楊尚嬌，倪亞雯，倪永清*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

細(xì)菌素是不同于抗生素的一種抑菌物質(zhì)，其是一類在細(xì)菌代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽[1]。乳酸菌代謝產(chǎn)生的細(xì)菌素稱為乳酸菌素[2]。細(xì)菌素一般可以廣泛抑制革蘭氏陽性（G+）腐敗菌和致病菌，有些甚至可以抑制某些革蘭氏陰性菌（G-）、真菌和病毒的生長，同時(shí)，細(xì)菌素對(duì)產(chǎn)生菌自身有免疫性[3]。細(xì)菌素被稱為“生物食品保鮮劑”，其優(yōu)勢(shì)在于無毒、無抗藥性、無副作用、無殘留，能夠取代化學(xué)防腐劑和抗生素在食品生產(chǎn)過程中的使用，在食品保鮮領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值[4]。如今，在食品工業(yè)中應(yīng)用多種乳酸菌素抑制食物腐敗菌和病原微生物的生長。文獻(xiàn)報(bào)道的乳酸菌素主要是乳球菌屬的雙球菌素（Diplococcin）、乳酸鏈球菌素（Nisin）、乳球菌素（Lactococcin）、片球菌素（Pediocin）、肉食桿菌素（Camobacteriocin）、乳桿菌素（Lactocin）、明串珠菌素（Leuconostocin）、植物乳桿菌素（Plantaricin）、腸球菌素（Enterocin）等[5]。本研究從新疆多地采取牧民自制干酪樣品中分離乳酸菌，用牛津杯法篩選出1株對(duì)革蘭氏陽性菌葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、李斯特氏菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌均具有明顯抑制作用的乳酸菌，經(jīng)排除酸、過氧化氫干擾，胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，仍然具有較好的抑菌活性。研究其生物學(xué)特性和抑菌譜，表明此菌株具有較為廣泛的應(yīng)用價(jià)值，為開發(fā)安全的食品生物保鮮乳酸菌及其生產(chǎn)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

從新疆伊寧、鞏留、可可托海、昭蘇、那拉提、新源等地隨機(jī)采取牧民自制奶制品樣品。

1.1.2 菌種及試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）：實(shí)驗(yàn)室保存。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC21600：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

試驗(yàn)所用試劑均購自天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠。胰蛋白酶（活性＞250U/mg），胃蛋白酶（活性：3.0～3.5NFU/mg）。

1.1.3 培養(yǎng)基

①LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。②改良MRS培養(yǎng)基[6]：蛋白陳10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.588 g，MnSO4·H2O 0.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。③分離培養(yǎng)基：Elliker瓊脂培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、膽汁七葉靈苷疊氮鈉培養(yǎng)基和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf儀器公司；LAC-5040S全自動(dòng)高壓滅菌鍋：韓國LabTech公司；PHS-3C標(biāo)準(zhǔn)pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TC-512PCR擴(kuò)增儀：美國Techne公司；PowerPac Universal水平電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng)：美國BioRad公司；CX21光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；SW-CJ超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HH-42恒溫水浴鍋：常州國華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌分離

1 g干酪放入裝有100 mL無菌水的三角瓶中→37 ℃搖床振蕩40 min→菌懸液

吸取菌懸液，采用梯度稀釋法涂布于分離培養(yǎng)基上。37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d，根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小、凸凹等表型差異進(jìn)行初步分離篩選并純化，所得純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到MRS固體培養(yǎng)基上，4 ℃保藏備用。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備

將菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于30 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，離心（10 000 r/min、10 min、4 ℃）獲得上清液，并用0.22 μm微孔濾膜過濾得到無細(xì)胞發(fā)酵上清液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 指示菌菌懸液的制備

分別挑取已活化的四種指示菌接種于5 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)其濃度，用無菌生理鹽水稀釋成107CFU/mL菌懸液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 牛津杯法初篩具有抑菌活性的乳酸菌

將100 μL指示菌菌懸液均勻涂布在LB培養(yǎng)基上，在每個(gè)平皿中等距離放置4個(gè)牛津杯，其中3個(gè)牛津杯中加入200 μL乳酸菌上清液，其余加入等量的MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照，標(biāo)注菌株號(hào)，于37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察抑菌圈。

1.3.5 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌復(fù)篩

按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行排除有機(jī)酸、過氧化氫試驗(yàn)及蛋白酶敏感性試驗(yàn)[7-8]。

1.3.6 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

菌株的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、革蘭氏染色、生理生化試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行。尿素法提取菌株DNA，PCR擴(kuò)增并測(cè)序，將所測(cè)得的16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，用BLAST進(jìn)行相關(guān)序列的比對(duì)。

1.3.7 菌株KKTHD13生物學(xué)性質(zhì)的研究

（1）熱穩(wěn)定性

將KKTHD13發(fā)酵上清液在30 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃水浴鍋中分別放置培養(yǎng)20 min以及冰浴處理20 min，將未處理發(fā)酵上清液作陽性對(duì)照，分別測(cè)定抑菌活性。

（2）pH穩(wěn)定性

將KKTHD13發(fā)酵上清液用1 mol/L HCl或者1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值2～12，室溫培養(yǎng)2 h，再將pH值調(diào)至6.0，測(cè)試其抑菌性。

（3）表面活性劑處理

選擇十二烷基硫酸鈉（sodium do decyl sulfate，SDS）、Tween 80、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、Triton X-100和尿素（urea）五種表面活性劑，以1 mg/100 mL添加到待測(cè)乳酸菌發(fā)酵上清液中，置于37 ℃處理5 h。以不添加表面活性劑空白培養(yǎng)基作為陽性對(duì)照，檢測(cè)其殘余抑菌活性，每個(gè)處理做三個(gè)平行試驗(yàn)，取其平均值。

（4）蛋白酶敏感性

為進(jìn)一步檢測(cè)KKTHD13發(fā)酵上清液對(duì)蛋白酶的敏感性，選取胰蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行處理。先將發(fā)酵上清液的pH值調(diào)節(jié)至各種酶反應(yīng)的最適pH值，再向發(fā)酵上清液中添加各種酶，置于37 ℃培養(yǎng)2 h，再置于沸水浴中滅酶處理5 min。以未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液中作為陽性對(duì)照，檢測(cè)其抑菌活性，每個(gè)處理做三個(gè)平行試驗(yàn)，取其平均值。

1.3.8 抑菌譜

選定一些常見革蘭氏陽性（G+）和革蘭氏陰性（G-）的致病菌和腐敗菌作為指示菌，測(cè)定細(xì)菌素的抑菌譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選結(jié)果

以大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、李斯特菌（Listeria monocytogenes）及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為指示菌，從分離純化得到的34株乳酸菌中篩選出8株具有抑菌活性的菌株，采用牛津杯法初篩具有抑菌活性的乳酸菌，結(jié)果見表1。

表1 抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of bacteriostatic test mm

由表1可知，通過酸干擾排除和過氧化氫排除試驗(yàn)，8株菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑都有不同程度的縮小，表明這些乳酸菌所產(chǎn)生的酸和過氧化氫在一定條件下對(duì)指示菌具有抑制作用，但是排除酸和過氧化氫作用后抑菌活性仍然存在，證明其抑菌活性并非全部由酸和過氧化氫引起，很有可能是細(xì)菌素作用產(chǎn)生的。

鑒于細(xì)菌素的蛋白性質(zhì)，通過酶解試驗(yàn)來確定乳酸菌對(duì)指示菌起抑制作用的物質(zhì)是否為細(xì)菌素。表1中酶解試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，抑菌圈幾乎消失，菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性明顯下降，可見抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶較敏感，說明抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，可初步確定抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。

在本研究中，經(jīng)過牛津杯法初篩、酸干擾排除試驗(yàn)和過氧化氫排除試驗(yàn)，由表1數(shù)據(jù)可知，菌株KKTHD13抑菌效果最穩(wěn)定，抑菌活性最好，以下試驗(yàn)均以菌株KKTHD13作為目標(biāo)菌株。

2.2 產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌的鑒定

KKTHD13菌株的形態(tài)學(xué)試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知，該菌株G+，細(xì)胞呈球狀，成對(duì)或短鏈狀排列，無鞭毛、無芽孢、無莢膜。菌落直徑約1 mm、乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑。

圖1 KKTHD13菌株形態(tài)及革蘭氏染色Fig.1 Colony characteristic and cell morphology of strain KKTHD13

根據(jù)東秀珠、蔡妙英《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》所進(jìn)行的生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株接觸酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)及精氨酸試驗(yàn)均呈陰性，且V-P試驗(yàn)陽性；耐鹽性試驗(yàn)表明，菌株生長NaCl含量范圍在0～6%左右，鹽含量＞6%時(shí)即停止生長；除了木糖不能利用，其他試驗(yàn)13種糖及醇都能利用。

綜合以上菌株的特性，對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第九版）》[9]、《乳酸菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》[10]及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11]，初步將KKTHD13菌株鑒定為腸球菌屬（Enterococcussp.）。

表2 菌株KKTHD13生理生化試驗(yàn)Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain KKTHD13

進(jìn)一步對(duì)菌株KKTHD13的16S rRNA基因序列同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株KKTHD13隸屬于腸球菌屬（Enterococcussp.），與已知種屎腸球菌（Enterococcus faecium）系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，序列同源性達(dá)到99%，同時(shí)與腸球菌其他幾個(gè)種的親緣關(guān)系也較近，其中與蒙氏腸球菌（Enterococcus mundti）的16S rRNA基因序列同源性達(dá)到98%，與鳥腸球菌（Enterococcus avium）、蒼黃腸球菌（Enterococcus gilvus）、耐久腸球菌（Ente rococcus durans）、鉛黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）等的同源性也在95%以上，因此依據(jù)微生物種鑒定的通用標(biāo)準(zhǔn)[15]，在種水平上不能明確該菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，初步確定該菌為腸球菌屬（Enterococcussp.）。

圖2 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建KKTHD13系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain KKTHD13 based on 16S rRNA gene partial sequences

2.3 菌株KKTHD13生物學(xué)性質(zhì)的研究

菌株KKTHD13生物學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果見表3。

表3 熱、p H、酶、表面活性劑對(duì)KKTHD13細(xì)菌素活性的影響及抑菌譜Table 3 Effect of temperature,p H,enzyme and surfactant on the antibacterial activity of bacteriocin KKTHD13 and its antimicrobial spectrum

由表3可知，隨著處理溫度的升高，細(xì)菌素的抑菌活性逐漸降低，但變化不明顯，在121 ℃處理20 min后，基本失去抑菌活性，說明KKTHD13菌株所產(chǎn)生的細(xì)菌素具有一定的熱穩(wěn)定性。

由表3可知，在pH 4.0～6.0的微酸條件下，KKTHD13細(xì)菌素的抑菌圈直徑最大，表明具有最強(qiáng)的抑菌活性，相反在pH 3.0時(shí)抑菌活性反而下降，pH 2.0時(shí)抑菌活性甚至消失，排除酸對(duì)細(xì)菌素的抑菌活性影響。KKTHD13細(xì)菌素的抑菌活性在相對(duì)較寬的pH范圍（pH 3.0～9.0）內(nèi)都很穩(wěn)定。酶及表面活性劑試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后的發(fā)酵上清液完全喪失抑菌活性，說明菌株的發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶比較敏感。菌株KKTHD13產(chǎn)生的細(xì)菌素在1 mg/100 mL的SDS、EDTA、Triton X-100、Tween-80存在條件下抑菌活性仍然保持穩(wěn)定，在尿素（urea）處理后抑菌活性消失。本研究試驗(yàn)結(jié)果與植物乳桿菌素C19[12]、片球菌素ST18[13]的研究結(jié)果基本一致。

2.4 菌株KKTH13 細(xì)菌素的抑菌譜

利用菌株KKTHD13 產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)枯草芽孢桿菌、李斯特氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及部分真菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[14]。結(jié)果（表3）可知，菌株KKTHD13細(xì)菌素不僅對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等革蘭氏陰性菌也有較強(qiáng)的抑制作用，而且對(duì)部分真菌也有抑制作用，說明該菌株所產(chǎn)細(xì)菌素具有較廣泛的抑菌譜。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵干酪中利用牛津杯法篩選得到一株對(duì)革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌有較好抑制作用的乳酸菌KKTHD13，鑒定為糞腸球菌屬（Enterococcussp.）。菌株KKTHD13對(duì)指示菌沒有抑制作用，其發(fā)酵上清液具有較好的抑菌性，說明具有抑菌作用的物質(zhì)存在于乳酸菌KKTHD13的代謝產(chǎn)物中。排除了酸、過氧化氫的干擾后，KKTHD13的發(fā)酵上清液仍然具有較強(qiáng)的抑菌作用，說明其代謝產(chǎn)物中還有其他的抑菌物質(zhì)。該抑菌物質(zhì)在酸性條件下穩(wěn)定，對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶敏感，根據(jù)細(xì)菌素的定義可知，KKTHD13所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素類物質(zhì)。KKTHD13的發(fā)酵上清液具有較好的熱穩(wěn)定性。經(jīng)過1 mg/100 mL 的SDS、EDTA、Triton X-100、Tween-80處理下抑菌活性仍然保持穩(wěn)定，預(yù)期在食品生物保鮮中，在酸性、中性以及弱堿性環(huán)境中均具有應(yīng)用潛能。

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