉的損傷，肌細(xì)胞內(nèi)的CK釋放入血，導(dǎo)致血漿CK水平增加，因此血漿CK水平反映是否存在過(guò)度訓(xùn)練。 本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度訓(xùn)練大鼠血漿CK水平顯著增加，但相關(guān)性分析中未發(fā)現(xiàn)其與血漿cfDNA水平的相關(guān)性，提示本研究的過(guò)度訓(xùn)練大鼠模型中血漿cfDNA水平的增加可能與骨骼肌損傷無(wú)關(guān)。 這個(gè)結(jié)果與我們對(duì)雄性過(guò)度訓(xùn)練大鼠的研究結(jié)果相同，也與Fatouros等的研究類似。 他們發(fā)現(xiàn)盡管中等訓(xùn)練程度的運(yùn)動(dòng)員在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后反映骨骼肌損傷的多個(gè)指標(biāo)包括血漿CK增加，但CK增加的動(dòng)力學(xué)變化和cfDNA的不同，提示運(yùn)動(dòng)后cfDNA的釋放機(jī)制可能與肌肉損傷無(wú)關(guān)[21]。

過(guò)度訓(xùn)練或大強(qiáng)度/大負(fù)荷的訓(xùn)練使血漿cfDNA增加的機(jī)制，除了上述的氧化增強(qiáng)和骨骼肌損傷機(jī)制外，目前還認(rèn)為與血漿DNase活性增強(qiáng)[18]、骨骼肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、免疫細(xì)胞釋放cfDNA、運(yùn)動(dòng)中乳酸的堆積和能量消耗等有關(guān)[11，16]。

4 總結(jié)

4.1 大強(qiáng)度訓(xùn)練和過(guò)度訓(xùn)練雌性大鼠血漿cfDNA水平均顯著增加，且后者增加得更明顯，提示血漿cfDNA水平增加得越顯著，越可能出現(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練。

4.2 雌性大鼠血漿cfDNA水平與反映過(guò)度訓(xùn)練的多個(gè)指標(biāo)如T/C比值和血漿Cort有相關(guān)性， 提示雌性大鼠血漿cfDNA水平能成為過(guò)度訓(xùn)練的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

4.3 過(guò)度訓(xùn)練雌性大鼠血漿cfDNA水平的增加可能與氧化增強(qiáng)、骨骼肌損傷無(wú)關(guān)。

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