李國輝，周海虹，趙正曉，張玉梅，柳進(jìn)，陳少東

(廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建廈門361102)

梔子苷對(duì)非酒精性脂肪性肝病金黃地鼠脂質(zhì)代謝及炎癥損傷的影響?

李國輝，周海虹△，趙正曉，張玉梅，柳進(jìn)，陳少東

(廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建廈門361102)

目的:觀察梔子苷對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的金黃地鼠非酒精性脂肪性肝病模型脂質(zhì)代謝、肝組織病理變化及炎癥損傷的影響，并與梔子進(jìn)行比較，以明確梔子抗脂肪肝作用的效應(yīng)成分。方法:24只雄性金黃地鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、梔子組和梔子苷組。實(shí)驗(yàn)后觀察肝組織病理學(xué)變化，并檢測(cè)肝組織TG含量、血清TG、CHO含量及ALT、AST活性。結(jié)果:與模型組比較，梔子組、梔子苷組肝TG含量、血清TG、CHO含量及ALT、AST活性均顯著降低，且梔子苷對(duì)ALT、AST活性的降低作用優(yōu)于梔子。結(jié)論:梔子苷與梔子對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的地鼠脂肪肝均有顯著干預(yù)作用，且梔子苷抗炎癥損傷作用優(yōu)于梔子。

梔子;梔子苷;非酒精性脂肪性肝病;金黃地鼠

近年來，隨著人們生活方式與飲食結(jié)構(gòu)的改變，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率及檢出率逐年增加［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)NAFLD缺乏有效的治療手段［2］，而中藥及其復(fù)方的多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)藥理作用是其治療脂肪肝的優(yōu)勢(shì)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，《傷寒論》茵陳蒿湯具有顯著調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗脂質(zhì)過氧化損傷及炎癥損傷，降低游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量等藥理作用［3-4］;并運(yùn)用數(shù)學(xué)模型“均勻設(shè)計(jì)法”篩選出該方改善脂質(zhì)代謝、抗炎癥損傷的主要效應(yīng)中藥是梔子，其發(fā)揮效應(yīng)最優(yōu)劑量為1.5 g/(kg·d)(相當(dāng)于成人每日臨床用藥量10 g)［5-6］。梔子為茜草科植物梔子的成熟果實(shí)，是臨床常用中藥，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒等功效。梔子苷是從梔子中提取的主要有效成分之一，屬于環(huán)烯醚萜類化合物，具有保肝、利膽、減輕胰腺損傷、調(diào)節(jié)胃腸功能、調(diào)節(jié)血糖及鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用［7］，但對(duì)梔子苷抗NAFLD藥理效應(yīng)及機(jī)理研究的報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料誘導(dǎo)金黃地鼠NAFLD模型，觀察梔子苷對(duì)地鼠脂質(zhì)代謝、炎癥損傷及肝組織病理變化的影響，并與梔子的作用進(jìn)行比較，以期明確梔子抗脂肪肝的效應(yīng)成分。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性金黃地鼠24只，體質(zhì)量(100±10) g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0011)。于廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

梔子飲片購自同仁堂股份有限公司廈門分公司。采用傳統(tǒng)水煎提取工藝，按前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的最優(yōu)效應(yīng)劑量1.5 g/(kg·d)制備藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩d子苷購自南京澤朗生物科技有限公司(貨號(hào)SZY111009)，用時(shí)以蒸餾水配成所需濃度的混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

TG試劑盒(批號(hào)20111029)、ALT試劑盒(批號(hào)20111025)、AST試劑盒(批號(hào)20111028)、CHO試劑盒(批號(hào)20111105)均購自南京建成生物工程研究所。1-15K型微量冷凍離心機(jī)、2-16K冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)，ULT1386-3-V39超低溫冰箱(-80℃)(美國Thermo Scientific Revco公司)，M5多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.4 模型制備與分組給藥

24只金黃地鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、梔子組、梔子苷組每組各6只。除正常組給予普通飼料外，其余各組均給予高脂飼料(配方: 83.25%基礎(chǔ)飼料，10%豬油，1.5%膽固醇，0.2%脫氧膽酸鈉，5%糖，0.05%丙硫氧嘧啶，由蘇州雙獅動(dòng)物飼料有限公司提供)飼養(yǎng)6周，自由飲水。自造模第3周起，藥物組按1 ml/100 g的體積(相當(dāng)于梔子組用量為1.5 g/kg，梔子苷組用量為60mg/kg)灌胃給藥，每日1次;正常組、模型組灌服相應(yīng)量的飲用水，連續(xù)給藥4周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 樣本獲取灌胃給藥4周后稱取動(dòng)物體質(zhì)量，用10%水合氯醛按0.36 ml/100 g腹腔注射麻醉，心臟采血，離心后吸取血清，-80℃保存。取出肝臟，在同一肝葉和位置切取一塊組織作冰凍切片。另取200 mg濕肝加入乙醇-丙酮(1∶1)3 ml，勻漿3000 r/min，10 s×4次，放置4℃冰箱過夜。翌日4℃離心(3000 r/min，20 min)后，取10 ul上清液用于TG含量測(cè)定。

1.5.2 一般情況觀察造模過程中觀察各組地鼠體質(zhì)量、毛色、精神狀態(tài)、肝質(zhì)量等。①肝組織病理變化:HE染色，采用光鏡觀察;②肝組織TG含量測(cè)定:按生化試劑盒檢測(cè);③血清TG、CHO含量及ALT、AST活性檢測(cè):均按生化試劑盒檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

表1顯示，與正常組比較模型組地鼠活動(dòng)減少，毛色光澤度較差，肝質(zhì)量明顯增加(P＜0.01)，肝臟體積增大，顏色黃紅相間，表面粗糙呈顆粒狀，切面油膩，體質(zhì)量有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。梔子組和梔子苷組體質(zhì)量、肝質(zhì)量與模型組比較均有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而肝臟顏色較紅潤、表面光滑、切面油膩感較輕。

2.2 各組地鼠肝組織病理變化

圖1顯示，與正常組比較模型組肝臟存在明顯脂肪變性，變性的肝細(xì)胞腫大變圓，胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，并可見散在的點(diǎn)狀壞死灶和炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)合一般情況觀察提示造模成功。梔子組和梔子苷組肝臟脂肪變性程度及細(xì)胞腫脹明顯減輕，胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少，體積變小，炎性細(xì)胞浸潤及壞死灶減少。

圖1 各組地鼠肝組織變化比較(HE染色×200)

2.3 各組地鼠肝組織TG、血清TG、CHO含量和ALT、AST活性比較

表1顯示，與正常組比較模型組肝組織TG含量顯著增高(P＜0.01);梔子組和梔子苷組肝組織TG含量均顯著低于模型組(P＜0.01)，接近正常組。與正常組比較，模型組血清TG、CHO含量及ALT、AST活性均顯著增高(P＜0.01)。與模型組比較，梔子組和梔子苷組血清TG、CHO含量，ALT、AST活性均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，而梔子苷組降低血清ALT、AST活性與梔子組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

NAFLD是一種與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷［1］，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)尚無“脂肪肝”病名記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)學(xué)“癥積”、“痰濁”、“瘀血”、“脅痛”等范疇。目前普遍認(rèn)為，本病多因飲食失節(jié)或感受濕邪，或情志失調(diào)，或久病體虛引起肝失疏泄、脾失健運(yùn)、腎精虧損，濕邪、痰濁、瘀血等病理因素互結(jié)脅下所致［8］。在長期臨床實(shí)踐中我們認(rèn)為，痰、濕、瘀血結(jié)于脅下，日久易化熱蘊(yùn)毒，濕熱毒邪損傷肝絡(luò)與NAFLD的發(fā)生發(fā)展及演變密切相關(guān)。梔子具有清熱利濕、涼血解毒之功效，針對(duì)脂肪肝“濕”、“熱”、“毒”等病理因素而發(fā)揮治療作用。

表1 各組地鼠肝TG、血清TG、CHO含量及ALT、AST活性比較(±s)

表1 各組地鼠肝TG、血清TG、CHO含量及ALT、AST活性比較(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與梔子組比較:#P＜0.05

組別肝質(zhì)量(g)肝TG (mmol/L)血清TG (mmol/L)血清CHO (mmol/L)血清AST (U/ml)血清ALT (U/ml)正常組4.590.73±0.141.46±0.372.88±0.6123.54±1.8015.72±8.03模型組7.54＊＊1.47±0.32＊＊16.62±3.68＊＊7.27±0.41＊＊91.79±25.96＊＊101.72±22.36＊＊梔子組7.290.83±0.18△△9.87±3.76△△5.38±0.13△60.34±11.39△62.82±21.51△梔子苷組6.970.97±0.19△△8.06±3.33△△6.06±1.35△44.54±17.85△△#54.48±18.06△△#

目前，建立NAFLD模型多采用高脂飲食誘導(dǎo)大鼠的造模方法，模型周期一般為10～12周［3，5］，也有采用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型，造模時(shí)間需要8周［9］。金黃地鼠多用于高脂血癥模型研究［10］，而用其建立脂肪肝模型研究的報(bào)道尚為少見。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食誘導(dǎo)金黃地鼠NAFLD模型6周后，動(dòng)物肝質(zhì)量顯著增加，肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪變性，肝組織TG含量、血清TG、CHO含量以及ALT、AST活性均顯著高于正常組，提示造模成功，且造模周期較大鼠、小鼠造模所需時(shí)間短、取血方便、血量充足，可作為較理想的脂肪肝模型。

脂肪肝的實(shí)質(zhì)是肝臟TG的積聚。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，雖僅用藥干預(yù)4周，梔子和梔子苷組均能顯著降低模型地鼠肝TG含量和血清TG、CHO含量，結(jié)合肝濕重和肝組織病理學(xué)變化，表明梔子和梔子苷均有較強(qiáng)的抑制肝臟脂肪沉積和降低血脂水平的藥理學(xué)效應(yīng)。

脂肪肝由于FFA和TG在肝組織中儲(chǔ)積，可引起氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷，被激活的枯否細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，后者作為肝脂毒性細(xì)胞因子，可引起線粒體膜通透性改變，導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死甚至纖維化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，梔子和梔子苷均能明顯降低模型地鼠血清ALT、AST活性，表明對(duì)肝脂毒性炎癥損傷有較好的干預(yù)作用，且梔子苷抗炎癥損傷效應(yīng)優(yōu)于梔子。

綜上，梔子苷能夠明顯改善NAFLD地鼠的脂質(zhì)代謝異常及炎癥損傷，其效應(yīng)與梔子相似，且抗肝脂毒性炎癥損傷作用優(yōu)于梔子，提示梔子苷是梔子抗NAFLD的主要效應(yīng)成分。關(guān)于梔子苷抗脂肪肝作用的具體靶點(diǎn)及通路有待進(jìn)一步研究。

［1］李軍祥，陳治水，危北海.非酒精性脂肪性肝病的中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，2:155-158.

［2］Scott McNear，Stephen A.Harrison.Current status of therapy in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Therapeutic Advances in Gastroenterology，2009，2(1):29-43.

［3］梁惠卿，陳少東，張其清，等.茵陳蒿湯防治大鼠非酒精性脂肪性肝炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］.光明中醫(yī)，2009，2:212-214.

［4］陳少東，周海虹，李雪梅，等.茵陳蒿湯抗游離脂肪酸對(duì)HepG2細(xì)胞脂毒性作用的效應(yīng)中藥研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，9:1381-1384.

［5］徐維佳，范應(yīng)，陳少東，等.均勻設(shè)計(jì)法篩選茵陳蒿湯抗脂肪肝脂質(zhì)代謝異常的效應(yīng)組分［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，4:274-277.

［6］李晶，劉益華，林曼婷，等.梔子與茵陳蒿湯對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質(zhì)代謝及血清酶學(xué)影響的比較［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，6:1693-1695.

［7］劉益華，李晶，林曼婷，等.梔子有效成分梔子苷的現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.中國藥學(xué)雜志，2012，6:406-409.

［8］謝晶日，齊妍.中醫(yī)藥治療非酒精性脂肪性肝病的研究概況［J］.中醫(yī)雜志，2010，6:560-562.

［9］王俊杰，方會(huì)龍，李純偉，等.非酒精性脂肪肝模型小鼠的建立［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，24:4395-4399.

［10］郭金英，李華，謝人明.金黃地鼠高血脂模型的建立［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，1:5-7.

Effect of geniposide on the lipid metabolism and inflammatory injury of nonalcoholic fatty liver disease in the hamster

LI Guo-hui，ZHOU Hai-hong△，ZHAO Zheng-xiao，ZHANG Yu-mei，LIU Jin，CHEN Shao-dong
(TCM Department of Medical College of Xiamen University，Xiamen 361005，China)

Objective:To observe geniposide’s effect on lipid metabolism，hepatic tissue pathological change and inflammatory injury of golden hamsters with nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)，caused by high fat diet.Compare the geniposide’s effect with gardenia to make clear the effective components in Gardenia that can resist fatty liver.Methods:24 male golden hamsters were averagely divided into control group，model group，gardenia group and geniposide group.The experiment was based on building the model，and then observe hamsters’general condition and pathological change of hepatic tissue，examine the content of hepatic tissue TG，serum TG，CHO and the activity of ALT，AST.Results:In gardenia group and gardenoside group，The content of hepatic tissue TG，serum TG，CHO and the activity of ALT，AST are significantly lower than the model group.Besides，gardenoside can lower the activity of ALT，AST better than gardenia.Conclusion:Both gardenoside and gardenia have notable intervention effects on hamsters’NAFLD caused by HFD and gardenoside have better effects on resisting inflammatory injury than gardenia，which suggested that gardenoside was the primary effective component in resisting NAFLD.

Gardenia;Gardenoside;NAFLD;Effective substance;Golden hamster

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0524-02

2015-02-14

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81274155);廈門市重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(3502Z20100006)

李國輝，男，四川雅安人，醫(yī)學(xué)本科，從事中醫(yī)藥理與臨床研究。

△通訊作者:周海虹，Tel:0592-2183069，E-mail:hhzhou@ xmu.edu.cn。