肖高芳，丁 宇，高雙全，杜日昌，李 靜，黃 偉，王林輝，徐 彤

(韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院病理科，廣東 韶關(guān) 512026)

肺腺癌組織中Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin的表達及意義

肖高芳，丁 宇，高雙全，杜日昌，李 靜，黃 偉，王林輝，徐 彤

(韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院病理科，廣東 韶關(guān) 512026)

目的 探討Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin蛋白在肺腺癌組織中的表達及三者之間的關(guān)系。方法采用免疫組化S-P法檢測72例肺腺癌組織中Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表達情況，并結(jié)合臨床病理資料分析Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin表達的相關(guān)性。結(jié)果(1)肺腺癌組織中Cripto-1、ZEB-l和E-cadherin的表達率分別為54.17%、58.33%、36.11%，癌旁肺組織分別為20.00%、22.50%、92.50%，三種蛋白在肺腺癌組織和癌旁肺組織中的表達差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。(2)肺腺癌組織中Cripto-l、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表達與肺腺癌腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P＜0.05)。(3)肺腺癌組織中Cripto-1的表達與ZEB-1的表達呈正相關(guān)(P＜0.05)，Cripto-1、ZEB-1的表達與E-cadherin的表達呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合檢測三者能更好地評估肺腺癌患者的預(yù)后。

肺腺癌；Cripto-1；ZEB-1；E-cadherin；免疫組織化學(xué)

肺癌是當(dāng)今世界范圍內(nèi)腫瘤死亡的首要原因，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤生成是腫瘤進展和致死的兩個最主要的決定因素。我國是世界上肺癌患者最多的國家，近年來肺癌發(fā)病率和病死率一直呈上升趨勢，為此，必須尋找更加精確、有效的分子標(biāo)志物，以期早期發(fā)現(xiàn)腫瘤，為肺癌的預(yù)后判斷以及靶向治療等提供科學(xué)資料。

人Cripto-1(CR-1)又稱畸胎癌衍生生長因子-1 (Teratocarcinoma-derived growth factor-1，TDGF-1)，它被認(rèn)為是一個癌胚基因，主要表達于胚胎早期發(fā)育階段，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化或惡變時又重新表達。研究表明CR-1過表達于人類多種惡性腫瘤(如乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌等)中，且其表達水平與腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一個多步驟的過程，指腫瘤細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞的特性，獲得運動和侵襲能力。ZEB-1(Zinc finger E-box-binding protein1)是一種鋅指結(jié)合蛋白，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ZEB-1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，并且ZEB-1參與了EMT的調(diào)節(jié)過程。本研究通過檢測肺腺癌組織中CR-1的表達情況，同時聯(lián)合檢測EMT相關(guān)因子ZEB-1和E-cadherin的表達，探討CR-1在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院2010年8月至2014年8月肺腺癌手術(shù)切除標(biāo)本72例作為觀察組，其中男性40例，女性32例，年齡38～78歲，中位年齡55歲；其中高～中分化44例，低分化28例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期27例；組織學(xué)分型：腺泡型20例，實體型18例，乳頭型25例，其他9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例。隨機選擇40例癌旁肺組織作為對照組。所有患者術(shù)前均未接受放化療和免疫治療等治療，且臨床資料齊全。

1.2 主要試劑 濃縮型兔抗人單克隆抗體CR-1、ZEB-1購自Santa Cruz公司，即用型兔抗人單克隆抗體E-cadherin、免疫組化S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 方法 所有標(biāo)本均用10%中性緩沖福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋，切片機4 μm連續(xù)切片，分別用于免疫組化及常規(guī)HE染色。應(yīng)用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P法)檢測肺腺癌組織中CR-1、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表達水平。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn)：(1) CR-1蛋白：定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，判定時需綜合考慮陽性細(xì)胞染色強度和比例。陽性強度：無著色0分,淺著色1分，中等著色2分，強著色3分。陽性細(xì)胞所占比例分為：＜l%0分，1%～3%1分，3%～67%2分，＞67%3分，陽性強度和陽性細(xì)胞所占比例得分相加為最后得分：0分為陰性，l～2分為(+)，3～4 (++)，5～9分為(+++)；(2)ZEB-1陽性結(jié)果判定：定位于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，彌漫染色，按著色度計分：無著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕褐色3分；≥1分計為陽性，＜1分計為陰性。(3)E-cadherin：定位于腫瘤細(xì)胞膜，無著色0分，1%～25%l分，26%～75%2分，＞75%3分；0～1分為陰性，2～3分為陽性。免疫組化結(jié)果判讀采用雙盲法，由三位病理醫(yī)生獨立觀察后取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，免疫組化結(jié)果和臨床病理資料之間采用χ2檢驗，應(yīng)用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析CR-1、ZEB-1和E-cadherin表達的相關(guān)性，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色檢測 CR-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌及正常肺組織中的表達 肺腺癌組織中CR-l主要在細(xì)胞質(zhì)表達(圖1A)，腫瘤組織CR-1陽性率(54.17%)高于癌旁肺組織(20.0%)，ZEB-l主要在腫瘤細(xì)胞核表達(圖1B)，腫瘤組織ZEB-1陽性率(58.33%)高于癌旁肺組織(22.5%)，E-cadherin主要在細(xì)胞膜表達(圖1C)，腫瘤組織E-cadherin陽性率(36.11%)低于癌旁肺組織(92.5%)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

圖1 肺腺癌組織中CR-1、ZEB-1和E-cadherin的表達

表1 CR-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌及正常肺組織中的表達[例（%）]

2.2 CR-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌中的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 肺腺癌組織中CR-l、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表達與肺腺癌腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，肺腺癌組織中三者的表達與患者性別、年齡和腫瘤組織學(xué)類型無關(guān)(P＞0.05)，見表2。

表2 CR-1的表達及其與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 肺腺癌中CR-1、ZEB-1和E-cadherin的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織中CR-1的表達與ZEB-1呈正相關(guān)(r=0.279，P＜0.05)，CR-1的表達與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)(r=-0.237，P＜0.05)，ZEB-1的表達與E-cadherin亦呈負(fù)相關(guān)(r=-0.244，P＜0.05)，見表3。

表3 肺腺癌中CR-1與ZEB-1、E-cadherin的相關(guān)性分析(例)

3 討論

CR-1蛋白最開始是從人類胚胎癌細(xì)胞中分離提取出來，因其含有修飾的EGF樣結(jié)構(gòu)域被歸類于EGF相關(guān)肽家族中，它是一種由糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的膜蛋白質(zhì)，是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β蛋白亞家族成員Nodal、GDF-1和GDF-3配體的共同受體，在早期胚胎發(fā)育和細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)CR-1在腫瘤生長過程中通過影響細(xì)胞的增殖、存活、腫瘤細(xì)胞遷移侵襲、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和血管形成等發(fā)揮致瘤基因的作用[2-7]。CR-1在早期胚胎發(fā)育時期表達，成年人體組織中CR不表達或僅有低水平表達[8-13]，然而在大多數(shù)惡性腫瘤，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌和宮頸癌等，CR-1卻異常高表達[6，13]，因此CR-1被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的一個潛在的特異性靶點。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物模型研究發(fā)現(xiàn)CR-1通過下調(diào)細(xì)胞表面粘連蛋白(E-cadherin等)、上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物(比如Vimentin、N-cadherin和Snail)的表達，即發(fā)生EMT從而促進乳腺腫瘤的發(fā)生。此外，有文獻報道CR-1能富集胚胎、黑色素瘤、前列腺和胰腺等腫瘤細(xì)胞中具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，它可能參與了EMT介導(dǎo)的已分化的腫瘤細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞重編程的過程。

ZEB-1的編碼基因位于人類10號染色體短臂，主要結(jié)構(gòu)特點是C端和N端都有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)簇和位于中間的一個同源結(jié)構(gòu)域，它是Snail超家族(包括Snail、Slug、ZEB-1、ZEB-2等)中的一員。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、骨肉瘤、胃癌中，ZEB-1作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，ZEB-1可能通過增強腫瘤細(xì)胞的遷移能力，在腫瘤細(xì)胞的EMT過程中起重要作用[14-17]。近年來研究證實，ZEB-1與其他誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子(比如Twist、Snail、Slug和SIP)一樣，通過與E-cadherin編碼基因CDH1的E-box(CACCTG)序列結(jié)合，使其轉(zhuǎn)錄下調(diào)，促進EMT的發(fā)生，從而增強腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[18]。有研究發(fā)現(xiàn)ZEB-1在子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中均異常表達，且與腫瘤的進展、腫瘤細(xì)胞分化程度低下、腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)[19-21]。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞性肝癌組織中ZEB-1陽性表達，而E-cadherin表達缺失，且與肝癌患者不良預(yù)后有關(guān)，得出的結(jié)論是ZEB-1陽性表達誘導(dǎo)EMT發(fā)生以致腫瘤組織惡性程度高[22]。

EMT在腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞耐藥性方面發(fā)揮重要作用，發(fā)生EMT的標(biāo)志是細(xì)胞表面連接蛋白E-cadherin和緊密結(jié)合蛋白Occludins和Claudins表達下調(diào)，代之以Vimentin、Fibronectin和/或N-cadherin表達上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞連接不穩(wěn)定，使細(xì)胞獲得運動特性。E-cadherin是鈣粘蛋白家族中的一個重要成員，廣泛分布于各類上皮細(xì)胞表面，具有促進上皮細(xì)胞間相互粘附，維持上皮組織完整性和上皮細(xì)胞極性的功能，其表達下調(diào)促進EMT的發(fā)生，從而導(dǎo)致腫瘤惡性進展和不良預(yù)后。

本研究結(jié)果顯示，肺腺癌組織中CR-l、ZEB-1和E-cadherin蛋白表達與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)，高～中分化腫瘤組織中CR-l和ZEB-1的表達明顯高于低分化腫瘤組織，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期CR-l和ZEB-1的表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CR-l和ZEB-1的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；高～中分化腫瘤組織中E-cadherin的表達明顯低于低分化腫瘤組織，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期E-cadherin的表達明顯低于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者E-cadherin的表達明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，表明CR-1、ZEB-1和E-cadherin可能在肺腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。此外，CR-1的表達與ZEB-1的表達呈正相關(guān)，CR-1和ZEB-1的表達與E-cadherin的表達呈負(fù)相關(guān)，提示CR-1和ZEB-1可能通過抑制E-cadherin蛋白的表達，使腫瘤細(xì)胞間的連接作用減弱，從而降低腫瘤細(xì)胞間的粘附力，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞極性，運動性增強，即腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，使腫瘤細(xì)胞更容易浸潤和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，CR-1和ZEB-1的上調(diào)同時E-cadherin的下調(diào)可能在促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮協(xié)同作用，與腫瘤的預(yù)后判斷有關(guān)。CR-1、ZEB-1和E-cadherin三者的聯(lián)合檢測將可能有利于臨床上預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后并為肺腺癌的基因治療提供新的方法和策略，但有關(guān)的作用機制還有待進一步研究。

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Expression and significance of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin in lung adenocarcinoma tissues.

XIAO Gao-fang,DING Yu,GAO Shuang-quan,DU Ri-chang,LI Jing,HUANG Wei,WANG Lin-hui,XU Tong.Department of Pathology,Yuebei People's Hospital,Shaoguan512026,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression levels of Cripto-l,ZEB-1 and E-cadherin proteins in lung adenocarcinoma tissues,and to explore the correlation between these three proteins.MethodsThe expressions of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin proteins were examined by immunohistochemistry in72 samples of lung adenocarcinoma tissues.And the correlation between Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin expression was also analyzed by clinical and pathological data.ResultsThe positive expression rate of Cripto-l,ZEB-1 and E-cadherin were54.17%,58.33%,36.11%respectively in lung adenocarcinoma tissues,and20.0%,22.5%,92.5%respectively in adjacent tissues,with statistically significant differences between two groups(P＜0.01).The expression of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin showed significant correlation with the differentiation,clinical stage and lymph node metastasis(P＜0.05). The expression of Cripto-1 showed a positive correlation with ZEB-1(P＜0.05),while the expression of Cripto-1 and ZEB-1 showed a negative correlation with E-cadherin in the lung adenocarcinoma tissues(P＜0.05).ConclusionExpressions of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin may be involved in the progression,invasion and metastasis of lung adenocarcinoma.Acombined examination of these three proteins may help evaluate the prognosis of lung adenocarcinoma.

Lung adenocarcinoma;Cripto-1;ZEB-1;E-cadherin;Immunohistochemistry

R734.2

A

1003—6350（2015）16—2351—04

2015-03-01)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0849

韶關(guān)市醫(yī)學(xué)科研基金立項(編號：Y14013)

高雙全。E-mail：gsq76@tom.com