李思耐，石曉璐，武乾，林謙△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京100078; 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京100700)

益氣活血藥對(duì)舒張功能不全大鼠心功能及鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的干預(yù)研究?

李思耐1，石曉璐2，武乾2，林謙1△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京100078; 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京100700)

目的:研究益氣活血藥對(duì)舒張功能不全大鼠心肌細(xì)胞心功能及鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的干預(yù)作用。方法:建立壓力負(fù)荷致舒張功能不全大鼠模型，按干預(yù)因素分為假手術(shù)組、模型組、益氣組、活血組、益氣活血組。造模后給藥8周檢測(cè)大鼠心功能，分離心肌細(xì)胞，檢測(cè)心肌細(xì)胞收縮、舒張功能及鈣瞬變、胞內(nèi)鈣濃度。結(jié)果:益氣活血組舒張?jiān)?晚期峰值血流速度(E/A)較模型組升高;各給藥組舒張50%時(shí)間(TR50)較模型組均顯著降低，其中益氣活血組效果最明顯;活血組、益氣活血組鈣瞬變衰減常數(shù)(Tau)較模型組縮短;益氣活血組舒張期鈣濃度較模型組降低。結(jié)論:益氣活血藥通過改善心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)能力，提高心肌細(xì)胞舒張功能，改善心臟舒張功能，并降低心衰心肌細(xì)胞鈣濃度，從而預(yù)防心衰室性心律失常的發(fā)生。

益氣活血藥;心室功能障礙;心肌細(xì)胞;鈣

左室舒張功能不全是高血壓病靶器官損害的表現(xiàn)之一，可先于左室肥厚發(fā)生，表現(xiàn)為二尖瓣脈沖式頻譜多普勒血流頻譜的改變，是慢性心力衰竭(心衰，Chronic Heart Failure，CHF)早期重要的病理生理環(huán)節(jié)之一［1］。中醫(yī)治療CHF具有一定的特色和優(yōu)勢(shì)，學(xué)者普遍認(rèn)為，氣虛血瘀是CHF的基本病機(jī)之一，并貫穿始終，是心衰發(fā)展惡化的重要因素［2］。目前從鈣轉(zhuǎn)運(yùn)角度治療CHF及其并發(fā)心律失常的西藥研究并不多見，盡管中醫(yī)臨床治療CHF具有一定的特色和優(yōu)勢(shì)，但中藥干預(yù)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究益氣活血藥對(duì)舒張功能不全大鼠心肌細(xì)胞收縮、舒張功能及鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的干預(yù)作用，探討益氣活血藥改善早期CHF患者預(yù)后的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用益氣活血法治療CHF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為防治CHF室性心律失常提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(210±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證編號(hào)SCXK(京)2012-0001)，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，恒溫恒濕，大鼠專用無菌飼料，專人喂養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑中藥黨參、黃芪、丹參、三七購(gòu)自北京同仁堂，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室進(jìn)行提取物制備;注射用青霉素鈉購(gòu)自華北制藥公司(批號(hào)H13020657);水合氯醛為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?無鈣臺(tái)氏液(Tyrode solution，mmol/L):NaCl 140.0、KCl 5.4、MgCl21.0、HEPEs 10.0(Merck，Germany)、D-Glucose 10.0(AMRESCO，USA)，NaOH調(diào)至PH7.4;KB液(mmol/L):KOH 80.0、KCl 40.0、KH2PO425.0、MgSO43.0、L-Glutamic 50.0、Taurine 20.0、HEPEs 10.0、EGTA 1.0(Acros Organics，Belgium)、D-Glucose 10.0，KOH調(diào)至PH7.2;消化液:0.6%膠原酶B(Collagenasetype2，Worthington)、0.6%BSA(Bovine serum slbumin，Maverick)、30 μmol/L Ca2+臺(tái)氏液;Flou-2·AM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.3 儀器可視化動(dòng)緣探測(cè)系統(tǒng)(IonOptix，USA);雙向激發(fā)熒光光電倍增成像系統(tǒng)(IonOptix，USA);電子刺激器SEN 27103(IonOptix，USA);倒置顯微鏡(Nikon，Japan);小動(dòng)物超聲心動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)(Vevo770ultrasoundsystem，VisualSonicsInc，USA);Langendorff心臟灌流系統(tǒng);冷光單孔手術(shù)燈、分析天平、電子秤、電腦、無菌手術(shù)器械、研磨器、移液器等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、益氣組、活血組、益氣活血組共5組。除假手術(shù)組行假手術(shù)外，其余各組大鼠均行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)，術(shù)后1 d開始灌胃給藥。益氣組給予中藥提取物黃芪(3 g/ kg/d)+黨參(1.5 g/kg/d)灌胃;活血組給予中藥提取物丹參(1.5 g/kg/d)+三七(1.5 g/kg/d)灌胃;益氣活血組給予中藥提取物黃芪(3 g/kg/d)+黨參(1.5 g/kg/d)+丹參(1.5 g/kg/d)+三七(1.5 g/ kg/d)灌胃;假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水灌胃;各組灌胃總量1 ml/100 g保持一致，給藥8周。

1.2.2 腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)大鼠稱重后，給予10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將大鼠仰位于鼠板固定、剪毛，皮膚無菌操作后于劍突下腹中線處切開皮膚和肌肉，切口長(zhǎng)約1.0～1.5 cm，于腎動(dòng)脈分支上方0.5 cm處分離腹主動(dòng)脈約1 cm，將8號(hào)注射器針頭平行置于腹主動(dòng)脈上，用4號(hào)手術(shù)線將腹主動(dòng)脈和注射針頭一同結(jié)扎，然后緩慢抽出針頭，使大鼠腹主動(dòng)脈直徑減少40%～50%，腹腔注射青霉素20 U，關(guān)腹并逐層縫合肌肉及皮膚，連續(xù)3 d，每天給予20 U青霉素腹腔注射預(yù)防感染，各組均常規(guī)喂養(yǎng)。假手術(shù)組分離腹主動(dòng)脈但不用絲線結(jié)扎，其余步驟同上［3］。

1.2.3 超聲心動(dòng)檢測(cè)利用Vevo 770高分辨率小動(dòng)物超聲心動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)術(shù)后8周大鼠心臟收縮、舒張功能。大鼠脫毛后用3%異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定于37℃恒溫加熱板上，持續(xù)吸入1.5%～3%異氟烷，四肢與心電圖電極相連用于檢測(cè)心率并記錄心電圖。探頭置于大鼠胸骨前，2D超聲顯示左室短軸切面，于乳頭肌水平應(yīng)用M模式記錄左心室運(yùn)動(dòng)情況，測(cè)量心率(HR)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)和左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(EF)及短軸縮短率(FS);在超聲四腔面，將取樣容積置于二尖瓣瓣口，采用PW模式測(cè)定二尖瓣舒張?jiān)缙诜逯笛魉俣菶和舒張晚期峰值血流速度A，計(jì)算E/A，并通過PW圖像測(cè)量等容舒張時(shí)間(IVRT);所有超聲數(shù)據(jù)連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期計(jì)算均值［4］。

1.2.4 心肌細(xì)胞急性分離各組大鼠術(shù)后8周超聲檢測(cè)后，腹腔注射2000單位肝素，20 min后用10%水合氯醛溶液(0.5ml/100 g)腹腔注射麻醉、開胸，迅速取出帶有一段主動(dòng)脈的心臟，修剪后迅速掛于Langendorff裝置上，保持溫度37℃，以無鈣臺(tái)氏液逆行灌流5 min，隨后用含有消化液逆行灌流約20～30 min。當(dāng)心臟松軟、顏色變淺時(shí)終止消化，取下心臟，用30 ml無鈣臺(tái)氏液灌流沖洗殘余消化液，然后在KB液中剪取左心室，用眼科剪剪碎，以吸管吹打，細(xì)胞用尼龍網(wǎng)過濾，室溫靜置5 min后棄去上清液，更換KB液1次，10 min后再次更換KB液，靜置1 h后棄去上清液，經(jīng)不同鈣離子濃度的臺(tái)氏液逐步復(fù)鈣，最后細(xì)胞保存在正常有鈣臺(tái)氏液中(1.2mmol/L Ca2+)備用。所有溶液使用前需37℃下充氧20 min［5］。

1.2.5 心肌細(xì)胞收縮、舒張功能及鈣瞬變的測(cè)定分離好的心肌細(xì)胞用Flou-2·AM(0.5 μM)在室溫下負(fù)載10 min后，將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下的細(xì)胞槽中，用含鈣臺(tái)氏液(1.2 mmol/L Ca2+)灌流細(xì)胞，并給予細(xì)胞不同頻率(0.5 Hz、1.0 Hz、2.0 Hz)的場(chǎng)刺激(5 V，4 ms)，使用可視化動(dòng)緣探測(cè)系統(tǒng)測(cè)定心肌細(xì)胞的機(jī)械功能，使用雙向激發(fā)熒光光電倍增成像系統(tǒng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。用收縮分?jǐn)?shù)(fraction of shortening，F(xiàn)S)評(píng)價(jià)細(xì)胞收縮功能，用舒張50%時(shí)間(time-to-50%relaxtion，TR50)評(píng)價(jià)細(xì)胞舒張功能。用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光(340 nm、380 nm)照射細(xì)胞時(shí)發(fā)出的熒光密度(fura-2 fluorescence intensity，F(xiàn)FI)比值(340/380 ratio)代表心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，記錄鈣瞬變幅度(△FFI)、鈣衰減時(shí)間常數(shù)(Tau)、舒張期鈣濃度(舒張期FFI)以及收縮期鈣濃度(收縮期FFI)［5］。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，采用Prism 5.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血藥對(duì)舒張功能不全大鼠心功能的影響

表1顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后8周模型組大鼠E/A明顯下降(P＜0.05)，IVRT明顯延長(zhǎng)(P＜ 0.05)，HR、EF、FS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各給藥組及模型組間E/A比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，益氣活血組E/A升高(P＜0.05)，益氣組、活血組E/A有下降趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較，各給藥組IVRT均縮短，其中益氣活血組縮短最為明顯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.055)，各組間HR、EF、FS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，益氣活血藥聯(lián)合應(yīng)用可以改善CHF早期舒張功能不全大鼠心臟的舒張功能，而單獨(dú)使用益氣藥或活血藥無效。

表1 益氣活血藥對(duì)舒張功能不全大鼠心功能的影響

2.2 益氣活血藥對(duì)舒張功能不全大鼠心肌細(xì)胞收縮、舒張功能的干預(yù)作用

當(dāng)以不同頻率(0.5、1.0、2.0 Hz)刺激心肌細(xì)胞時(shí)，假手術(shù)組FS分別為(7.46±2.44、7.01±1.94、10.43±1.94)%，模型組FS分別為(2.31±1.39、3.24±2.16、4.16±2.73)%，模型組與假手術(shù)組比較均顯著下降(P＜0.01)(圖1A);假手術(shù)組TR50分別為(62.26±14.12、62.58±18.64、52.26± 7.61)ms，模型組TR50分別為(328.25±107.94、226.95±45.81、154.05±20.66)ms，模型組與假手術(shù)組比較均顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)(圖1B)。各給藥組FS與模型組比較有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖1C);各給藥組TR50與模型組比較明顯降低，其中以益氣活血組降低最為明顯(P＜0.01)，TR50分別為(108.53±33.31，93.73± 32.23，68.19±21.92)ms(圖1D)。結(jié)果表明，益氣活血藥聯(lián)合應(yīng)用可以縮短受損心肌細(xì)胞舒張時(shí)間，改善舒張功能，且效果較單獨(dú)應(yīng)用益氣藥或活血藥明顯。

圖1 各組心肌細(xì)胞收縮、舒張功能比較

圖2 模型組與假手術(shù)組心肌細(xì)胞鈣瞬變的比較

2.3 益氣活血藥對(duì)舒張功能不全大鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變的干預(yù)作用

在不同頻率刺激下(0.5、1.0、2.0 Hz)的模型組鈣瞬變幅度ΔFFI與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A);以0.5Hz刺激時(shí)模型組Tau(362.40± 68.33 ms)，比假手術(shù)組(206.05±64.28)ms明顯升高(P＜0.01)，其他頻率下2組Tau未見明顯差異(圖2B)。以2.0 hz刺激時(shí)模型組細(xì)胞舒張期鈣濃度(0.625±0.107，340/380 ratio)較假手術(shù)組(0.490±0.043，340/380 ratio)明顯升高(P＜0.01) (圖2C)，模型組收縮期鈣濃度(0.872±0.088，340/ 380 ratio)較假手術(shù)組(0.800±0.094，340/380 ratio)升高(P＜0.05)(圖2D);模型組細(xì)胞舒張期鈣濃度及收縮期鈣濃度隨刺激頻率的增加而升高，變化趨勢(shì)均較假手術(shù)組明顯。這一結(jié)果提示，模型組細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)能力受損，并處于鈣超載狀態(tài)。

益氣組、活血組鈣瞬變幅度ΔFFI在不同頻率刺激下較模型組均有不同程度下降，而益氣活血組ΔFFI與模型組比較未見明顯變化(圖3A);以2.0 hz刺激時(shí)，活血組(96.50±32.00 ms)、益氣活血組(103.85±23.66 ms)鈣瞬變Tau較模型組(127.47 ±43.27 ms)縮短(P＜0.05，P＜0.05)，益氣組(114.17±26.28 ms)未見差異，其他頻率刺激未見差異(圖3B);以2.0Hz刺激時(shí)，益氣活血組舒張期鈣濃度(0.546±0.066，340/380 ratio)較模型組(0.608±0.079，340/380 ratio)降低(P＜0.05)，其他給藥組未見差異(圖3C);以2.0Hz刺激時(shí)，益氣組(0.798±0.106，340/380 ratio)、活血組(0.772± 0.080，340/380 ratio)、益氣活血組(0.790±0.107，340/380 ratio)收縮期鈣濃度較模型組(0.878± 0.087，340/380 ratio)均明顯降低(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)(圖3D);各給藥組細(xì)胞舒張期鈣濃度及收縮期鈣濃度隨刺激頻率的增加而升高，但變化趨勢(shì)較模型組均明顯減小。結(jié)果表明，益氣活血藥聯(lián)合應(yīng)用可以加速舒張期鈣清除速度，同時(shí)降低舒張期和收縮期鈣離子濃度及避免鈣超載，而單獨(dú)使用益氣藥或活血藥對(duì)舒張期鈣離子濃度的影響不明顯。

圖3 益氣活血藥對(duì)心肌細(xì)胞鈣瞬變的干預(yù)作用

3 討論

本研究結(jié)果表明，壓力負(fù)荷增加能夠引起心臟舒張功能不全，心肌細(xì)胞舒、縮功能下降且處于鈣超載狀態(tài);益氣活血藥能夠改善心肌細(xì)胞舒張功能，緩解鈣超載，改善心臟的舒張功能。既往研究表明，益氣活血藥黃芪、丹參能夠調(diào)節(jié)肥大心肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變異常，從而改善心肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)，其分子學(xué)機(jī)制與RyR、SERCA、PLB等鈣轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵分子的功能或蛋白表達(dá)作用相關(guān)［6-8］。鈣離子是心肌細(xì)胞中重要的陽離子，參與興奮-收縮偶聯(lián)以及動(dòng)作電位的形成，在心肌細(xì)胞機(jī)械運(yùn)動(dòng)及電生理活動(dòng)中起關(guān)鍵作用。研究表明，CHF模型動(dòng)物心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度下降，收縮幅度減小;同時(shí)在大多數(shù)CHF模型中，心肌細(xì)胞鈣離子濃度下降速度減慢，舒張速度降低［9］。此外，由于心衰細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣回?cái)z障礙或自發(fā)鈣釋放增加，細(xì)胞內(nèi)舒張期鈣離子濃度升高，形成鈣超載，驅(qū)動(dòng)鈉/鈣交換體(Na+/Ca2+exchanger，NCX)電流增強(qiáng)，誘發(fā)延遲后除極(Delayed afterdepolarization，DAD)，這是心衰室性心律失常觸發(fā)活動(dòng)發(fā)生的機(jī)制之一［10］。綜上所述，益氣活血藥能夠通過提高心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而改善心臟舒張功能，預(yù)防室性心律失常的發(fā)生。

［1］拓西平.老年舒張性心衰的藥物治療［J］.中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2012(4):13.

［2］黃華，司曉晨.舒張性心力衰竭的中醫(yī)研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009(31):3914-3916.

［3］柏勝男.大鼠舒張性心力衰竭動(dòng)物模型的建立［J］.黑龍江醫(yī)藥，2011(6):897-898.

［4］Henry WL，DeMaria A，Gramiak R，et al.Report of the AmericanSocietyofEchocardiographyCommitteeon NomenclatureandStandardsinTwo-dimensional Echocardiography［J］.Circulation，1980，62(2):212-217.

［5］Ge W，Guo R，Ren J.AMP-dependent kinase and autophagic flux are involved in aldehyde dehydrogenase-2-induced protection against cardiac toxicity of ethanol［J］.Free Radic Biol Med，2011，51(9):1736-1748.

［6］孫婭楠，李思耐，馬淑驊，等.黃芪、丹參注射液對(duì)乳鼠肥大心肌細(xì)胞鈣瞬變的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013(5): 1356-1360.

［7］孫婭楠，農(nóng)一兵，林謙.黃芪、丹參對(duì)肥大心肌細(xì)胞SERCA2a、PLB mRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011(11):1214-1216.

［8］孫婭楠，農(nóng)一兵，林謙.黃芪及丹參對(duì)肥大心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)干預(yù)作用研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012(1):178-183.

［9］Bers DM.Altered cardiac myocyte Ca regulation in heart failure［J］.Physiology(Bethesda，Md.)，2006，21:380-387.

［10］LauritaKR，RosenbaumDS.Mechanismsandpotential therapeutic targets for ventricular arrhythmias associated with impaired cardiac calcium cycling［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，44(1):31-43.

Intervention of Yiqi Huoxue drugs on cardiac function and calcium transport in diastolic dysfunction rats

LI Si-nai1，SHI Xiao-lu2，WU Qian2，LIN Qian1△
(1．Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 2．Medical Experimental Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Object:To explore the effects of reinforcing qi and promoting blood circulation on cardiac function and calcium transport in rats with diastolic dysfunction.Methods:The rat model of diastolic dysfunction was established by pressure-overload.According to the intervention，the rats were randomly divided into 5 groups of sham-operation，control，reinforcing qi(RQ)，promoting blood circulation(PBC)，reinforcing qi and promoting blood circulation(RQ＆PBC). Cardiac function was detected after 8 weeks of intervention，then cardiomyocytes were isolated.The cardiomyocyte contractility and calcium transport was tested.Results:E/A ratio was higher in RQ＆PBC group than in control group; Compared with control group，50%time of relaxtion was reduced in RQ group，PBC group and RQ＆PBC group，among which the effect of RQ＆PBC group was the most significant;Tau were lower in PBC group and RQ＆PBC group than in control group;Compared with control group，the diastolic calcium concentration of RQ＆PBC group was reduced. Conclusion:The treatment of reinforcing qi and promoting blood circulation improved the ability of calcium transport and relaxtion in cardiomyocytes，leading to increased cardiac diastolic function and reduced cardiomyocyte calcium concentration，thus protected heart against ventricular arrhythmia.

Reinforcing qi and promoting blood circulation;Ventricular dysfunction;Cardiomyocyte;Calcium

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0520-04

2015-03-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目-基于心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)研究益氣活血藥對(duì)舒張性心功能不全的干預(yù)機(jī)制(81373779);北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目-益氣活血化瘀法對(duì)慢性心衰心肌細(xì)胞鈣相關(guān)電生理重構(gòu)干預(yù)作用研究(7122092)

李思耐，男，北京人，在讀博士，從事中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病的臨床與研究。

△通訊作者:林謙，女，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合防治心血管病的臨床及基礎(chǔ)研究。