范春光 孫立魁 劉成虎 李娜 侯麗 國家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （濟(jì)南 250101）

1.背景

熱原檢測是醫(yī)療器械生物學(xué)安全評價(jià)中的重要項(xiàng)目。醫(yī)療器械熱原反應(yīng)主要分為內(nèi)毒素介導(dǎo)的熱原反應(yīng)、材料介導(dǎo)的熱原反應(yīng)[1]以及病毒[2]、真菌及其碎片[3]介導(dǎo)的熱原反應(yīng)。其中材料介導(dǎo)的熱原反應(yīng)物主要有內(nèi)源性熱原（如IL-1、IL-6, TNFα、INF-γ）、前列腺素、誘導(dǎo)劑（如多聚核糖核苷酸、多聚生物原酸）、干擾體溫調(diào)節(jié)中樞的物質(zhì)（如LSD、可卡因、嗎啡）、氧化磷酸化解偶聯(lián)劑（如二硝基酚）、細(xì)菌外毒素（如TSST-1、SEA、Spe F）、神經(jīng)遞質(zhì)（如去甲腎上腺素）以及某些應(yīng)用情況下的金屬（如鎳鹽）[1]。常見的致熱原多為外致熱原，外致熱原進(jìn)入人體后可激活體內(nèi)產(chǎn)生致熱原細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[4]，使其產(chǎn)生IL-1[5], IL-6, TNFα[6]等內(nèi)生致熱原，內(nèi)生致熱原可通過血-腦脊液屏障直接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞使調(diào)定點(diǎn)上移，機(jī)體產(chǎn)熱增多散熱減少從而引起發(fā)熱。

目前，醫(yī)療器械熱原檢測試驗(yàn)共有兩種：鱟試劑法（細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法）和兔法。其中鱟試劑法是通過檢測醫(yī)療器械浸提液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量來反映醫(yī)療器械致熱原的情況。而兔法則是將醫(yī)療器械浸提液經(jīng)耳緣靜脈注入兔體內(nèi)后根據(jù)兔的體溫變化來反映樣品熱原情況。傳統(tǒng)的方法有其局限性，鱟試劑法的局限性有以下幾點(diǎn)：（1）如前所述，除細(xì)菌內(nèi)毒素以外還有很多種致熱原，而鱟試劑法只能檢測細(xì)菌內(nèi)毒素，所以它的檢測譜不全面。（2）它只能檢測醫(yī)療器械浸提液。（3）鱟資源有限。兔法的局限性有以下幾點(diǎn)：（1）兔與人有種屬差異，兔熱原反應(yīng)的情況不能完全等同于人的情況。（2）兔法同樣只能檢測醫(yī)療器械浸提液；（3）兔法穩(wěn)定性比較差。（4)兔法為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而體外試驗(yàn)替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也是國內(nèi)外的發(fā)展趨勢。

2009 年，歐洲藥典收錄了體外熱原檢查法，美國FDA 也接受了5 種基于人免疫細(xì)胞的注射用藥熱原體外試驗(yàn)法[7]。這一類方法將供試品與人全血或細(xì)胞系孵育，然后測定產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量來反映供試品中熱原物質(zhì)的量。研究[8]表明，人全血IL-1β 試驗(yàn)是較為理想的體外檢測法。在本實(shí)驗(yàn)中，我們驗(yàn)證了人全血IL-1β 試驗(yàn)的效果，并探討了此方法在醫(yī)療器械體外熱原檢測中應(yīng)用的可行性。

2.試驗(yàn)材料及儀器

2.1 試驗(yàn)材料

人抗凝新鮮全血（至少4 人混合），無菌無熱原生理鹽水（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號：1D13051304），人IL-1β ELISA 試劑盒（ExCell，批 號：ZKZFBZAB01）， 脂 多 糖O113（LPS O113）（LIST BIOLOGICAL，批號：4331B1），脂磷壁酸（LTA）（SIGMA，批號：022M4026V）

2.2 儀器

采血管（BD，K2EDTA，批號：2030578），采血針（BD，0.6×20mm×180mm，批號：1349187），無菌無熱原1.5mL 反應(yīng)管（AXYGEN，批號：311-08-081），15mL 反應(yīng)管（AXYGEN，批號：100525-02904），微量移液器（eppendorf，1μL-5mL），無菌無熱原槍頭（湛江博康海洋生物有限公司，250μL-1mL，批號：20120730），離心機(jī)（SIGMA，型號：1-14K），37?C 培養(yǎng)箱（memmert，型號：ICP700），250?C 烘箱（BINDER，型號：FED240），酶標(biāo)儀（Thermo，型號：Multiscan MK3）

3.試驗(yàn)方法

3.1 采血

選取4 名健康志愿者（24-29 歲，三男一女，兩周內(nèi)未服藥）采用無菌無熱原抗凝采血管靜脈采血，采血后經(jīng)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)以排除感染，等體積混合，4 小時(shí)內(nèi)使用。

3.2 加樣孵育

（1）將1mL 生理鹽水加入1.5mL EP 管，平行準(zhǔn)備數(shù)管，另取數(shù)管分別加入100μL 濃度為0、100、200、400、600、800 pg/mL（溶于生理鹽水）的LPS O113，分別標(biāo)記為R0、R1、R2、R3、R4、R5，用于制作濃度反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）取1.5mL EP 管加入1mL 生理鹽水，再加入100μL 0.5 μg/mL 的LTA 溶液；另取1.5mL EP 管加入900uL 生理鹽水，再加入100μL 0.5 μg/mL 的LTA 溶液，再加入100μL R2 (200 pg / mL)，用于計(jì)算內(nèi)毒素回收率。在加入血液之前混合物要在無菌操作臺放置至少1h。

（3）將100μL 混勻的抗凝鮮血加入到每一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)，使總體積為1200μL，蓋上各反應(yīng)管，輕輕混勻。

（4）將反應(yīng)管靜置于37?C，5%CO2 潮濕培養(yǎng)箱內(nèi)過夜（14-24 h），13000g 離心2min，取上清。

3.3 測定

按人IL-1β ELISA 試劑盒說明書操作測定各反應(yīng)管上清IL-1β 的含量。

3.4 計(jì)算

（1）根據(jù)試劑盒中IL-1β 標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度與相應(yīng)的吸光度值（OD 值）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)得到的回歸方程計(jì)算各反應(yīng)管內(nèi)IL-1β 的含量。

（2）根據(jù)不同濃度梯度的內(nèi)毒素O113 的量與相應(yīng)的IL-1β 的含量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。

（3）計(jì)算試驗(yàn)溶液的內(nèi)毒素當(dāng)量及其內(nèi)毒素回收率。根據(jù)曲線回歸方程分別計(jì)算出試驗(yàn)溶液和加內(nèi)毒素后的試驗(yàn)溶液的內(nèi)毒素含量A 和B，按照以下公式計(jì)算該試驗(yàn)條件下內(nèi)毒素的回收率?；厥章? (B-A)/ R2×100%。當(dāng)回收率在50%～200%之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下試驗(yàn)溶液不干擾試驗(yàn)系統(tǒng)。

4.結(jié)果

4.1 根據(jù)試劑盒中IL-1β 標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度（y）與相應(yīng)的吸光度值（OD 值）（x）建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線1（圖1）。線性回歸方程為：y = 82.345x2+ 166.63x – 3.4265，R = 0.999

4.2 根據(jù)以上回歸方程計(jì)算得到各反應(yīng)管內(nèi)IL-1β的含量，根據(jù)不同濃度梯度的內(nèi)毒素O113 的量（x）與相應(yīng)的IL-1β 的含量（y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線2（圖2）并得到回歸方程：y = 112.34Ln(x) - 281.12，R= 0.990，線性范圍（pg / mL）：100 – 800，檢出限：100 pg / mL。

4.3 根據(jù)曲線回歸方程得到了試驗(yàn)溶液的內(nèi)毒素當(dāng)量A 為105.8 pg / mL。加內(nèi)毒素后的試驗(yàn)溶液的內(nèi)毒素當(dāng)量B 為219.0 pg / mL?；厥章? (BA)/ R2 ×100%=56.6%?；厥章试?0%～200%之間，符合要求。

圖1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線1

5.討論

多年以來，人們一直在研究熱原體外試驗(yàn)方法，研究應(yīng)用不同實(shí)驗(yàn)材料的可行性，如新鮮人全血、凍存人全血、人單核細(xì)胞系[7]、兔血[9]等，研究檢測不同細(xì)胞因子的敏感性，如IL-1、IL-6、TNFα、INF-γ 等[8,9]。眾多研究表明，人全血IL-1β 試驗(yàn)是最為理想的體外檢測法。

在醫(yī)療器械熱原檢測中，人全血IL-1β 試驗(yàn)與傳統(tǒng)方法相比有諸多優(yōu)勢。與鱟試劑法相比，此試驗(yàn)方法有以下優(yōu)勢：（1）檢測范圍更廣，此方法不僅可以檢測內(nèi)毒素類致熱原，還將大部分非內(nèi)毒素類的致熱原如細(xì)菌外毒素、病毒、真菌及其碎片及核糖核苷酸等能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-1β 的外致熱原納入檢測范圍。在本實(shí)驗(yàn)中，LTA 為非內(nèi)毒素類的致熱原，鱟試劑法是無法檢測的。（2）在最低檢出限方面，鱟試劑法所有內(nèi)毒素的閾值是100pg/mL 或1ng/mL，人全血法為1pg/mL 至10ng/mL 不等[10]，我們此次試驗(yàn)的最低檢出限為100pg/mL，與以上研究結(jié)果相符，其最低檢出限優(yōu)于鱟試劑法。（3）能夠?qū)崿F(xiàn)定量分析。鱟試劑法是采用的定性分析，對于高于其內(nèi)毒素閾值的物質(zhì)均發(fā)生凝集反應(yīng)，無法實(shí)現(xiàn)定量分析，本法可在其線性范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)定量分析。相較于兔法，此試驗(yàn)方法優(yōu)勢如下：①采用人全血檢測，不存在種屬差異問題，更能夠準(zhǔn)確、客觀反應(yīng)致熱原在人體內(nèi)的熱原反應(yīng)情況，結(jié)果更可信。②在最低檢出限方面，LTA 濃度0.5 μg/mL 為兔法的檢出限[8]，在本次試驗(yàn)中此濃度的LTA 也能夠成功定量，但兔法結(jié)果可重復(fù)性較差，結(jié)果不夠穩(wěn)定，而新方法操作性強(qiáng)，便于通過制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)較高的穩(wěn)定性。③兔法是動(dòng)物試驗(yàn)，本方法是體外實(shí)驗(yàn)符合3R 原則。 若新方法應(yīng)用于醫(yī)療器械的熱原檢測，與傳統(tǒng)方法相比除以上優(yōu)勢以外，理論上還有一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的醫(yī)療器械的熱原檢測方法都是只能檢測醫(yī)療器械浸提液，研究表明，按照現(xiàn)有的浸提方法我們無法保證醫(yī)療器械中致熱原特別是其表面粘附的細(xì)菌碎片等殘留物有效浸提出來[11]，而且有研究發(fā)現(xiàn)，移植物表面粘附的細(xì)菌碎片釋放的內(nèi)毒素是導(dǎo)致移植失敗的重要原因[12]。而在新方法中，某些醫(yī)療器械如小型支架或易于取樣和制備的醫(yī)療器械可以直接放入反應(yīng)容器與人新鮮全血一起孵育，這樣就可以將醫(yī)療器械表面不容易浸提下來的致熱原納入檢測范圍，結(jié)果會更加客觀、準(zhǔn)確。

人全血IL-1β 試驗(yàn)在醫(yī)療器械熱原檢測中應(yīng)用之前，還要解決很多問題：新方法還需要在不同實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行比對，制定試驗(yàn)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，研究試驗(yàn)系統(tǒng)的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性，研究新方法的具體適用范圍，研究樣品制備方式，研究制定科學(xué)的判定標(biāo)準(zhǔn)等。這一系列問題都需要在接下來的工作中解決。相信在后續(xù)的工作中，新方法會不斷完善，最終能夠成熟地應(yīng)用于醫(yī)療器械的生物學(xué)安全評價(jià)系統(tǒng)中，為醫(yī)療器械的臨床使用提供更為有效的保障。

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