馬耀先

(許昌市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 許昌 461000)

Artemin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

馬耀先

(許昌市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 許昌 461000)

目的 探討Artemin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組化法對90例胃癌患者的癌組織及30例胃癌患者的癌旁良性組織中的Artemin蛋白進(jìn)行檢測，統(tǒng)計學(xué)分析Artemin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，并探討推測Artemin蛋白與胃癌患者的臨床病理特征的關(guān)系。同時通過熒光定量RT-PCR法測定胃癌組織與癌旁組織中Artemin mRNA的表達(dá)差異。結(jié)果Artemin蛋白在胃癌組織中陽性表達(dá)率為78.89%，明顯高于癌旁良性組織的10.00%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且Artemin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌患者的腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有密切關(guān)系(P＜0.05)，而與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無關(guān)(P＞0.05)；Artemin mRNA在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織7.01倍，推測Artemin參與了胃癌的發(fā)生或發(fā)展的過程。結(jié)論胃癌組織中的Artemin蛋白表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，可作為有效的檢測指標(biāo)來預(yù)測分析胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲過程，具體機制有待進(jìn)一步研究。

胃癌；Artemin蛋白；免疫組化法；臨床病理特征

胃癌是我國十大常見惡性腫瘤之一，根據(jù)1973-1975年全國人口死因調(diào)查及1990-1992年1/10抽樣人口死因調(diào)查資料顯示[1]，胃癌的死亡率仍然居腫瘤死亡之首，占腫瘤中的死因構(gòu)成23.24%。盡管在全球范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率呈下降趨勢，但其病死率仍高居世界第2位[2]，僅次于肺癌，其發(fā)病率逐年升高，給社會家庭及個人帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失和心理負(fù)擔(dān)，早期胃癌大多數(shù)患者無明顯癥狀，有少數(shù)人有惡心、嘔吐或類似于潰瘍病的上消化道癥狀，由于現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)還未能有效的通過相關(guān)指標(biāo)及早發(fā)現(xiàn)臨床上胃癌的發(fā)生，往往會耽誤有效的治療時間而演變成胃癌晚期。

Artemin(ARTN)同GDNF、Neurturin(NTN)及Persephin(PSP)都是膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的家族配體(GFL)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的超家族，同時ARTN也是分泌性的磷酸化糖蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞趨化、粘附及遷移的作用[3-5]，ARTN與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的分子結(jié)合后會產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要意義。本研究旨在采用免疫組化法[6]和熒光定量PCR技術(shù)[7]檢測Artemin在胃癌組織中的表達(dá)，分析ARTN表達(dá)強度與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，探索Artemin在伴隨胃癌發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移過程中的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年3月至2014年9月在我院進(jìn)行手術(shù)治療切除的胃癌組織標(biāo)本90例，其中男性患者40例，女性患者50例，年齡36～77歲，平均(45.5±1.4)歲，患者手術(shù)前均未接受化療、放療、免疫或放射治療，術(shù)后均經(jīng)過至少兩名病理醫(yī)師獨立進(jìn)行病理學(xué)診斷確診為胃癌。標(biāo)本來源病例均具備完整的臨床病理特征及隨訪資料。其中，參照2010年WHO組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[8]分為腸型胃癌與彌漫型胃癌，其中57例腸型胃癌中，乳頭狀腺癌2例，高分化管狀腺癌24例、中分化管狀腺癌31例；43例彌漫型胃癌中，印戒細(xì)胞癌8例，低分化腺癌35例；參照2010年美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的第7版TNM分期法[9]對患者進(jìn)行分類，其中，Ⅰ期18例、Ⅱ期24例、Ⅲ期23例、Ⅳ期25例。同時，選取30例胃癌患者，其中，男性患者12例，女性患者18例，年齡35～75歲，平均（50.5±11.3）歲，取其癌旁組織（即距離胃癌腫瘤5cm以上的周圍組織）為對照標(biāo)本，所有患者手術(shù)前均未接受化療、放療、免疫或放射治療，術(shù)后均經(jīng)過至少兩名病理醫(yī)師獨立進(jìn)行病理學(xué)診斷確診為胃癌，且標(biāo)本來源病例均具備完整的臨床病理特征及隨訪資料。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 目前國內(nèi)外還沒有統(tǒng)一的胃癌納入標(biāo)準(zhǔn)，由于胃癌缺少特異性的臨床癥狀，且早期胃癌常不具明顯癥狀，患者一般會出現(xiàn)上腹部不適或疼痛、食欲減退、消瘦、乏力、惡心、嘔吐或黑便、腹瀉、發(fā)熱、腹部出現(xiàn)腫塊等癥狀，晚期轉(zhuǎn)移時，左鎖骨上淋巴結(jié)則會伴有腫大現(xiàn)象，這些癥狀往往會伴隨著胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。臨床上胃癌的診斷主要依據(jù)胃液檢查、大便隱血試驗、X線鋇餐檢查、纖維胃鏡檢查、影像學(xué)以及病理學(xué)檢查。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)沒有完整臨床病例資料；(2)圍手術(shù)期死亡者；(3)局部復(fù)發(fā)及殘余的胃癌患者；(4)在術(shù)前應(yīng)用新輔助治療者。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化法檢測Artemin蛋白 標(biāo)本采集：選取腫瘤中心壞死部分為腫瘤組織標(biāo)本，距離腫瘤組織邊緣5cm以上為癌旁組織，選取該癌旁組織作為正常對照。將組織標(biāo)本取出立即加入到10%中性甲醛溶液中固定，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋保存。測定步驟：將胃癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟切片進(jìn)行枸櫞酸加熱、抗原修復(fù)后按照Artemin蛋白(ARTN)檢測試劑盒(北京華夏雄風(fēng)科技有限公司)說明書步驟檢測Artemin蛋白。其中，用已知陽性片作為陽性對照，以pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。一抗反應(yīng)條件為4℃過夜，二抗條件為37℃，孵育30min，添加DAB試劑(北京中衫生物制品有限公司)，顯色5min，蘇木精富染、脫水、透明并封固。

1.4.2 免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 將標(biāo)本切片置于顯微鏡下，對所測的視野進(jìn)行準(zhǔn)確定位之后由攝像系統(tǒng)進(jìn)行圖象分析，并由兩名病理醫(yī)師獨立進(jìn)行判定。由于ARTN的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜處，因此細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)染色后出現(xiàn)明顯的黃色或者棕黃色顆粒則判定為陽性，隨機選取每張切片的5個(×400)的高倍視野，記錄陽性細(xì)胞百分率，視野無著色細(xì)胞則為陰性(-)；陽性著色細(xì)胞率＜25%為弱陽性(+)；著色細(xì)胞細(xì)胞率為25%～50%則為陽性(++)；陽性著色細(xì)胞率＞50%為強陽性(+++)。

1.4.3 實時熒光定量PCR檢測Artemin mRNA的表達(dá) 用Trizol試劑(MIC公司)抽提標(biāo)本總RNA，以oligo(dT)18為引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)反轉(zhuǎn)錄合成CDNA第一鏈。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，95℃變性30 s，69℃退火30 s，57℃30 s、72℃熒光檢測1min，重復(fù)36個循環(huán)，72℃5min，在熒光定量PCR儀(天隆科技有限公司，TL988-Ⅰ型)上進(jìn)行實時定量PCR檢測。引物生成，內(nèi)參β-actin上游5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'，下游5'-ATCTTCAAACCTCCATGATA-3'，產(chǎn)物136 bp。Artemin上游5'-TGGCCGCTCTGG-CTCTGCTGA-3'，下游5'-TGAGGTCTGGTGTCTTTT AGG-3'，產(chǎn)物382 bp。并計算胃癌Artemin mRNA表達(dá)的倍數(shù)，目的基因的mRNA相對表達(dá)水平用2-△Ct表示(△Ct=目的基因Ct值-β-actin基因Ct值)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Artemin蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果見圖1，結(jié)合表1可知，在90例胃癌組織中的Artemin陽性71例，其陽性率為78.89%；在30例癌旁組織中Artemin陽性3例，陽性率為10.00%，Artemin在胃癌組織中的陽性率明顯高于在癌旁組織的陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 免疫組化法觀察到Artemin蛋白在組織中的表達(dá)

表1 Artemin在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 Artemin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系 由表2可知，Artemin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌患者的腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有密切關(guān)系(P＜0.05)，而與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小及分化程度均無關(guān)(P＞0.05)。

表2 Artemin在胃癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 Artemin mRNA在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)結(jié)果 由表3可知，以癌旁組織中的β-Actin mRNA量為1，計算出Artemin mRNA在胃癌組織中的表達(dá)量是在癌旁組織中的7.01倍。

表3 胃癌組織及癌旁組織中Artemin mRNA表達(dá)的比較(±s)

表3 胃癌組織及癌旁組織中Artemin mRNA表達(dá)的比較(±s)

注：a△Ct=Ct目的基因-Ctβ-Actin。

項目2-△Ct倍數(shù)組織細(xì)胞類型Ct -△Ctaβ-Actin Artemin癌旁組織胃癌組織癌旁組織21.37±3.7522.57±3.4625.38±5.230 -1.20 -4.011 --7.010.43530.0621

3 討 論

腫瘤的轉(zhuǎn)移過程是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程，與腫瘤細(xì)胞的增殖能力、運轉(zhuǎn)能力及侵襲能力關(guān)系密切，且腫瘤細(xì)胞極易侵襲性生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。目前關(guān)于胃癌的具體發(fā)病機制以及其發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞、基因中的等相關(guān)指標(biāo)變化還未闡明清楚，從基因和蛋白水平出發(fā)，現(xiàn)代研究[10-12]已證明，Artemin蛋白、vegf165b重組蛋白、MMP-9、骨橋蛋白、COX-2蛋白、整合素α5β1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及淋巴轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)聯(lián)。

研究表明[6]，Artemin是由113個氨基酸及7個保守的半胱氨酸殘基組成，且傾向于結(jié)合GFRα3受體，形成受體復(fù)合物，再通過糖基-磷脂酰肌醇結(jié)合于細(xì)胞膜，激活Ret，進(jìn)而傳遞信號，一旦與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的分子結(jié)合后將會產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。臨床研究[13-15]也同樣發(fā)現(xiàn)，Artemin蛋白在胰腺癌中高度表達(dá)，在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，Artemin蛋白的表達(dá)可能與乳腺癌的疾病進(jìn)展、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系，Artemin蛋白的表達(dá)也能夠影響食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

本研究結(jié)果Artemin蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁的良性組織，差異具有顯著性意義，提示Artemin蛋白的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生有一定的關(guān)系；Artemin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌患者的腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有密切關(guān)系(P＜0.05)，而與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無關(guān)(P＞0.05)，推測Artemin蛋白的高表達(dá)可能是對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲演變過程中的一種反映；Artemin mRNA在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，推測Artemin蛋白參與了胃癌的發(fā)生或發(fā)展的過程。

綜上所述，Artemin蛋白在一定程度上可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測Artemin蛋白可作為監(jiān)測中國人群胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲及預(yù)后情況的有效指標(biāo)之一，具體的機制有待進(jìn)一步研究。

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Expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues and its relationship with the clinicopathological features.

MA Yao-xian.Department of Oncology,the Central Hospital of Xuchang,Xuchang461000,Henan,CHINA

ObjectiveTo investigate expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues and its relationship with the clinicopathological features.MethodsThe expression of Artemin protein was detected by immunohistochemistry in gastric carcinoma tissues(from90 patients of gastric cancer,the study group)and peficancerous tissues(from30 patients of gastric cancer,the control group).The relationship of Artemin protein with the clinicopathological features of gastric carcinoma patients was analyzed.The expression difference ofArtemin mRNAin gastric carcinoma tissues and peficancerous tissues was also analyzed.ResultsThe positive expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues was significantly higher than that in peficancerous tissues(78.89%vs10.00%,P＜0.05).The expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues was correlated with TNM stage,infiltration depth and lyrmoh node tastasis(P＜0.05),but not correlated with age,sex,tumor size or degree of differentiation(P＞0.05).The expression of Artemin mRNA in gastric carcinoma tissues was7.01 times higher than that in the peficancerous tissues, which indicates that Artemin plays a role in the development of gastric carcinoma.ConclusionThe expression of Artemin protein in gastric carcinoma significantly correlates with tumor invasion and metastasis,which could be used as one of the indicators for the clinical evaluation of gastric cancer progression and the prognosis of patients.

Gastric carcinoma;Artemin protein;Immunohistochemistry;Clinicopathological features

R735.2

A

1003—6350（2015）16—2355—04

2015-01-28)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0850

馬耀先。E-mail：mayaoxian@csco.org.cn